張新雨 李勝利

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

青藏高原素有“世界屋脊”“地球第三極”之稱[1]，具有紫外線輻射強(qiáng)、光照充足、大氣氧分壓低、全年氣溫偏低的氣候特點(diǎn)[2]。大氣氧分壓隨海拔的升高逐漸降低，當(dāng)海拔達(dá)到4 000 m時(shí)，其大氣氧分壓僅為海平面的60%左右，高寒、低氧這種獨(dú)特的氣候條件成為了高原動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育主要的限制因素，給當(dāng)?shù)貏?dòng)物的生存帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)[3-4]。為促進(jìn)藏區(qū)奶業(yè)發(fā)展，西藏自治區(qū)曾引進(jìn)荷斯坦奶牛進(jìn)行飼養(yǎng)，趙麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)，西藏自治區(qū)地處高海拔地區(qū)，荷斯坦奶牛較本地牦牛體型大、代謝旺盛、耗氧量大，高原適應(yīng)性差，高原病致死亡率高。犢牛階段的飼養(yǎng)管理關(guān)系奶牛一生的生產(chǎn)潛能，同樣也可能影響荷斯坦奶牛的高原適應(yīng)性。其中，斷奶階段對(duì)于幼年反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)尤其重要。在這個(gè)階段，犢牛的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源從牛奶轉(zhuǎn)移到固體飼料，例如補(bǔ)飼開(kāi)食料和粗飼料；同時(shí)，犢牛的瘤胃內(nèi)環(huán)境及其功能發(fā)生變化。

斷奶作為犢牛生長(zhǎng)發(fā)育最重要的過(guò)渡階段，其嚴(yán)重影響犢牛后續(xù)的消化性能、生長(zhǎng)性能乃至免疫功能[6]。在反芻動(dòng)物的幼年時(shí)期，采食的牛奶不經(jīng)過(guò)未發(fā)育的瘤胃，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在后腸道消化和吸收，不可消化的飼料在后腸道發(fā)酵[7]。研究發(fā)現(xiàn)，奶牛胃腸道菌群容易受到飼糧變化的影響，腸道微生物區(qū)系在胃腸道的發(fā)育和功能以及腸道健康中起著基礎(chǔ)作用[8]，更好地了解斷奶前后腸道微生物群落的變化對(duì)犢牛培育是至關(guān)重要的。本試驗(yàn)擬在海拔3 650 m處研究荷斯坦?fàn)倥Ｔ缙跀嗄糖昂蟮募S便菌群變化情況，旨在探究高海拔地區(qū)荷斯坦?fàn)倥嗄糖昂竽c道菌群的差異，為日后西藏地區(qū)飼養(yǎng)荷斯坦牛犢牛提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

2021年9月份在西藏自治區(qū)拉薩市高標(biāo)準(zhǔn)奶牛養(yǎng)殖中心(海拔3 650 m)，從365頭荷斯坦?fàn)倥Ｖ羞x取8頭體重相近[斷奶前采樣當(dāng)天體重(75.67±2.78) kg]、月齡相近的荷斯坦母犢牛為研究對(duì)象，采用直腸采糞法采集試驗(yàn)牛只斷奶前[(60±2)日齡]和斷奶后[(120±2)日齡]的糞便樣品，于液氮罐-196 ℃保存。

荷斯坦?fàn)倥Ｃ刻祜曃?次(08:30、14:30和19:30)，犢牛自7日齡時(shí)開(kāi)始補(bǔ)充開(kāi)食料，3月齡時(shí)采用逐漸斷奶法進(jìn)行斷奶。斷奶后，犢牛自由采食燕麥干草、苜蓿干草和開(kāi)食料。開(kāi)食料營(yíng)養(yǎng)水平如下：粗蛋白質(zhì)含量為24.08%，乙醚浸出物含量為4.50%，粗灰分含量為11.52%，鈣含量為1.42%，磷含量為0.7%。

