孟磊，張瑩，張旭，龔理，韋信賢，童桂香，高陽

（1浙江海洋大學水產學院/水產動物遺傳與發(fā)育實驗室，浙江舟山316022；2浙江海洋大學海洋科學與技術學院/海洋生物種質發(fā)掘與利用國家地方聯合實驗室，浙江舟山 316022；3中國科學院動物研究所/動物系統與進化重點實驗室，北京 100101；4廣西水產科學研究院/廣西水產遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西南寧 530021）

0 引言

【研究意義】線粒體基因組結構簡單，呈母性遺傳，且具有拷貝數多、進化速度快及不同區(qū)域進化速率各異等特點，已成為群體遺傳學和分子系統學領域研究的重要分子標記（Miya et al.，2001；Campbell et al.，2014；Tan et al.，2019）。在線粒體眾多基因片段中，細胞色素氧化酶I亞基（Cytochrome oxidase subunit I，）具有進化速率適中且易于擴增的特點，自21世紀初Tautz等（2002）提出將DNA片段應用于物種分類及Hebert等（2003a，2003b）提出DNA條形碼概念以來，線粒體基因受到分類學、生態(tài)學、保護生物學和進化生物學等生物領域的廣泛關注（吉鵬宇等，2008；柳淑芳等，2010；葛家春等，2011；苗憲廣等，2013）。因此，建立DNA條形碼數據庫對解決物種鑒定及系統親緣關系研究等具有重要意義。【前人研究進展】吉鵬宇等（2008）基于線粒體基因和16S rRNA部分序列對福建、東山等6個擬穴青蟹（）野生群體的遺傳結構進行分析，結果表明不同擬穴青蟹野生群體的遺傳背景基本相似，群體間存在著明顯的基因交流。葛家春等（2011）以同樣方法分析中華絨螯蟹（）群體遺傳結構，結果顯示不同水系中華絨螯蟹群體已不能形成明顯的地理群體結構，即中華絨螯蟹存在明顯的種質混雜現象。苗憲廣等（2013）以線粒體基因為分子標記，對鰈形目舌鰨亞科（Cynoglossinae）28種魚類進行系統發(fā)育研究，結果發(fā)現所有舌鰨亞科魚類形成一個單系群，與無線鰨亞科（Symphurinae）魚類形成穩(wěn)定的姐妹群關系；此外，遺傳距離結果支持長吻紅舌鰨（）和紫斑舌鰨（）分別與短吻紅舌鰨（）和短吻三線舌鰨（）是同物異名關系?？姇韵璧龋?017）利用線粒體基因序列對泰國近海的69個有毒水母樣本進行遺傳多樣性分析，結果發(fā)現這些樣品可以分為13個種，包括5種缽水母、6種立方水母和2種水螅水母，其中Carukiidae存在新屬新種，進一步證實基因片段能快速有效區(qū)分這些有毒水母種類；類似結果在Ortman等（2010）、李玉龍等（2017）對水母物種多樣性及系統發(fā)育研究中也得到驗證。隨著測序技術的快速發(fā)展，線粒體基因序列作為物種鑒定的分子條形碼已被廣泛接受；截至2021年1月，國際生命條形碼計劃（iBOL）數據庫中已收錄900萬余條基因序列，而形態(tài)鑒定輔以分子條形碼技術是解決物種分類鑒定困難的有效途徑之一（杜鶴等，2011；周曉夢等，2017；唐富江等，2020；熊娟等，2020）?！颈狙芯壳腥朦c】大眼蟹隸屬于十足目（Decapoda）短尾次目（Brachyuran）沙蟹總科（Ocypodoidea）大眼蟹科（Macrophthalmidae），廣泛分布于印度—西太平洋中低潮間帶的泥灘與巖礁地區(qū)，甚至包括亞潮帶區(qū)域（戴愛云等，1986）。早期研究認為，大眼蟹隸屬于沙蟹科（Ocypodidae）大眼蟹亞科（Macrophthalminae），但近期的形態(tài)學和分子鑒定結果均支持將其提升為科級水平（毛開云，2010；Chen et al.，2018；Wang et al.，2020）。據WoRMS（http：//www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=439151&allchildren=1）記載，大眼蟹科包括3亞科13屬131種，當前大部分研究聚焦于形態(tài)結構和生態(tài)習性等方面（Naderloo，2011，2012），而少有研究關注該科種類在分子水平上的差異及種間親緣關系（徐敬明，2009，2010）?！緮M解決的關鍵問題】通過測定同屬3種大眼蟹［拉氏大眼蟹（）、日本大眼蟹（）和太平大眼蟹（）］的線粒體基因序列，結合GenBank已公布的18種大眼蟹科基因部分序列，對21種大眼蟹的線粒體基因序列進行比較分析，探究基因作為大眼蟹科物種鑒定分子標記的可行性；同時基于基因序列構建目前最全面的大眼蟹科系統發(fā)育樹，以期為大眼蟹科系統發(fā)育研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組提取

