駱 琳，蔡 杰，鄧蒙蒙，劉建新，王迪銘*

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058）

氧化應(yīng)激是乳腺炎、酸中毒、酮癥和關(guān)節(jié)病等代謝性疾病的重要致病因素。因此，準(zhǔn)確評估奶牛氧化應(yīng)激狀態(tài)在生產(chǎn)中尤為重要。由氧化應(yīng)激引起的奶牛代謝穩(wěn)態(tài)變化可通過血液、尿液、唾液和牛奶等體液中相關(guān)指標(biāo)來表征。從動(dòng)物生理和動(dòng)物福利方面考慮，分析奶牛血液循環(huán)中的相關(guān)指標(biāo)以及牛奶成分以評估奶牛健康狀況，是判斷奶牛潛在代謝疾病的簡易有效方法。因此，尋找體內(nèi)具有代表性的抗氧化劑和氧化劑作為生物標(biāo)志物來反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)尤為重要。篩選氧化應(yīng)激的合適生物標(biāo)志物應(yīng)是生化代謝過程中穩(wěn)定的產(chǎn)物且在樣品處理、加工、分析和儲存過程中不容易損失，具有標(biāo)準(zhǔn)化的定量方法并可有效反映機(jī)體氧化程度，易于獲取。本文主要闡述了全血、血漿/血清、牛奶樣品中可反映奶牛氧化應(yīng)激狀態(tài)的主要標(biāo)志物，以期為后續(xù)研究氧化應(yīng)激相關(guān)疾病提供一定參考。

1 氧化應(yīng)激的成因及其與奶牛健康的關(guān)系

在正常情況下，生物體內(nèi)的自由基總是處于不斷產(chǎn)生和不斷消除的動(dòng)態(tài)平衡中。氧化應(yīng)激是機(jī)體自由基（活性氧、活性氮）生成/消除的穩(wěn)態(tài)失衡所導(dǎo)致的機(jī)體代謝紊亂的一種現(xiàn)象，其本質(zhì)是自由基產(chǎn)生過度和內(nèi)源性/外源性抗氧化系統(tǒng)對自由基消除能力減弱的障礙。機(jī)體細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)由其復(fù)雜的內(nèi)源性/外源性抗氧化防御系統(tǒng)來保證（圖1），該系統(tǒng)包括內(nèi)源性抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶），以及外源性非酶化合物[如谷胱甘肽、蛋白質(zhì)（鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、銅藍(lán)蛋白、白蛋白）]和低分子量清除劑（如尿酸、輔酶Q）。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞抗氧化能力不足以抵消自由基的生成時(shí)，機(jī)體極易處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。因此，氧化應(yīng)激是自由基發(fā)生增加和保護(hù)性抗氧化防御系統(tǒng)活性降低的綜合結(jié)果。

圖1 生物機(jī)體活性氧代謝物的防護(hù)系統(tǒng)[5]

在實(shí)際生產(chǎn)過程中，氧化應(yīng)激與奶牛疾病發(fā)生之間存在著緊密聯(lián)系。Laliotis 等在研究圍產(chǎn)期奶牛氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物與臨床乳腺炎發(fā)病率的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，患有乳腺炎組的奶牛體內(nèi)自由基含量極顯著高于對照健康組奶牛，同時(shí)體內(nèi)抗氧化能力極顯著低于對照組。Tsuchiya 等在研究圍產(chǎn)期健康荷斯坦奶牛和產(chǎn)后患有酮病、皺胃移位奶牛氧化應(yīng)激標(biāo)志物的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，患有疾病的奶牛體內(nèi)氧化應(yīng)激水平較健康對照組顯著升高。此外，有研究表明，產(chǎn)犢前高體況評分的奶牛在產(chǎn)后體重會損失較多，血液循環(huán)中的抗氧化能力較低，自由基含量較高。綜上，當(dāng)奶牛機(jī)體自由基發(fā)生增加和保護(hù)性抗氧化防御系統(tǒng)活性降低時(shí)，會發(fā)生氧化應(yīng)激，從而更易患有乳房炎、酮病等多種代謝性疾病。