1.2 糞便菌群的測(cè)定

1.2.1 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和16S rRNA測(cè)序

飼養(yǎng)試驗(yàn)采樣結(jié)束后將糞便樣品空運(yùn)至美吉生物有限公司進(jìn)行基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和16S rRNA測(cè)序。使用OMEGA試劑盒(Omega Bio-Tek，美國(guó))從1 g糞便樣品中提取總微生物基因組DNA。使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))確認(rèn)提取的DNA的濃度和純度。使用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物806R(3′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-5′)擴(kuò)增瘤胃細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域。PCR條件如下：95 ℃初始變性5 min，95 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，經(jīng)過(guò)28個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增的片段進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)擴(kuò)增子，使用Agencourt AMPure XP試劑盒(Beckman Coulter Genomics，美國(guó))進(jìn)行純化，然后使用QuantiFluor-ST(Promega，美國(guó))進(jìn)行定量。純化的PCR產(chǎn)物在Illumina MiSeq平臺(tái) (Illumina，美國(guó))上使用2×250 bp測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序[9]。

1.2.2 質(zhì)量控制和統(tǒng)計(jì)分析

使用QIIME 1.8[10]過(guò)濾和去除分?jǐn)?shù)≤20(低質(zhì)量)、reads<200 bp以及包含不明堿基或與引物序列不匹配的序列。其余序列通過(guò)PEAR 0.9.6[11]組合并使用Flash(版本1.20)解復(fù)用[12]。使用UCHIME算法[13]去除組合長(zhǎng)度小于230 bp和嵌合序列的讀取。為確保樣本間物種多樣性的可比性，采用標(biāo)準(zhǔn)化操作分類單位(OTU)文件對(duì)物種和多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。 然后使用置信度閾值為0.70的核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目分類器[14]基于97%的序列相似性閾值將所得序列聚類為OTU，并與SILVA 128數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較以進(jìn)行微生物物種注釋[15]。所有數(shù)值都是使用UCLUST獲得的，以生成具有代表性的OTU表[16]。使用QIIME 1.8和Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等程序確定菌群的OTU級(jí)Alpha多樣性；使用R(版本4.0.5)[17]的“ggplot2”包(Wickham，2009)可視化結(jié)果?；贐ray-Curtis相異矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA)在R中使用“vegan”包進(jìn)行Beta多樣性分析。將優(yōu)質(zhì)序列采用抽平方式生成OTU，進(jìn)行OTU聚類分析和注釋(97%相似水平)，并進(jìn)行Alpha多樣性和Beta多樣性分析；得到各水平分類信息，進(jìn)而得到西藏地區(qū)荷斯坦?fàn)倥嗄糖昂蠹S便菌群組成和結(jié)構(gòu)差異。通過(guò)Beta多樣性分析法繪制PCoA圖，分析高海拔地區(qū)犢牛斷奶前后糞便菌群物種多樣性的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌群落基本組成

經(jīng)抽平后對(duì)OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，從韋恩圖(圖1)可以直觀地得到樣本OTU數(shù)目及斷奶前后犢牛的菌群重疊情況。如圖1所示，本試驗(yàn)從16個(gè)樣品中共獲得1 070個(gè)OTU，其中斷奶前獨(dú)有125個(gè)，斷奶后獨(dú)有491個(gè)，共享463個(gè)。對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，對(duì)97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，本試驗(yàn)得到的細(xì)菌物種包括15個(gè)門，21個(gè)綱，50個(gè)目，91個(gè)科，253個(gè)屬。

圖1 斷奶前后犢牛糞便菌群韋恩圖

2.2 斷奶前后糞便菌群Alpha多樣性對(duì)比

Alpha多樣性可反映物種的豐富度和多樣性，其包括一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)：Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。本試驗(yàn)中斷奶前后犢牛糞便樣本文庫(kù)覆蓋率(coverage)均高于0.99，反映本次測(cè)序結(jié)果可以代表樣本中菌群的真實(shí)情況。由圖2可知，在高海拔地區(qū)，斷奶前犢牛和斷奶后犢牛Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)均存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 斷奶前后糞便菌群Bate多樣性對(duì)比

PCoA圖中每個(gè)樣本坐標(biāo)點(diǎn)表示其菌群多樣性，樣本和樣本之間的距離代表樣本之間的物種豐度差異。由圖3可知，斷奶前和斷奶后犢牛糞便菌群樣本距離較遠(yuǎn)，表明斷奶前后犢牛菌群Bate多樣性具有一定差異。