拉氏大眼蟹、日本大眼蟹和太平大眼蟹分別采集于海南陵水海鮮市場、浙江臺州礁山碼頭和廣東廣州南沙港，每種大眼蟹各取1只。新鮮標本以酒精固定后運回實驗室，經形態(tài)學鑒定后用95%酒精保存。分別取蟹類螯足肌肉組織約30 mg，剪碎放入離心管中，采用海洋動物基因組織提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組DNA，以紫外分光光度計檢測其質量與濃度，并稀釋為50 ng/μL，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計與PCR擴增

基于短尾次目線粒體基因全序列，在其保守區(qū)域設計用于擴增3種大眼蟹基因全序列的通用引物F1-COI（5'-CYGCCTTATTCATCTAYGC RAGA-3'）/R1-COI（5'-TANACYTCWGGRTGHCCR AARAAYCA-3'）和F2-COI（5'-TCNACAAAYCATAA AGAYATYGG-3'）/R2-COI（5'-TARCGGTTGATHAR GAGT-3'）。PCR反應體系44.0μL：Mix酶20.0μL，上、下游引物各2.0μL，DNA模板2.0μL，ddHO補足至44.0μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃30 s，48～54℃50 s，68℃1～3 min，進行35個循環(huán)；68℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，將陽性PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1.3 序列拼接、注釋及分析

測序結果采用Codoncode Aligner 5.1.5（Codon-Code Corporation，Dedham，MA）進行拼接，并輔以手工校對；利用Sequin v15.10（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/）對線粒體基因全序列進行注釋，運 用ClustalX 2.0進 行 序 列 比 對（Larkin et al.，2007），使用MEGA X計算基因組堿基組成、保守位點和遺傳距離（Kumar et al.，2018），并以MatGAT 2.02進行多序列比對分析（Campanella et al.，2003）。

1.4 系統進化樹構建

以三疣梭子蟹（）和紅星梭子蟹（）為外類群，從GenBank下載18種大眼蟹科線粒體基因部分核苷酸序列（表1），結合本研究測定的3種大眼蟹基因序列，采用MEGA X中的最大似然法（Maximum likelihood，ML）和最大簡約法（Maximum parsimony，MP）分別構建系統發(fā)育進化樹（Kumar et al.，2018），設自展值（Bootstrap）為1000次，探究大眼蟹科系統進化關系。

表1 構建系統發(fā)育進化樹所用的參考物種信息Table 1 Reference species information for phylogenetic tree

2 結果與分析

2.1 3種大眼蟹COI基因全序列比較分析結果

測序獲得的拉氏大眼蟹、日本大眼蟹和太平大眼蟹線粒體基因全序列提交至GenBank，登錄號分別為MW423579、MW425691和MW425694。三者全長均為1534 bp，編碼511個氨基酸殘基，均以ATG作為起始密碼子及T作為不完全終止密碼子。3種大眼蟹基因的堿基含量差異不明顯，4種堿基平均組成分別為32.1% T、24.5% C、28.0% A和15.4% G。核苷酸序列比對分析發(fā)現，共有1175個保守位點及359個變異位點（約占23.4%），其中絕大多數變異位點出現在第3位密碼子（313個變異位點），第1位密碼子存在43個變異位點，第2位密碼子非常保守，僅有3個變異位點（圖1-A）；基因整條序列均為連續(xù)編碼，不存在堿基插入或缺失現象。將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列再進行比對，結果僅發(fā)現16個變異位點，變異位點率為3.1%（圖1-B），說明基因第3位密碼子變異并不一定會導致氨基酸改變，該現象稱為遺傳密碼的簡并性，即第3位密碼子編碼基因時具有搖擺性，可保證遺傳密碼決定的氨基酸相對穩(wěn)定，從而保證遺傳性狀及物種的相對穩(wěn)定性（Jeacock et al.，2018；Zhou et al.，2018）。