由氧化應(yīng)激引起的奶牛疾病會降低奶牛產(chǎn)奶量，增加代謝疾病發(fā)生率，并會導(dǎo)致?lián)p失難以量化的間接成本（如發(fā)情延遲、配種延遲以及重復(fù)配種）。因此，通過檢測奶牛體內(nèi)的抗氧化能力和自由基含量，來評判奶牛機(jī)體氧化應(yīng)激水平，對圍產(chǎn)期、高產(chǎn)等特定群體奶牛的健康評估具有重要意義。

2 奶牛不同體液中的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物

2.1 奶牛血清/血漿中的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物

2.1.1 活性氧代謝物 生物系統(tǒng)中最豐富的自由基是以氧為中心的自由基及其代謝產(chǎn)物，通常稱為活性氧?；钚匝踝鳛榧?xì)胞代謝的正常副產(chǎn)物連續(xù)形成。低濃度活性氧對于蛋白質(zhì)磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子激活、細(xì)胞分化、凋亡、卵母細(xì)胞成熟、類固醇生成、細(xì)胞免疫和微生物防御等生理過程必不可少。然而，當(dāng)活性氧過量產(chǎn)生時(shí)，它們會損害細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸，從而損害細(xì)胞功能?；钚匝醮x物是一個(gè)集合術(shù)語，不僅包括氧中心自由基（如超氧陰離子和羥基自由基），還包括一些氧的非自由基衍生物（如過氧化氫和次氯酸）?；钚匝醮x物試劑盒可評估血漿和其他生物液體中的氧化水平，其測試已經(jīng)使用電子自旋共振進(jìn)行了驗(yàn)證。電子自旋共振被認(rèn)為是測量總氧化狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其方法復(fù)雜且大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室缺少特定的技術(shù)支持，不適合常規(guī)分析。血漿中活性氧代謝物含量已被認(rèn)為是自由基產(chǎn)生的指示物，且活性氧代謝物試劑盒檢測已用于監(jiān)測奶牛的氧化應(yīng)激狀態(tài)。Fiore 等研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后皺胃左方變位奶牛體內(nèi)用來表征氧化能力的活性氧代謝物含量較對照組顯著升高，表明患病奶牛經(jīng)歷了氧化劑與抗氧化劑之間的不平衡。因此，可通過檢測體內(nèi)活性氧代謝物含量來預(yù)測奶牛機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

2.1.2 丙二醛和硫代巴比妥酸活性物質(zhì) 不飽和脂肪酸是對自由基損傷最敏感的底物之一，很容易受到羥基的過氧化作用。丙二醛是多不飽和脂肪酸自由基誘導(dǎo)分解過程中形成的幾種低分子量終產(chǎn)物之一，被認(rèn)為是脂質(zhì)氧化衰變的公認(rèn)標(biāo)志，也是表征機(jī)體氧化應(yīng)激的最佳指標(biāo)。Milne 等研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)丙二醛含量與其他標(biāo)記物（如F2-異前列腺素）有極顯著相關(guān)性；Tsuchiya 等也發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期奶牛的丙二醛與游離脂肪酸（FFA）和-羥丁酸等體脂動(dòng)員相關(guān)指標(biāo)也存在顯著相關(guān)性。因此，丙二醛可作為一種預(yù)測機(jī)體氧化損傷的較好指標(biāo)。值得注意的是，由于測量的丙二醛特異性低，只能在體內(nèi)檢測到一小部分，但丙二醛很容易與硫代巴比妥酸活性物質(zhì)反應(yīng)生成紅色素，這種紅色素可以通過分光光度法以硫代巴比妥酸活性物質(zhì)形式輕松測得。因此，也可通過檢測硫代巴比妥酸活性物質(zhì)含量表征機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，這種檢測方法經(jīng)濟(jì)、簡便、快捷，已經(jīng)被廣泛用于評估奶牛機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