2.4 斷奶前后糞便菌群組成對(duì)比

2.4.1 斷奶前后糞便菌群門水平差異

根據(jù)本試驗(yàn)樣品測(cè)序結(jié)果，在門水平上，斷奶前犢牛和斷奶后犢牛均以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌(圖4-a)。如圖5-a所示，與斷奶前犢牛相比，斷奶后犢牛糞便菌群中Patescibacteria和Campilobacterota的相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)。

圖2 斷奶前后犢牛糞便菌群的Alpha多樣性指數(shù)

圖3 斷奶前后犢牛糞便菌群的PCoA圖

2.4.2 斷奶前后糞便菌群科水平差異

如圖4-b所示，在科水平上，斷奶前犢牛和斷奶后犢牛均以毛螺菌科(Lachnospiraceae)、顫螺旋菌科(Oscillospiraceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)為優(yōu)勢(shì)菌。圖5-b展示了菌群相對(duì)豐度平均值排在前15的菌科，與斷奶前犢牛相比，斷奶后犢牛糞便菌群中Oscillospiraceae、鼠桿菌科(Muribaculaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、Anaerovoracaceae、梭菌科(Clostridiaceae)、norank_o_RF39、Monoglobaceae和UCG-010的相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)，而乳桿菌科(Lactobacillaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、丁酸弧菌科(Butyricicoccaceae)和紅蝽菌科(Coriobacteriaceae)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

2.4.3 斷奶前后糞便菌群屬水平差異

如圖4-c和圖5-c所示，在屬水平上，與斷奶前犢牛相比，斷奶后犢牛糞便菌群中UCG-005、norank_f_Muribaculacea、unclassified_f_Lachnospiraceae、理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、普雷沃氏菌科UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)、Paeniclostridium、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、糞球菌屬(Coprococcus)、狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)、不動(dòng)桿菌屬(Agathobacter)、norank_f_norank_o_RF39的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，乳桿菌屬(Lactobacillus)、類桿菌屬(Bacteroides)、布勞特氏菌屬(Blautia)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)的相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)。圖6展示了斷奶前后犢牛糞便菌屬的互作關(guān)系，其中每一節(jié)點(diǎn)表示1個(gè)屬與其他屬的相關(guān)性(r>0.5或<-0.5和P<0.05)。斷奶前犢牛和斷奶后犢牛的節(jié)點(diǎn)數(shù)分別為203和219個(gè)，表明斷奶后犢牛瘤胃菌群復(fù)雜程度高于斷奶前犢牛。

3 討 論

斷奶影響犢牛的健康和生長(zhǎng)性能，越來(lái)越多研究表明早期微生物定植的重要性及其對(duì)動(dòng)物健康和終生生產(chǎn)力的影響[18]。前人研究認(rèn)為，自然斷奶過(guò)程在大約10個(gè)月大時(shí)開(kāi)始，逐漸發(fā)生數(shù)周[19-20]。相比之下，早期斷奶一般在犢牛8周齡(2月齡)時(shí)進(jìn)行[21]，以刺激對(duì)固體飼料的采食，進(jìn)一步促進(jìn)瘤胃發(fā)育[22]。目前我國(guó)大規(guī)模牧場(chǎng)普遍采用的奶牛犢牛斷奶標(biāo)準(zhǔn)是60日齡[23]，斷奶體重是出生重的2倍，開(kāi)食料的采食量達(dá)到1 kg。在西藏海拔3 650 m的地區(qū)，荷斯坦?fàn)倥３錾氐陀诘秃０蔚貐^(qū)，所以一般當(dāng)荷斯坦?fàn)倥５竭_(dá)3月齡時(shí)體重才能滿足通用的斷奶標(biāo)準(zhǔn)。早期斷奶后，犢牛采食開(kāi)食料獲取更全面的營(yíng)養(yǎng)提高日增重，降低飼養(yǎng)成本，從而進(jìn)一步降低第1次產(chǎn)犢的年齡[21]。目前為止，犢牛早期斷奶在高海拔地區(qū)的研究仍處于空白階段。本文首次運(yùn)用16S rRNA測(cè)序分析了高海拔地區(qū)斷奶前后犢牛糞便菌群的差異，為后續(xù)高海拔地區(qū)反芻動(dòng)物的研究提供理論依據(jù)不同的細(xì)菌組成可能形成不同的腸道功能，犢牛腸道微生物菌群多樣性隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，直到它成為穩(wěn)定的成體微生物區(qū)系組成為止。

