莫曉麗，成 晨，曾 雯，黃亞輝

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）

烏龍茶是我國(guó)六大茶類中的半發(fā)酵茶，按地區(qū)可分為廣東烏龍、臺(tái)灣烏龍、閩北烏龍和閩南烏龍，其以鳳凰單叢是廣東烏龍茶中最受消費(fèi)者青睞的，其以香氣高揚(yáng)且香型豐富著稱。鳳凰單叢品質(zhì)形成需經(jīng)過(guò)曬青、晾青、做青、殺青、揉捻、烘焙六個(gè)工序。做青是鳳凰單叢獨(dú)特香氣及風(fēng)味形成的關(guān)鍵工藝，其包括搖青和晾青這兩個(gè)交替進(jìn)行的工序，搖青實(shí)質(zhì)是形成機(jī)械損傷，時(shí)間較短；晾青時(shí)間長(zhǎng)，主要是使蛋白質(zhì)、多糖、茶多酚等物質(zhì)發(fā)生緩慢的生化反應(yīng)，經(jīng)過(guò)這兩個(gè)工序，茶葉中茶黃素等色素類物質(zhì)及大量的香氣物質(zhì)形成。茶學(xué)工作者對(duì)做青過(guò)程中烏龍茶內(nèi)含物質(zhì)及相關(guān)酶活性的變化進(jìn)行了大量研究，研究表明機(jī)械損傷和低溫等各種脅迫影響烏龍茶香氣的形成。傳統(tǒng)做青機(jī)械化程度低，步驟復(fù)雜，勞動(dòng)強(qiáng)度大，對(duì)人工要求較高。此外，做青強(qiáng)度和時(shí)間需要根據(jù)茶青嫩度、天氣情況等多種因素進(jìn)行調(diào)整，要求制茶師傅有較豐富的經(jīng)驗(yàn)，需要“看青做青”。針對(duì)以上問(wèn)題，茶界前輩們不斷探索和驗(yàn)證，提出了包括切細(xì)做青、振動(dòng)做青、可控環(huán)境做青、連續(xù)化做青等思路和理念。

為了獲得最適于烏龍茶品質(zhì)形成的做青條件，研究者設(shè)定不同的溫度濕度進(jìn)行做青，研究表明不同溫度對(duì)鐵觀音的香氣有較大影響，中低溫條件下鐵觀音中兒茶素含量顯著高于高溫條件下。做青溫度過(guò)高過(guò)低都不利于烏龍茶香氣形成，中低溫條件更有利于烏龍茶形成更豐富且組分含量較高的香氣物質(zhì)；溫度一致的情況下，濕度適中的烏龍茶香氣成分更為優(yōu)異，中溫中濕條件有利于嶺頭單叢形成高銳持久的花蜜香。此外，烏龍茶品質(zhì)形成的另一關(guān)鍵因素為做青強(qiáng)度，做青強(qiáng)度影響茶葉內(nèi)酶的活性，適當(dāng)做青下茶葉內(nèi)源酶的活力提高，搖青過(guò)重超氧化物歧化酶活性降低，加快了脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，鮮葉中可溶性蛋白質(zhì)及其可溶性組分迅速下降，影響香氣形成。搖青次數(shù)對(duì)于烏龍茶功能成分和香氣物質(zhì)形成有不同的影響，研究表明，搖青2 次、4 次和6 次情況下，搖青次數(shù)越多，兒茶素減少量越多，茶紅素、茶黃素和茶褐素的含量越高，茶湯滋味苦澀味降低，4 次搖青下的游離氨基酸含量最高，咖啡堿差異不明顯，6 次搖青下的可溶性糖總量最低，而香氣組分和精油總量最高。

