馮悅恒，鄭全軍，王光利，李佳靈，劉輝

1.海南大學(xué)林學(xué)院，海南海口 570228；

2.海南省野生動(dòng)植物保護(hù)管理局，海南?？?570203；

3.海南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海南?？?570228

非洲豬瘟（African Swine fever）是由非洲豬瘟病毒（African Swine fever virus）感染家豬與各種野豬（如非洲野豬、歐洲野豬等）引起的一種急性、出血性、烈性傳染病[1]。由于野豬活動(dòng)范圍廣，流動(dòng)性強(qiáng)，感染病毒后極易散播疫病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病[2]，該病同樣也是中國(guó)重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫情。2018 年8 月，中 國(guó)國(guó)內(nèi)暴發(fā)了非洲豬瘟疫情，并且迅速蔓延至全國(guó)眾多地區(qū)。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2018～2021 年，國(guó)內(nèi)共發(fā)生194起非洲豬瘟疫情，該疫情破壞了市場(chǎng)上生豬的良性供應(yīng)，影響了城鎮(zhèn)居民的日常生活以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)步發(fā)展[3]。

海南是中國(guó)動(dòng)物基因資源最豐富的地區(qū)之一[4-5]，有全球最為瀕危的海南黑冠長(zhǎng)臂猿與坡鹿，還有水鹿、山鷓鴣、獼猴等珍貴的野生動(dòng)物資源[6]，是中國(guó)單位面積生物多樣性最為豐富的熱帶島嶼和全球35 個(gè)生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)之一[7]。自20 世紀(jì)90 年代后，頂級(jí)捕食者云豹、黑熊等鮮有發(fā)現(xiàn)其痕跡，如今野豬成為了海南省林區(qū)內(nèi)體型最大者之一，對(duì)于維持整個(gè)海南島嶼型森林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義，一旦群居性的野豬感染該病毒，擴(kuò)散速度將會(huì)非?？?，導(dǎo)致野豬大面積死亡。野豬種群的劇烈下降或局部滅絕意味著島嶼型森林生態(tài)系統(tǒng)的崩塌，將對(duì)整個(gè)熱帶雨林生態(tài)系統(tǒng)造成難以估量的重大傷害[8]，及時(shí)了解野豬種群感染非洲豬瘟情況及強(qiáng)度，對(duì)于海南熱帶雨林國(guó)家公園生態(tài)安全及生態(tài)功能的發(fā)揮至關(guān)重要。

為進(jìn)一步做好野豬非洲豬瘟監(jiān)測(cè)防控各項(xiàng)工作，及時(shí)阻斷疫情的傳播，按照國(guó)家林草局相關(guān)規(guī)定與要求，在海南熱帶雨林資源豐富，可能存在散養(yǎng)家豬與野豬重疊分布的區(qū)域進(jìn)行野豬的捕捉、取樣等工作。旨在分析非洲豬瘟病毒在區(qū)域內(nèi)的傳播風(fēng)險(xiǎn)和趨勢(shì)，以期為防疫科學(xué)決策提供依據(jù)，同時(shí)也能為海南熱帶雨林國(guó)家公園和相關(guān)林區(qū)的野豬管理工作和疾病防控提供有效建議。

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)域和獵捕方法

據(jù)顧家安等的研究[9-11]以及以往各保護(hù)區(qū)和林業(yè)局野豬資源分布情況，結(jié)合海南省非洲豬瘟疫情發(fā)生區(qū)域，選擇了家豬與野豬存在交叉接觸、野豬出沒(méi)頻繁和距疫點(diǎn)10km 左右的淺山地區(qū)為主要區(qū)域。其中黎母山、鸚哥嶺、五指山、霸王嶺、猴獼嶺等林區(qū)（及轄區(qū)內(nèi)森林類型自然保護(hù)區(qū)）為重點(diǎn)采樣區(qū)域。根據(jù)徐飛等人的研究，食物豐度、隱蔽性、坡度和坡度位置四大因素是野豬棲息地選擇的決定性因素，野豬喜歡半陰半陽(yáng)的山坡、下坡、緩坡、適度干擾以及隱蔽性強(qiáng)、食物豐富的生境類型[12-13]，選擇以上位置作為樣品采集地點(diǎn)。