2.1.3 F2-異前列腺素 氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度可以通過測量任何大分子損傷來確定，但脂質(zhì)過氧化程度通常被用來評估奶牛的氧化狀態(tài)。過氧化脂質(zhì)通常是由酶促反應(yīng)產(chǎn)生，但也可以通過活性氧直接氧化脂質(zhì)而非酶促形成。脂質(zhì)是對氧化損傷最敏感的大分子，由非酶生成產(chǎn)生可量化的氧化脂質(zhì)（如異前列腺素）是人類醫(yī)學(xué)中量化氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，它們可用作氧化應(yīng)激的特異性和敏感性標(biāo)記。最近，異前列腺素（一種基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的測定指標(biāo)）被認(rèn)為是最可靠的脂質(zhì)氧化標(biāo)記物，該標(biāo)志物的應(yīng)用可更好地揭示反芻動(dòng)物圍產(chǎn)期脂質(zhì)過氧化狀態(tài)。此外，Kuhn 等發(fā)現(xiàn)，泌乳奶牛血漿15-F2t-異前列腺素濃度的增加與較高的血漿氧化應(yīng)激指數(shù)相一致，進(jìn)一步表明血漿15-F2t-異前列腺素是評估奶牛不同泌乳階段氧化應(yīng)激的一種更全面有效的氧化平衡測量指標(biāo)。

2.1.4 谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶 谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御的主要形式。超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物，但是自由基的積累會使細(xì)胞膜的脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用而引起膜裂變，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。超氧化物歧化酶的主要功能是催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧，是生物體內(nèi)最重要且最佳的自由基清除劑，維持著機(jī)體的代謝平衡；谷胱甘肽過氧化物酶通過催化氫和脂質(zhì)過氧化物的還原，可直接清除自由基歧化過程中產(chǎn)生的過氧化氫，從而有助于動(dòng)物組織的氧化防御。Yu 等發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激條件下，奶牛體內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量顯著降低，且超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量與奶產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。因此，在熱應(yīng)激條件下可通過檢測超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量來評估奶牛體內(nèi)的抗氧化狀態(tài)，并可及時(shí)預(yù)防氧化應(yīng)激對奶牛造成的危害。

2.1.5 總抗氧化能力 由于很難單獨(dú)測量每種抗氧化成分及其在血漿中的相互作用，可通過檢測當(dāng)量抗氧化能力來評估機(jī)體總抗氧化能力，這種檢測結(jié)果可表征樣品中存在的所有抗氧化劑（如白蛋白、硫醇、膽紅素和超氧化物歧化酶）在機(jī)體內(nèi)的綜合作用?？偪寡趸芰Φ臏y定考慮了血漿和體液中所有抗氧化劑的累積作用，提供了一個(gè)綜合參數(shù)，而不是簡單地測量抗氧化劑的活力總和。Habiballah 等發(fā)現(xiàn)，測量反芻動(dòng)物的總抗氧化能力可能比單一參數(shù)更具有代表性。Omidi 等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)產(chǎn)奶牛體內(nèi)血漿總抗氧化能力較初產(chǎn)奶牛顯著升高，并高于泌乳早期/盛期奶牛、干奶期奶牛體內(nèi)總抗氧化能力，首次表明臨床上明顯健康的奶?？赡芫哂休^低的總抗氧化能力（尤其是初產(chǎn)奶牛），這種情況可能使奶牛對壓力、疾病或健康問題更敏感。