糞便菌群的分析表明，由網(wǎng)絡(luò)共生圖可知高海拔地區(qū)斷奶后犢牛糞便菌群的復(fù)雜程度高于斷奶前犢牛。此外，斷奶前后犢牛糞便菌群Alpha和Bate多樣性均存在差異顯著，韋恩圖也顯示斷奶前后犢牛糞便菌群存在差異。具體來(lái)說(shuō)，本研究發(fā)現(xiàn)，在高海拔地區(qū)，相比于斷奶前，在門水平上，斷奶后犢牛糞便菌群中Patescibacteria和Campilobacterota的相對(duì)豐度顯著降低，其中Patescibacteria與腸道生物穩(wěn)態(tài)有關(guān)，主要反映腸道上皮功能障礙[24]，說(shuō)明犢牛斷奶后腸道菌群逐漸趨于成熟；在科水平上，斷奶后犢牛糞便菌群中Oscillospiraceae、Muribaculacea、Rikenellaceae、Erysipelotrichaceae、Christensenellaceae、Anaerovoracaceae、Clostridiaceae、norank_o_RF39、Monoglobaceae和UCG-010的相對(duì)豐度顯著增加，而Lactobacillaceae、Bacteroidaceae、Ruminococcaceae、Butyricicoccaceae和Coriobacteriaceae的相對(duì)豐度顯著降低，其中Oscillospiraceae[25]、Muribaculaceae[26]、Rikenellaceae 、Erysipelotrichaceae[24]、Christensenellaceae[27]、Clostridiaceae[28]、Lactobacillaceae[29]、Bacteroidaceae[30]、Ruminococcaceae[31]、Butyricicoccaceae[32]和Coriobacteriaceae的細(xì)菌與碳水化合物消化并生成短鏈脂肪酸有關(guān)。此外，有報(bào)道顯示Rikenellaceae[33]、Christensenellaceae[34]與炎癥或機(jī)體健康有關(guān)，Muribaculaceae是存在于犢牛腸道的一種有害菌，容易導(dǎo)致?tīng)倥；疾?、腹瀉等[35]。斷奶后犢牛糞便菌群中Muribaculaceae的相對(duì)豐度增加可能是犢牛處于斷奶應(yīng)激的狀態(tài)下，機(jī)體免疫低下，機(jī)體腸道菌群紊亂造成的。綜上所述，犢牛斷奶前后與碳水化合物相關(guān)的菌群相對(duì)豐度發(fā)生明顯變化，這可能是由于斷奶后荷斯坦?fàn)倥２辉贁z入牛奶，更多地采食開(kāi)食料和粗飼料造成的；此外，斷奶應(yīng)激也可能造成犢牛腸道有害菌相對(duì)豐度升高，但未引起機(jī)體表觀指標(biāo)的明顯變化。這也提示我們要加強(qiáng)斷奶過(guò)渡時(shí)期的犢牛管理工作，切實(shí)把握好高原奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中的“犢牛關(guān)”。

圖4 斷奶前后犢牛糞便菌群分布柱狀圖

圖5 斷奶前后犢牛糞便菌群組成差異

a:斷奶前 pre-weaning；b:斷奶后 post-weaning。

4 結(jié) 論

綜上可知，在本試驗(yàn)中，西藏地區(qū)(海拔3 650 m)荷斯坦?fàn)倥Ｔ?月齡進(jìn)行斷奶，斷奶前后犢牛糞便菌群多樣性及豐富度出現(xiàn)明顯變化，斷奶后犢牛腸道發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌群增多，腸道發(fā)酵能力增強(qiáng)，這主要是犢牛腸道菌群隨著飼糧改變而發(fā)生的變化。