野豬生性兇猛,攻擊性強(qiáng)，野豬的野外捕捉十分困難。目前常用的獵捕方法主要包括獵套法、獸夾法、圍獵驅(qū)趕法、獵槍射擊法、籠捕法等[14]。由于海南省野生動(dòng)物監(jiān)管嚴(yán)格，不允許槍打獵，此次捕捉主要采用對(duì)野外環(huán)境破壞小、非損傷小的獵夾和獵套法，所有獵捕均獲得海南省林業(yè)局行政許可。野豬的捕捉共分3 次進(jìn)行，一共布設(shè)獸夾250 余個(gè)、獵套600余個(gè)，在獵捕區(qū)域內(nèi)及周邊張貼醒目警示標(biāo)語(yǔ)，禁止人和家畜進(jìn)入采樣區(qū)。

1.2 樣品采集和運(yùn)輸

按照操作規(guī)程和相應(yīng)麻醉劑劑量，使用吹管法對(duì)捕獲野豬進(jìn)行麻醉，待野豬徹底失去行動(dòng)力后，再宰殺采集野豬組織、血液等樣品。

野豬宰殺時(shí)，使用含有EDTA 抗凝劑的采集管采集血液2ml～5ml。組織樣品包括淋巴結(jié)(頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)或腹股溝淋巴結(jié))、扁桃體、心、肺、脾、肝、腎等臟器。采取3cm 左右見(jiàn)方的小塊，每種樣品單獨(dú)存放[15]。采集的血液、組織樣品可置于放有冰袋的采樣箱中保存，長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)可冷凍于-80℃冰柜或冰箱冷凍層保存。運(yùn)輸時(shí)，保證樣品處于低溫環(huán)境。采集完樣品后對(duì)野豬尸體進(jìn)行深埋（無(wú)公害處理），并使用生石灰進(jìn)行消毒[16]。

1.3 PCR 處理

采集的血液與組織等樣品使用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的PCR 檢測(cè)方法。使用滅菌的剪刀與鑷子取野豬組織樣品約米粒大小，加入10mL PBS 或生理鹽水混合，混合后的樣品放入離心管內(nèi)，管中加入研磨珠后使用組織研磨機(jī)進(jìn)行研磨(可根據(jù)不同的樣品調(diào)節(jié)研磨時(shí)長(zhǎng))。將研磨充分的組織樣品或血液樣品進(jìn)行金屬浴60℃滅火處理30min，處理后取出使用瞬時(shí)離心機(jī)離心3 次。準(zhǔn)備30μL 處理液A加入15mL 離心管，每管分別加入已處理的樣品3μL后搖勻，室溫條件下放置5min，漩渦震蕩30 s，每管再加入30μL 處理液B (同時(shí)作為陰性與陽(yáng)性對(duì)照)，充分搖勻。取待檢樣品，陰陽(yáng)對(duì)照每孔5uL 加入到非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測(cè)試劑管中，漩渦震蕩，再次瞬時(shí)離心3 次，移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。將PCR 管放入PCR 儀，按照既定循環(huán)和溫度進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)確定目標(biāo)條帶是否出現(xiàn)判斷樣品是否感染非洲豬瘟[17]。

2 采集結(jié)果與分析

2.1 樣品采集信息

2019 年9 月到2021 年12 月，在海南省霸王嶺、鸚哥嶺、五指山、黎母山、大田、白沙縣細(xì)水鄉(xiāng)等區(qū)域共完成20 頭野豬的樣品采集（樣品采集點(diǎn)見(jiàn)圖1）。整體采樣較為順利，除一頭野豬為自然災(zāi)害臺(tái)風(fēng)致死外，其余所有個(gè)體均為活體處死后采集樣品（樣品采集現(xiàn)場(chǎng)見(jiàn)圖2），經(jīng)檢驗(yàn)，新鮮內(nèi)臟及血液樣品完全能滿足檢測(cè)要求，所有樣品儲(chǔ)藏至-80℃超低溫冰箱。

圖1 海南省野豬樣品采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling Sites of Wild Boar in Hainan Province

圖2 野豬屠宰及樣品采集Fig.2 Wild Boar Execution and Sample Collection

2.2 非洲豬瘟病毒檢測(cè)

野豬樣品于2020 年12 月13 日至2022 年1 月10 日分批次進(jìn)行核酸檢測(cè)，于2022 年1 月17 日完成全部20 只野豬樣品的核酸檢測(cè)工作。結(jié)果顯示，所有樣品的非洲豬瘟病毒核酸皆為陰性，表明20 頭野豬均未感染非洲豬瘟病毒。