2.1.6 生物抗氧化潛能 生物抗氧化潛能主要是衡量外源性抗氧化劑（如尿酸、抗壞血酸、蛋白質(zhì)、-生育酚和膽紅素等）水平。在奶牛泌乳早期和泌乳中期的測定發(fā)現(xiàn)，生物抗氧化潛能可作為評估奶牛機(jī)體抗氧化能力的有效指標(biāo)。有研究表明，在日糧中添加精料可以減少牧草的攝入量并增加一些抗氧化劑在瘤胃中的降解；當(dāng)奶牛飼喂玉米青貯飼料和精料補(bǔ)充料時(shí)，生物抗氧化潛能顯著降低，表明補(bǔ)充的精料顯著降低了體內(nèi)的抗氧化劑水平。牧草的可變性以及在反芻動(dòng)物飼糧中最大化利用牧草的方式會改變其營養(yǎng)成分，從而可能會影響奶牛機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。事實(shí)上，抗氧化劑系統(tǒng)成分的變化通常不是原因，而是由更高的自由基活性誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的結(jié)果。以上研究提示，血漿生物抗氧化潛能含量的降低也可能是活性氧代謝物含量升高的原因。

2.1.7 氧化應(yīng)激指數(shù) 在生理?xiàng)l件下，機(jī)體通常有足夠的抗氧化儲備來應(yīng)對自由基的產(chǎn)生，但當(dāng)自由基的生成超過機(jī)體的抗氧化能力時(shí)，即體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑含量失衡時(shí)，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激。第一個(gè)使用氧化劑/抗氧化劑比例作為評估機(jī)體氧化狀態(tài)的有效指標(biāo)是在《人類醫(yī)學(xué)》雜志上發(fā)表的，該比例增加表明由于活性氧產(chǎn)生或防御性抗氧化劑消耗的增加而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的風(fēng)險(xiǎn)增加。同時(shí)Pietro在綜述中提出，氧化劑/抗氧化劑比例也可作為指示奶?；疾★L(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。

Abuelo 等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對奶牛整個(gè)過渡時(shí)期血清中活性氧自由基和血清抗氧化能力的結(jié)果進(jìn)行單獨(dú)評估時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)氧化和抗氧化這兩種指標(biāo)之間有顯著差異；當(dāng)用兩者的比例對氧化劑和抗氧化劑進(jìn)行綜合評估時(shí)，發(fā)現(xiàn)奶牛產(chǎn)前和產(chǎn)后階段存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示奶牛在分娩前后經(jīng)歷了氧化應(yīng)激。Laliotis 等研究發(fā)現(xiàn)，患有乳腺炎的奶牛其氧化應(yīng)激指數(shù)值極顯著高于對照健康組奶牛，表明患有乳腺炎的奶牛體內(nèi)氧化應(yīng)激水平較高。在人類醫(yī)學(xué)中的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑含量以比例結(jié)合時(shí)，氧化應(yīng)激水平和病理之間的相關(guān)性更高。

2.2 奶牛全血中表征的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物 紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，也是維持生命活動(dòng)最重要的細(xì)胞之一。因紅細(xì)胞具有運(yùn)輸氧氣的特殊生理功能，紅細(xì)胞必須始終暴露在每個(gè)血管環(huán)路以及其他各種不同的外源性物質(zhì)中。氧化應(yīng)激在很多生理和病理現(xiàn)象中扮演重要的角色，在一些病理（如免疫紊亂、感染、理化因素等）條件下，紅細(xì)胞會處在不斷變化的氧化應(yīng)激環(huán)境中。紅細(xì)胞自身就有一個(gè)抗氧化系統(tǒng)來抵抗紅細(xì)胞的氧化反應(yīng)。但當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，紅細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)不能有效地清除血紅蛋白自我氧化生成的過氧陰離子自由基，導(dǎo)致紅細(xì)胞中氧自由基大量蓄積，進(jìn)一步氧化細(xì)胞中的主要蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，使紅細(xì)胞的功能結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)，導(dǎo)致紅細(xì)胞損傷。故氧化應(yīng)激是紅細(xì)胞損傷最常見的原因，因?yàn)榧t細(xì)胞對氧化應(yīng)激具有高度的易損性，已經(jīng)被作為模型來研究生物膜的氧化損傷。

