施強強 董年 劉莉 王強 陳俊杰 陳成水

作為空氣污染物中的重要成分，細(xì)顆粒物（particulate matter,PM）的直徑?jīng)Q定了其可以隨呼吸氣流進入人體肺臟，進而廣泛沉積在氣管-肺泡表面，誘導(dǎo)呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展[1]。氣道上皮是呼吸系統(tǒng)抵御空氣污染物的首要屏障，PM通過與氣道上皮直接作用觸發(fā)細(xì)胞毒性反應(yīng)，導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞過早產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并凋亡壞死。氣道上皮細(xì)胞在氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演了始動細(xì)胞和繼發(fā)受體的雙重角色[2-3]。目前關(guān)于PM誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)的病理生理機制尚未完全闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS）以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)破壞、功能紊亂和錯誤折疊蛋白的堆積為特征，是近年來的研究熱點。氧化應(yīng)激、缺血再灌注等病理條件可能誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生ERS。適度的ERS是細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境刺激的自我保護機制，但持續(xù)的ERS可能加重炎癥反應(yīng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞過早凋亡壞死[4-5]。本研究擬探討在PM誘導(dǎo)下支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及作用機制，為揭示氣道炎癥發(fā)病機制、探尋潛在診治靶點提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料6～8周SPF級雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，許可證號為SXCK（京）2016-0011；人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B購自上海中科院細(xì)胞庫。PM購自美國NIST公司，加入PBS中配置成4 g/L母液；RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液、PBS、FBS購自美國Gibco公司；鼠抗人CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein,CHOP）抗體、兔抗人葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體78（glucose-regulated protein 78,GRP78）抗體購自美國CST公司；IL-6、IL-8及前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）ELISA檢測試劑盒購自上海博蘊公司；活性氧（reactive oxygen species,ROS）檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化丙二醛（malondialdehyde,MDA）檢測試劑盒、N-乙酰半胱氨酸（N-acety-L-cysteine,NAC）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、預(yù)染蛋白Marker和ECL發(fā)光底物購自美國Thermo公司。

1.2 動物模型的建立及實驗分組處理

1.2.1 動物分組和模型建立選取20只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成實驗組和空白組，每組10只。0、24 h時空白組氣道滴注PBS 25 μl，PM組根據(jù)動物體質(zhì)量（按4 mg/kg劑量）氣道滴注等體積PM懸混液。

1.2.2 檢測標(biāo)本的獲取和處理末次氣道滴注24 h后用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠。取每組3只小鼠，經(jīng)氣管插管灌注0.9%氯化鈉溶液，再緩慢回抽，重復(fù)3次，獲取肺泡灌洗液，用以檢測IL-6、IL-8和PGE2表達水平。另取每組3只小鼠，斷頸處死后，打開胸腔獲取新鮮肺組織，用以檢測GRP78和CHOP表達水平。取每組4只小鼠，經(jīng)氣管插管灌注多聚甲醛，觀察到小鼠雙側(cè)肺逐漸變膨隆，拉緊繩結(jié)封閉氣管，獲取肺組織進行HE染色和免疫組化分析。

1.3 BEAS-2B細(xì)胞分組和模型建立將BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2，隔天換液，胰酶消化傳代，獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進行加藥處理。細(xì)胞模型Ⅰ分為PM100組、PM200組和PM400組，分別加入由母液稀釋的100、200和400 mg/L PM，并以不加PM為空白組。4組細(xì)胞培養(yǎng)1 h后檢測ROS強度。細(xì)胞模型Ⅱ分為空白組、NAC組、PM組和PM+NAC組，NAC組和PM+NAC組加入2.5 mmol/L NAC，1 h后PM和PM+NAC組加入200 mg/L PM，空白組不加任何處理，4組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測ROS強度和GRP78/CHOP表達水平。

1.4 小鼠觀測指標(biāo)

1.4.1 組織病理分級取兩組小鼠肺組織常規(guī)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。以0～4分的主觀評分評估支氣管附近及血管附近的炎癥等級[6]：正常組織，未見炎癥細(xì)胞，為0分；偶見炎癥細(xì)胞為1分；支氣管或血管周圍不均勻分布的炎癥細(xì)胞或炎癥細(xì)胞圍繞成薄的環(huán)狀（層厚1～5個炎癥細(xì)胞），為2分；支氣管或血管周圍被炎癥細(xì)胞圍繞成厚的環(huán)狀（層厚＞5個炎癥細(xì)胞），為3分；支氣管、血管或肺泡分布彌漫聚集的炎癥細(xì)胞，為4分。