圖1 3種大眼蟹線粒體COI基因核苷酸序列（A）及其推導氨基酸序列（B）比對分析結果Fig.1 Alignment of nucleotide sequence（A）and deduced amino acid sequence（B）of mitochondrial COI gene of 3 Macrophthalmus species

2.2 21種大眼蟹COI基因部分序列比較分析結果

21種大眼蟹基因序列對應的物種信息詳見表1，用于多序列比對的序列長度為657 bp，連續(xù)編碼219個氨基酸殘基，不存在堿基插入或缺失現象。21種大眼蟹基因的堿基含量略有區(qū)別：28.9%～35.9% T、18.9%～27.2% C、25.3%～29.7%A及16.6%～19.0% G（表1）。核苷酸序列比對結果顯示，共有390個保守位點及267個變異位點（約占40.6%），與3種大眼蟹基因全序列比對結果一致，絕大多數變異位點出現在第3位密碼子（213個變異位點），第2位密碼子非常保守，僅有5個變異位點，第1位密碼子存在48個變異位點（圖2）。同樣，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列再進行比對，結果發(fā)現變異位點減少至20個，其中還包括10個自裔位點（Singleton site），變異位點率僅占9.13%（圖3），同樣表現出遺傳密碼的簡并性。

圖2 21種大眼蟹線粒體COI基因核苷酸序列比對分析結果Fig.2 Alignment of nucleotide sequence of mitochondrial COI gene of 21 Macrophthalmidae species

2.3 遺傳距離及相似性分析結果

圖3 21種大眼蟹線粒體COI基因推導氨基酸序列比對分析結果Fig.3 Deduced amino acid sequence of mitochondrial COI gene of 21 Macrophthalmidae species

表2 21種大眼蟹科物種線粒體COI基因的遺傳距離（左下角）及序列相似性（右上角）Table 2 Genetic distance（bottom left）and sequence similarity（upper right）of COI gene in 21 Macrophthalmidae species

計算21種大眼蟹科物種的基因遺傳距離及其序列相似性（表2），結果顯示攝氏大眼蟹（）與米氏大眼蟹（）間的遺傳距離最?。?.039），二者對應的序列相似性最高（96.2%）；其次為波斯張口蟹（）與大眼蟹科未定種（Macrophthalmidae sp.），二者的遺傳距離為0.067，對應的序列相似性為93.6%。日本大眼蟹（）、太平大眼蟹（）和拉氏大眼蟹（）分別與萬歲大眼蟹（）、絨毛大眼蟹（）和隆背大眼蟹（）存在最小的遺傳距離，分別為0.105、0.179和0.158，對應的序列相似性分別為90.3%、84.3%和86.2%。

2.4 系統發(fā)育進化分析結果

基于線粒體基因序列，以三疣梭子蟹和紅星梭子蟹為外類群，分別以最大似然法和最大簡約法構建大眼蟹科的系統發(fā)育進化樹，結果發(fā)現這2種方法構建的系統發(fā)育進化樹在拓撲結構和支持率上略有區(qū)別（圖4）。在最大似然法和最大簡約法構建的系統發(fā)育進化樹中，均表現為日本大眼蟹與萬歲大眼蟹的親緣關系最近、太平大眼蟹與絨毛大眼蟹的親緣關系最近，但拉氏大眼蟹的進化地位在2種系統發(fā)育進化樹中存在較大分歧，在最大似然系統發(fā)育進化樹中與隆背大眼蟹的親緣關系最近（圖4-A），而在最大簡約系統發(fā)育進化樹中與隆背大眼蟹的親緣關系較遠，獨立處于一支（圖4-B）。值得注意的是，在2種系統發(fā)育進化樹中均顯示大眼蟹屬物種并非聚為一支形成單系群。其中，最大似然系統發(fā)育進化樹分為三大分支，一支由13種大眼蟹屬物種組成，另一支由3種大眼蟹屬和紅樹泥方蟹（）組成，剩余一支由平背大眼蟹（）單獨組成（圖4-A）；最大簡約系統發(fā)育進化樹則分為四大分支，其中兩支分別由12種和3種大眼蟹屬物種組成，剩余兩支分別由拉氏大眼蟹和平背大眼蟹單獨組成（圖4-B）。此外，2種系統發(fā)育進化樹均顯示薄氏張口蟹（）、波斯張口蟹（）和大眼蟹科未定種聚為一支，具有較高的支持率，故推斷該未定種為張口蟹屬種類。