Gaál 等測定犢牛出生時(shí)全血自由基穩(wěn)態(tài)濃度、紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物（丙二醛）和抗氧化酶活性（谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶）、血漿總抗氧化能力以及產(chǎn)犢母牛的血漿抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，犢牛出生時(shí)體內(nèi)已存在氧化應(yīng)激；同時(shí)產(chǎn)犢當(dāng)天奶牛體內(nèi)總抗氧化能力顯著低于非產(chǎn)犢奶牛，表明產(chǎn)犢作為一種應(yīng)激原會導(dǎo)致奶牛機(jī)體短期氧化還原失衡。Lakritz 等研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激顯著降低了奶牛全血中紅細(xì)胞谷胱甘肽濃度并增加了氧化型谷胱甘肽濃度，表明熱應(yīng)激能夠在健康的泌乳奶牛中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。綜上，可通過檢測全血紅細(xì)胞中丙二醛、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽含量以及抗氧化酶的活性來評估奶牛的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

2.3 奶牛乳中表征的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物 牛奶的質(zhì)量與乳腺的健康密切相關(guān)。牛奶中能檢測到的抗氧化活性物質(zhì)主要可分為蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩大類。蛋白質(zhì)類抗氧化劑包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶以及乳成分中的酪蛋白和多肽等；非蛋白質(zhì)類抗氧化劑包括維生素C 和維生素E 和類胡蘿卜素。事實(shí)上，不同的牛奶成分已被證明具有特定的抗氧化能力。Cristina 等研究發(fā)現(xiàn)，牛奶中含有大量活性物質(zhì)，在抑制脂質(zhì)過氧化和加快超氧化物自由基清除速率方面具有重要價(jià)值（如酪蛋白和乳清在抑制細(xì)胞過氧化物形成中發(fā)揮著重要作用）。Talukder 等通過檢測全脂牛奶樣品（生物抗氧化潛能）、脫脂奶樣品（脂質(zhì)過氧化物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和銅藍(lán)蛋白）、乳清樣品（高級氧化蛋白產(chǎn)物）相關(guān)指標(biāo)含量變化評估處于發(fā)情周期的奶牛有無排卵，發(fā)現(xiàn)排卵奶牛的超氧化物歧化酶水平升高，而脂質(zhì)過氧化物、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽水平降低，提示乳中抗氧化相關(guān)指標(biāo)在奶牛發(fā)情鑒定中可作為重要表征指標(biāo)。

另外，Kuhn 等研究首次表明乳中15-F2t-異前列腺素含量可有效指示乳腺脂質(zhì)過氧化程度，作為乳腺炎和哺乳早期奶牛氧化應(yīng)激的評估標(biāo)準(zhǔn)。牛奶活性物質(zhì)的組成是乳腺代謝特征的直接表征，作為一種非侵入性樣品，獲取并分析牛奶中一些關(guān)鍵活性物質(zhì)，在監(jiān)測奶牛個(gè)體健康狀態(tài)和應(yīng)激程度等方面具有巨大應(yīng)用潛力。

3 小結(jié)與展望

奶牛不同體液中潛在的生物標(biāo)志物可反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀況。因此，可通過評估全血中紅細(xì)胞、血清/血漿以及牛奶中氧化和抗氧化水平來表征奶牛機(jī)體的氧化平衡狀態(tài)。根據(jù)不同試驗(yàn)需求，檢測不同體液中的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物，并對已采用的不同方法進(jìn)行結(jié)果比較，可以更好地綜合評估奶牛的健康和代謝狀況，確定適合反芻動(dòng)物氧化應(yīng)激的檢測方法，從而為不同生物標(biāo)志物建立正常生理范圍，確定奶牛氧化應(yīng)激閾值，以期推動(dòng)反芻動(dòng)物氧化應(yīng)激研究和應(yīng)用領(lǐng)域更快、更好地發(fā)展。