部分電泳圖見(jiàn)圖3。

圖3 海南省野豬樣品PCR 部分檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Partial Results of Electrophoresis Detection of Wild Boar Samples in Hainan Province

3 討論

3.1 非洲豬瘟的傳播和預(yù)警

非洲豬瘟在中國(guó)第一次暴發(fā)是在2018 年8 月，截止到2021 年，共發(fā)生非洲豬瘟疫情194 起，暴發(fā)的地區(qū)包含遼寧省、黑龍江省、云南省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、北京市等多個(gè)?。ㄊ校18]。在此期間，多地采用宰殺與焚燒等措施來(lái)預(yù)防和阻止疫情的擴(kuò)散[19]。而對(duì)于已確診疫情的生豬，通常采用快速撲殺及高溫處理尸體的方式，以免病菌繼續(xù)傳播感染[20]。一般情況下，非洲豬瘟只在家豬中暴發(fā)嚴(yán)重，但個(gè)別地區(qū)也存在野豬感染的情況。特別是近些年來(lái)，多數(shù)養(yǎng)殖戶為適應(yīng)生態(tài)市場(chǎng)需求，將家豬散放到野外養(yǎng)殖，這種散養(yǎng)或混養(yǎng)模式極易使疫情在家豬與野豬中傳播[21]。除了避免因散養(yǎng)而導(dǎo)致的疫情傳播以外，應(yīng)該加強(qiáng)非洲豬瘟疫情防控知識(shí)的推廣與普及力度。通過(guò)定期走訪和宣傳，尤其是一些交通和經(jīng)濟(jì)比較落后，訊息傳達(dá)不及時(shí)的偏遠(yuǎn)地區(qū)?？破找咔榈挠嘘P(guān)知識(shí)內(nèi)容，指導(dǎo)養(yǎng)殖戶進(jìn)行家豬的疫苗接種以及衛(wèi)生管理等工作。

2019 年4 月，非洲豬瘟疫情在海南省萬(wàn)寧市和儋州市暴發(fā)，隨后在?？谑行阌^(qū)、澄邁縣、保亭縣和陵水縣也接連發(fā)生疫情，當(dāng)?shù)厣i依照海南省的要求采取無(wú)害化撲殺和消毒，并嚴(yán)格禁止所有生豬及其產(chǎn)品進(jìn)出封鎖區(qū)域[22]。非洲豬瘟在海南省的暴發(fā)及傳播都極為的迅速，其中部分原因來(lái)自于當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)習(xí)俗。如今，海南仍有居民保留著食用野生動(dòng)物的習(xí)慣，所以諸多地區(qū)還存在著打獵與盜獵的現(xiàn)象，也一直有人將野豬馴化后圈養(yǎng)起來(lái)，或?qū)⒓邑i大面積的散養(yǎng)在野外，導(dǎo)致家豬與野豬的活動(dòng)更加密切。比如，海南的“五腳豬”則是家豬與野豬雜交而來(lái)[23]。因此海南野豬面臨著更高的感染風(fēng)險(xiǎn)，切斷家豬與野豬之間的交流成為控制疫情在野外傳播最關(guān)鍵的一環(huán)。相關(guān)部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)宣傳和管控力度，嚴(yán)格禁止偷獵、盜獵等行為。反對(duì)家豬散養(yǎng)，提倡家豬標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模養(yǎng)殖，避免家豬與野豬混養(yǎng)的情況出現(xiàn)，并引導(dǎo)養(yǎng)殖戶改善動(dòng)物防疫條件[24]。完善畜禽養(yǎng)殖用地政策，保障規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)戶發(fā)展用地，以支持生豬企業(yè)區(qū)域化全產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展。

3.2 非洲豬瘟主動(dòng)監(jiān)測(cè)預(yù)警注意事項(xiàng)

