苗會(huì)娟，徐艷梅，王春霞，蓋 成，高燕霞

（河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200）

復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏又名復(fù)方氧化鋅魚肝油軟膏，為皮膚科非處方藥。其是由魚肝油、呋喃西林、氧化鋅、石蠟等制成的復(fù)方脂溶性軟膏，主要用于治療急慢性皮炎、凍瘡、輕度燒傷等［1-4］。呋喃西林屬防腐消毒藥，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌等有較好抗菌作用［5］。復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)（第六冊(cè)）》［WS1-43（B）-89］，其中缺少呋喃西林含量控制項(xiàng)，給藥品質(zhì)量控制、市場監(jiān)管、醫(yī)院和患者用藥產(chǎn)生了不可預(yù)知的影響。為保證用藥安全，本研究中建立了測(cè)定呋喃西林含量的高效液相色譜（HPLC）法，并按人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）標(biāo)準(zhǔn)［6］進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏的質(zhì)量控制和監(jiān)督提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000型高效液相色譜儀，包括DAD檢測(cè)器（美國Thermo Fisher公司）；XS105型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；PB-20型pH計(jì)（德國Sartorius公司，精度為0.01 pH）；Memmert D91126型恒溫水浴振蕩器（德國Memert公司，準(zhǔn)確度為0.1℃）。

1.2 試藥

復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏（天津市金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為19030401，19030402，19030403，規(guī)格為每1 g中含呋喃西林1 mg）；呋喃西林對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為101167-201001，含量99.4%）。三乙胺、乙腈均為色譜純，冰醋酸為優(yōu)級(jí)純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Xltimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2%三乙胺溶液（冰醋酸調(diào)pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V），檢測(cè)波長：375 nm，柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL［7］。

2.2 溶液制備

取呋喃西林對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺1 mL使溶解并定容，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得呋喃西林質(zhì)量濃度約為10 μg/mL的對(duì)照品溶液。取樣品約1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加水適量，置80℃水浴中劇烈振搖15 min使溶解，冷卻至室溫，全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏處方工藝制備缺呋喃西林的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性考察：精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰，詳見圖1。可見，陰性對(duì)照無干擾，理論板數(shù)按呋喃西林峰計(jì)均大于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

圖1 高效液相色譜圖1.NitrofurazoneA．Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取呋喃西林對(duì)照品約10.60 mg，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為106.00 μg/mL的對(duì)照品貯備液，用水逐級(jí)稀釋，得呋喃西林質(zhì)量濃度分別為0.50，1.06，4.24，10.60，50.30，106.00 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.837 5X-0.756 5（r=0.998 7，n=6）。結(jié)果表明，呋喃西林質(zhì)量濃度在0.50～106.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限及檢測(cè)限考察：往陰性樣品中添加對(duì)照品溶液，作為檢測(cè)供試品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，計(jì)算信噪比（S/N），分別以S/N為3和10時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限及定量限。結(jié)果檢測(cè)限為0.1 μg/mL，定量限為0.3 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.48%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)為19030403）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，22，24 h后，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.21%（n=7），表明室溫下供試品溶液放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為19030403）適量，按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，再按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果平均含量的RSD為0.96%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量樣品（批號(hào)為19030403，呋喃西林含量為0.90 mg/g）6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入呋喃西林對(duì)照品溶液（106.0 μg/mL）8 mL混勻，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)分別為19030401，19030402，19030403）內(nèi)容物，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果3批樣品中呋喃西林含量分別為86.34，89.62，84.67 mg/g，平均86.88 mg/g。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行了全波長掃描，結(jié)果最大波長為375 nm，峰純度大于99%。取供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，考察不同色譜柱［Agilent ZORABAX C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及Welch Xltimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］，以不同液相色譜儀（日本Shimadzu LC-20A型、美國Agilent 1260型及美國Thermo Fisher U3000型）測(cè)定，結(jié)果均能滿足系統(tǒng)適用性要求。流動(dòng)相先后考察了乙腈-30 mmoL/L磷酸氫二鈉溶液（含0.1%三乙胺，50%磷酸調(diào)pH為3.0）（18∶82，V/V）［8］，甲醇-水（60∶40，V/V）［9］、甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鈉（pH 7.0，30∶70，V/V）［10］、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫銨（pH 4.5，20∶80，V/V）［11］及0.2%三乙胺溶液（冰醋酸調(diào)pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V），發(fā)現(xiàn)加入三乙胺可減少呋喃西林色譜峰的拖尾，改善峰形，且該pH為4.0的條件下，與相鄰峰的分離度最好，且不含無機(jī)鹽，配制簡單，因此，選定0.2%三乙胺溶液（冰醋酸調(diào)pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V）作為流動(dòng)相。

復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏為多組分化學(xué)藥，基質(zhì)為無水羊毛脂和凡士林，為脂溶性基質(zhì)，因此呋喃西林的提取要綜合考慮基質(zhì)和其本身溶解性。呋喃西林在乙醇中微溶，在水中極微溶解，而無水羊毛脂和凡士林難溶于水和乙醇。根據(jù)這一差異，考察了乙醇、水作為提取的效果，結(jié)果顯示，兩者的測(cè)定結(jié)果和回收率基本一致。綜合考慮環(huán)保和經(jīng)濟(jì)性等因素，選用水作為提取溶劑，同時(shí)依據(jù)正交試驗(yàn)原理［12-15］，考察了水浴溫度、提取時(shí)間和錐形瓶體積等因素對(duì)提取結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，置100 mL錐形瓶中，80℃水浴加熱15 min的條件最佳。綜上所述，本研究中建立的方法分離效果和重復(fù)性均良好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，回收率高，可用于復(fù)方魚肝油氧化鋅軟膏中呋喃西林的含量測(cè)定。