1.4.2小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8和PGE2表達的檢測采用ELISA法。收集兩組小鼠肺泡灌洗液，2 000 r/min、4℃離心20 min后獲取上清液，加注至ELISA板中。37℃孵育2 h后移去板孔中液體，添加生物素抗體，37℃繼續(xù)孵育1 h；再次移去液體，添加HRP-抗生物素蛋白，37℃孵育1 h；重復(fù)洗滌5次，顯色并終止。測定板孔液體450 nm波長下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品IL-6、IL-8和PGE2的質(zhì)量濃度。

1.4.3 小鼠肺組織中MDA表達的檢測采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA）法。MDA與TBA結(jié)合可形成紅色的MDA-TBA，在530～540 nm處有最大吸收。根據(jù)MDA檢測試劑盒方法，獲取肺組織并剪切成細(xì)小碎片，加入適量裂解液充分裂解。添加0.2 ml由TBA配置的MDA檢測工作液，100℃水浴15 min，冷卻至室溫后，測定532 nm處吸光度；采用BCA法檢測該肺組織樣品裂解液中的蛋白濃度，計算肺組織中MDA的質(zhì)量摩爾濃度。

1.4.4 小鼠肺組織中GRP78和CHOP表達的檢測采用Western blot法。收集各組小鼠肺組織，加入RIPA裂解液，于冰上研磨搗碎，14 000 r/min、4℃離心10 min后提取上清液。根據(jù)BCA蛋白濃度試劑盒測定總蛋白濃度，并將各組樣品蛋白稀釋至5 g/L，加入loading buffer后進行變性處理。變性好的蛋白樣品按照每孔6 μl的上樣量加入聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，在質(zhì)量濃度為5%的脫脂牛奶中室溫封閉2.0 h，一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜10 min，重復(fù)3次；二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST緩沖液洗膜10 min，重復(fù)3次。加入化學(xué)發(fā)光試劑，曝光顯影。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，根據(jù)灰度值計算GRP78和CHOP的相對表達量。

1.4.5 小鼠肺組織中GRP78和CHOP表達的檢測采用免疫組化法。獲取肺組織石蠟切片，常規(guī)使用二甲苯脫蠟，雙氧水處理去除內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸抗原組織抗原修復(fù)液處理切片修復(fù)抗原。常規(guī)血清封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育60 min，PBS清洗后使用二氨基聯(lián)苯胺顯色，以PBS代替一抗作為對照，中性樹脂封片后正置顯微鏡下拍片，并用Image J軟件進行分析，計算GRP78和CHOP的累計光密度值。

1.5 細(xì)胞檢測指標(biāo)

1.5.1 BEAS-2B細(xì)胞ROS水平檢測根據(jù)ROS檢測試劑盒方法進行。取細(xì)胞模型Ⅰ和Ⅱ各組細(xì)胞，與稀釋1 000倍的ROS探針2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFHDA）共培養(yǎng)20 min，使用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）進行高內(nèi)涵成像分析。DCFH-DA被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成2',7'-二氯二氫熒光素（DCFH），細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的2',7'-二氯熒光素（DCF）。使用Image J軟件檢測DCF的熒光強度，判斷細(xì)胞內(nèi)ROS水平，綠色熒光越強則細(xì)胞氧化應(yīng)激程度越高。

1.5.2 BEAS-2B細(xì)胞GRP78和CHOP表達的檢測采用Western blot法。取細(xì)胞模型Ⅱ的4組細(xì)胞，裂解液裂解后，4℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液。按照

1.4.4 方法測定并計算GRP78和CHOP的相對表達量。1.5.3 BEAS-2B細(xì)胞IL-6、IL-8和PGE2表達的檢測采用ELISA法。取細(xì)胞模型Ⅱ的4組細(xì)胞，獲取上清液后按照1.4.2方法測定并計算樣品IL-6、IL-8和PGE2的質(zhì)量濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。所有檢測均重復(fù)3次。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠支氣管病理形態(tài)改變的比較PM組小鼠支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管壁增厚，伴隨PM氣道沉積，見圖1a。相較空白組，PM組病理分級評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1b。