海南省開(kāi)展野豬非洲豬瘟主動(dòng)預(yù)警難度較大，在五指山、霸王嶺、黎母山等地雖曾報(bào)告過(guò)野豬出現(xiàn)信息（內(nèi)部通信），但近些年海南未開(kāi)展過(guò)野豬種群的有效科學(xué)監(jiān)測(cè)，也未發(fā)生過(guò)大面積的野豬災(zāi)害，導(dǎo)致對(duì)野豬資源情況把握不定，這在一定程度上限制了主動(dòng)預(yù)警工作的準(zhǔn)確性。海南省嚴(yán)格禁獵，沒(méi)有專業(yè)的打獵隊(duì)，只能采用一些陷阱來(lái)抓捕野豬，使得工作效率大大降低的同時(shí)，還增加了捕捉工作的難度。陷阱布設(shè)處都設(shè)置了醒目標(biāo)語(yǔ)，但仍存在傷及人畜的事件，也可能傷害到其他野生動(dòng)物，因此存在一定的安全隱患。海南極端氣候頻發(fā)，夏季時(shí)臺(tái)風(fēng)暴雨較多，劇烈的氣候變化在一定程度上阻礙了主動(dòng)預(yù)警監(jiān)測(cè)工作。另外，盡管海南省林業(yè)局對(duì)野豬豬瘟的預(yù)警工作項(xiàng)目進(jìn)行了行政審批，但實(shí)際執(zhí)行過(guò)程中仍然存在一定的法律風(fēng)險(xiǎn)，希望國(guó)家有關(guān)部門(mén)出臺(tái)有關(guān)規(guī)定，推動(dòng)主動(dòng)預(yù)警工作合法開(kāi)展。

3.3 非洲豬瘟主動(dòng)監(jiān)測(cè)預(yù)警建議

基于2019 年以來(lái)開(kāi)展野豬非洲豬瘟主動(dòng)預(yù)警工作，該文建議相關(guān)部門(mén)定期開(kāi)展林地周邊社區(qū)居民（尤其進(jìn)入林區(qū)的護(hù)林員等）生態(tài)安全培訓(xùn)，提高人群對(duì)豬瘟防控知識(shí)的學(xué)習(xí)和掌握[25]，堅(jiān)決杜絕非洲豬瘟以任何形式進(jìn)入野豬棲息地。積極開(kāi)展野生動(dòng)物監(jiān)測(cè)，尤其是居民區(qū)周邊10 公里范圍內(nèi)的野豬種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，掌握全域可能存在野豬感染非洲豬瘟的關(guān)鍵區(qū)域，加大排查力度，加強(qiáng)管控措施[26-27]。建立固定主動(dòng)預(yù)警監(jiān)測(cè)站點(diǎn)群和信息收集網(wǎng)絡(luò)，在海南省建立30 個(gè)以上固定監(jiān)測(cè)站點(diǎn)[28]，每月定期收集野豬、蟲(chóng)媒、土壤等樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，各鄉(xiāng)鎮(zhèn)及村屯及時(shí)匯報(bào)區(qū)域內(nèi)野豬出現(xiàn)和健康信息。

4 趨勢(shì)預(yù)測(cè)

2022 年伊始，非洲豬瘟疫情繼續(xù)肆虐全球各地，匈牙利、南非、意大利、波蘭、俄羅斯、烏克蘭、泰國(guó)、塞爾維亞、保加利亞等各處均出現(xiàn)了家豬或野豬感染非洲豬瘟的情況，多地同時(shí)出現(xiàn)家豬和野豬感染致死病例。另外，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，基因I 型非洲豬瘟病毒已入侵中國(guó)田間豬群，并將導(dǎo)致慢性感染[29]。如果發(fā)現(xiàn)癥狀和非洲豬瘟感染個(gè)體相似的個(gè)體樣本缺未檢測(cè)出的情況，應(yīng)該及時(shí)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。當(dāng)然，對(duì)于有類似癥狀的野豬也不能直接斷定為感染了非洲豬瘟[30]，要采取科學(xué)的方法確認(rèn)病情，對(duì)病毒的變異進(jìn)行研究。全球各地從疫情流行趨勢(shì)來(lái)說(shuō)，2022 年非洲豬瘟防控的總體形勢(shì)“依然復(fù)雜嚴(yán)峻”。

從海南野豬主要分布區(qū)的五指山、霸王嶺、鸚哥嶺、黎母山等地區(qū)采集的20 份野豬樣品經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)后，均未發(fā)現(xiàn)感染非洲豬瘟病毒，一定程度上表明目前海南省的非洲豬瘟疫情尚未波及到野外野豬種群。未來(lái)數(shù)年海南省圈養(yǎng)家豬暴發(fā)非洲豬瘟疫情的可能性仍較大?？紤]到目前散養(yǎng)野豬已捕殺殆盡，基本切斷了非洲豬瘟由家豬向野豬傳播的渠道，海南省野豬暴發(fā)非洲豬瘟疫情的風(fēng)險(xiǎn)較低，只存在零星區(qū)域野豬小范圍感染的可能性。