3 討論

自DNA條形碼的概念被提出以來，該技術經過20年的迅猛發(fā)展，已廣泛應用于分類學、生態(tài)學、保護生物學和進化生物學等生物領域（胡永春等，2020；毛啟迪等，2020），成為不同生物類群物種鑒定、群體遺傳及系統進化等研究的重要手段（吉鵬宇等，2008；柳淑芳等，2010；葛家春等，2011；苗憲廣等，2013）。據WoRMS記載，蟹類的物種和形態(tài)特征均豐富多樣，目前已有7250種短尾類（Brachyuran）被發(fā)現。早期的蟹類分類主要依靠經典的形態(tài)學方法，但由于形態(tài)學分類具有一定的主觀性且易受環(huán)境因素干擾，因此在蟹類分類及系統發(fā)育研究中很可能得到不一致的結論（Ng and Schubart，2003；Naderloo，2011）。如相手蟹科（Sesarmidae）種類形態(tài)十分接近，導致該科物種的鑒定和分類長期處于混亂狀態(tài)（Ng et al.，2019）。Schubart和Ng等（2021）以形態(tài)學與分子鑒定相結合的方法，校正了長期混亂的螳臂蟹屬（）和假相手蟹屬（）的分類問題，重新厘定該科的分類系統（新增8個新屬），并對GenBank中相關種類命名提出質疑。

大眼蟹科種類豐富，包括3亞科13屬131種，目前鮮見關于該科種類分子遺傳多樣性及種屬親緣關系的研究報道（徐敬明，2009，2010；Wang et al.，2020）。線粒體、和16S rRNA等基因序列具有序列相對保守、易擴增及進化速度適中等特點，是目前研究物種分類和科內系統進化的重要分子標記（苗憲廣等，2013；王淑英等，2014；徐巖等，2019）；但少數串聯基因尤其是單基因由于遺傳信息位點相對較少，越來越多的研究趨向于依靠線粒體基因組全序列來解決上述難題（Campbell et al.，2014；Lavouéet al.，2014；Zhang et al.，2020）。至今，大眼蟹科僅測定了4個物種（日本大眼蟹、短身大眼蟹、太平大眼蟹和達爾文大眼蟹）的線粒體基因組全序列，故無法有效開展該科系統發(fā)育研究。為此，本研究基于線粒體基因序列分析21種大眼蟹的分子多樣性水平，同時構建目前最全面的大眼蟹科系統發(fā)育進化樹。通過比對分析21種大眼蟹基因部分序列，結果發(fā)現每個物種均有區(qū)別于其他種類的特異位點，因此可考慮作為物種鑒定的分子標記。遺傳距離、序列相似性及系統發(fā)育進化分析結果均表明，日本大眼蟹與萬歲大眼蟹的親緣關系最近、太平大眼蟹與絨毛大眼蟹的親緣關系最近。此外，Gen-Bank中的大眼蟹科未定種與波斯張口蟹的親緣關系最近，然后與薄氏張口蟹聚類形成張口蟹屬單系群，從而確定該未定種為張口蟹屬種類。

本研究分別以最大似然法和最大簡約法構建大眼蟹科的系統發(fā)育進化樹，結果發(fā)現這2種方法構建的系統發(fā)育進化樹在拓撲結構和支持率上略有區(qū)別，究其原因可能是基因包含的有效信息位點有限（僅657 bp），在解析某些物種間的親緣關系上仍顯不足。此外，某些屬（如泥方蟹屬）僅涉及一個物種，也有可能造成系統發(fā)育進化樹不穩(wěn)定。即便如此，2種系統發(fā)育進化樹均顯示大眼蟹屬可能是非單系群，后續(xù)研究應基于更多基因序列及更多物種數來重點闡述這一現象。

圖4 基于線粒體COI基因序列構建的大眼蟹科系統發(fā)育進化樹Fig.4 Macrophthalmidae family phylogenetic tree based on mitochondrial COI gene sequence

4 結論

21種大眼蟹線粒體基因序列均有區(qū)別于其他種類的特異位點，可考慮作為物種鑒定的分子標記；但用于多序列比對的基因部分序列包含有效信息位點有限，在解析某些物種間的親緣關系上仍顯不足，部分種類間的親緣關系可信度較低，因此后續(xù)研究應基于更多基因序列及更多物種數以解決這一問題。