圖1 兩組小鼠支氣管病理形態(tài)改變的比較（a：HE染色；b：炎癥評分）

2.2 兩組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8和PGE2表達的比較相比空白組，PM組IL-6、IL-8和PGE2等炎癥介質(zhì)的質(zhì)量濃度升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖2。

圖2 兩組小鼠肺泡灌洗液IL-6、IL-8和PGE2表達的比較

2.3 兩組小鼠肺組織中MDA表達的比較相比空白組，PM組MDA質(zhì)量摩爾濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 兩組小鼠肺組織MDA表達的比較

2.4 兩組小鼠肺組織CHOP和GRP78表達的比較Western blot檢測結(jié)果可見，相比空白組，PM組肺組織CHOP和GRP78相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 兩組小鼠肺組織GRP78/CHOP蛋白表達的比較（a：蛋白電泳圖；b：GRP78相對表達量；c:CHOP相對表達量）

2.5 兩組小鼠肺組織CHOP和GRP78表達的比較免疫組化染色結(jié)果可見，相比空白組，PM組棕黃色染色范圍增加，染色程度增加，提示PM組細(xì)胞中CHOP和GRP78的表達升高，見圖5a。相比空白組，PM組肺組織CHOP和GRP78累計光密度值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5b-c。

圖5 兩組小鼠肺組織GRP78/CHOP蛋白表達的比較（a：肺組織免疫組化圖，×400；b：CHOP的累計光密度值；c：GRP78的累計光密度值）

2.6 BEAS-2B各組細(xì)胞ROS水平的比較不同質(zhì)量濃度PM作用下，BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強度以劑量依賴的方式增加，見圖6a；相比PM組，PM+NAC組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強度減少，見圖6b。與空白組相比，細(xì)胞模型Ⅰ的其他3組細(xì)胞ROS水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖6c。細(xì)胞模型Ⅱ中，與空白組相比，PM組細(xì)胞ROS水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與PM組相比，PM+NAC組細(xì)胞ROS水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6d。

圖6 4組BEAS-2B細(xì)胞ROS免疫熒光圖像及其熒光強度

2.7 4組BEAS-2B細(xì)胞GRP78和CHOP表達的比較4組BEAS-2B細(xì)胞中均有GRP78和CHOP表達（圖7a）；相比空白組，PM組GRP78和CHOP相對表達量均升高，相比PM組，PM+NAC組GRP78和CHOP相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖7b-c。

圖7 4組BEAS-2B細(xì)胞GRP78和CHOP蛋白表達的比較（a：蛋白電泳圖；b：GRP78相對表達量；c：CHOP相對表達量）

2.8 4組BEAS-2B細(xì) 胞IL-6、IL-8和PGE2表 達 的比較相比空白組，PM組IL-6、IL-8和PGE2質(zhì)量濃度均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；相比PM組，PM+NAC組IL-6、IL-8和PGE2質(zhì)量濃度均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖8。

圖8 4組BEAS-2B細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和PGE2表達的比較

3 討論

中國成人肺部健康研究揭示PM是氣道疾病獨立的危險因素[7]。支氣管上皮細(xì)胞是氣道固有結(jié)構(gòu)細(xì)胞，PM作用于支氣管上皮細(xì)胞可觸發(fā)系列細(xì)胞毒性反應(yīng)，導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬和炎癥損傷等功能狀態(tài)的改變[8-10]。已有研究表明PM可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激[11]。研究PM作用下支氣管上皮細(xì)胞的病理生理改變，可為揭示氣道疾病新的發(fā)病機制、尋找潛在的診治靶點提供參考。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器之一，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的合成、折疊和翻譯，在缺血低氧、鈣離子紊亂、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等病理狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能可發(fā)生紊亂，導(dǎo)致未折疊和錯誤折疊蛋白質(zhì)堆積，細(xì)胞在自我感知下會適應(yīng)性啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來恢復(fù)蛋白質(zhì)平衡[12]。根據(jù)誘發(fā)原因，ERS可分為3類，一是由未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)過度堆積引起的未折疊蛋白反應(yīng)（unfold protein response,UPR），二是正確折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)過度堆積引起NF-κB激活導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)，三是因膽固醇缺乏引發(fā)固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白激活而產(chǎn)生的固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)[13]。UPR不僅可以通過減少蛋白質(zhì)合成和促進錯誤折疊蛋白質(zhì)降解，還可以上調(diào)參與蛋白質(zhì)平衡調(diào)控的靶基因來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力[14]。在穩(wěn)定狀態(tài)下，UPR有助于降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而ERS過強或持續(xù)時間過久，則最終加重炎癥反應(yīng)以及激活細(xì)胞死亡程序[4,15-16]，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞的自我保護性功能調(diào)整。GRP78被認(rèn)為是ERS的主要標(biāo)志性蛋白分子，當(dāng)錯誤折疊蛋白積累時，GRP78從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力傳感器RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶[RNA-dependent protein kinase(PKR)-like ER kinase,PERK]、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6,ATF6）和肌醇需求酶1（inositol requiring enzyme 1,IRE-l）中分離出來，激活ERS的3條信號通路[17]。因此，GRP78的表達升高被認(rèn)為是ERS激活的標(biāo)志；持續(xù)ERS導(dǎo)致CHOP表達，并誘導(dǎo)與B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2,BCL-2）蛋白家族促凋亡因子相互作用的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白（BCL-2 interacting mediator of cell death,BIM）的轉(zhuǎn)錄，BIM可通過增加線粒體膜通透性從而激活線粒體凋亡機制[18]。本研究從動物實驗和細(xì)胞實驗2個層面探討了PM對ERS病理生理的誘導(dǎo)機制。PM氣道滴注的動物模型和與PM共培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞BEA-2B中，均檢測到了GRP78和CHOP表達升高，推測PM作用下支氣管上皮細(xì)胞觸發(fā)的ERS是持續(xù)性的，但升高表達的CHOP與PM誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡是否相關(guān)還未知。目前認(rèn)為細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生ERS的分子機制涉及到氧化應(yīng)激、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）等信號通路[19-20]。氧化應(yīng)激是指氧化自由基產(chǎn)生過多，打破了其與抗氧化劑之間的平衡。這種不平衡會導(dǎo)致重要的生物分子和細(xì)胞受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21-22]。最常見的2種氧化劑家族為ROS和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）[23]。ROS為一系列分子氧的衍生物，其產(chǎn)生與新陳代謝和其他酶促過程有關(guān)，大多數(shù)ROS是通過線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的，此外還依賴細(xì)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)、一氧化氮合成酶系統(tǒng)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系統(tǒng)（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases,NOXs）[24-25]。適量的ROS可以促進細(xì)胞增殖、分化，并可作為第二信使激活植物和動物細(xì)胞中的信號通路以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境條件的變化[26]。然而當(dāng)ROS產(chǎn)生量超過機體調(diào)節(jié)能力時，則會引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激窘迫，從而引發(fā)一系列細(xì)胞生理功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[27]。本研究利用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，PM刺激下支氣管上皮細(xì)胞ROS水平升高且呈現(xiàn)PM劑量依賴性。給予ROS抑制劑NAC干預(yù)后，ROS水平降低，可見NAC干預(yù)逆轉(zhuǎn)了PM誘導(dǎo)的ERS，伴隨著PM誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的分泌改變。ROS的產(chǎn)生與慢性炎癥相關(guān)，在炎癥期間，肥大細(xì)胞和白細(xì)胞被募集到損傷部位，由于氧吸收量增加導(dǎo)致“呼吸爆發(fā)”，因此損傷部位ROS的釋放和積累增加[28-29]。此外，在動脈粥樣硬化、缺氧再灌注模型中，ROS作為第二信使能夠促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，炎癥介質(zhì)產(chǎn)生增加[30]。但PM誘導(dǎo)的ERS與炎癥介質(zhì)分泌的相關(guān)性尚不清楚。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PM可以誘導(dǎo)氣道炎癥，伴隨支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生ERS；PM誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激介導(dǎo)了ERS病理生理過程。后續(xù)研究可考慮使用霧化吸入的方法，以更好地模擬真實事件中PM暴露情況。ERS涉及復(fù)雜的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，除CHOP和GRP78參與的未折疊蛋白反應(yīng)外，ERS還包括肌醇需求酶-1（inosital-requiring enzyme 1）α途徑、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6,ATF6）途徑和PERK途徑，后續(xù)可進一步研究更精細(xì)的氧化應(yīng)激蛋白和氧化應(yīng)激后信號通路的改變，從而更加全面反映ERS病理狀態(tài)。