目前，烏龍茶做青工藝創(chuàng)新多集中于加工機(jī)械的改進(jìn)，通過(guò)機(jī)械加工的烏龍茶品質(zhì)及主要成分變化研究較少，本研究關(guān)注傳統(tǒng)做青理念，首次提出連續(xù)慢速做青理論，通過(guò)緩慢、連續(xù)地使茶青在慢速滾動(dòng)或振動(dòng)下造成機(jī)械損傷，使茶葉發(fā)生各種生化反應(yīng)并逐漸形成其獨(dú)特品質(zhì)風(fēng)味，以期從源頭解決做青工藝復(fù)雜、勞動(dòng)強(qiáng)度大等問(wèn)題。本研究測(cè)定了五次傳統(tǒng)做青及采用滾筒搖青機(jī)連續(xù)緩慢進(jìn)行搖青7.5 h（每隔1.5 h 取一次樣品）的白葉單叢的主要化學(xué)成分及相關(guān)酶基因表達(dá)量，并與傳統(tǒng)的做青工藝進(jìn)行比較，獲得采用滾筒做青機(jī)連續(xù)慢速做青的新技術(shù)，以達(dá)到降低勞動(dòng)強(qiáng)度，大量節(jié)省人工，且使茶葉品質(zhì)更為穩(wěn)定的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏龍茶（白葉單叢） 于2018 年4 月進(jìn)行采摘，廣東省潮州市茶園；碳酸鈉、甲醇、福林酚、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、茚三酮、氯化亞錫 以上均為市售國(guó)產(chǎn)分析純；可可堿標(biāo)準(zhǔn)品、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品、茶葉堿標(biāo)準(zhǔn)品、苦茶堿標(biāo)準(zhǔn)品、兒茶素單體標(biāo)準(zhǔn)品（沒(méi)食子兒茶素GC、表沒(méi)食子兒茶素EGC、兒茶素C、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯EGCG、表兒茶素EC、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯GCG、表兒茶素沒(méi)食子酸酯ECG、兒茶素沒(méi)食子酸酯CG）、異丙醇（AR 級(jí)） Sigma-Aldrich Co.LLC；三氟乙酸（HPLC級(jí)） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（HPLC 級(jí)） 美國(guó)Thermo Fisher；超快型植物RNA提取試劑盒 北京華越洋生物科技有限公司；MMuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒 生物合成（上海）股份有限公司；熒光染料iTaq TM Universal SYBR Green Supermix 美國(guó)伯樂(lè)。

6CST-B40 滾筒式茶葉殺青機(jī) 浙江綠峰機(jī)械有限公司；6CR-30 茶葉揉捻機(jī) 浙江上洋機(jī)械有限公司；6CHM-901 型電式碧螺春烘干機(jī) 浙江省富陽(yáng)茶葉機(jī)械總廠；AB204-N 型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DZKW 電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV2450 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) Shimadzu Corporation Assembled in China；DHG-101 電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；落地式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific；超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Electron Corporation；Agilent 1200 高效液相色譜儀美國(guó)Agilent 公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad 公司；NanoDrop2000 超微量核酸定量?jī)x美國(guó)Gene 公司；LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR 儀瑞士Roche。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集與處理 將采摘后的鮮葉按照烏龍茶加工工序（圖1）進(jìn)行曬青和晾青（樣品編號(hào)分別為S和W），晾青后的原料分別采用以下兩種方法進(jìn)行做青。

圖1 烏龍茶加工流程圖Fig.1 Processing flow chart of oolong tea

連續(xù)慢速做青：采用滾筒長(zhǎng)徑比為1.5 m/0.7 m的搖青機(jī)緩慢連續(xù)（1.84 r/min）進(jìn)行搖青7.5 h，每隔1.5 h 取一次樣品（樣品編號(hào)為L(zhǎng)X1、LX2、LX3、LX4、LX5）；搖青結(jié)束后晾青1 h。

傳統(tǒng)做青是不連續(xù)的，包括搖青（4 min）和晾青（1.5 h）兩個(gè)工序，重復(fù)這兩個(gè)工序五次，每次晾青結(jié)束取一次樣（樣品編號(hào)為CT1、CT2、CT3、CT4、CT5）。

做青結(jié)束后采用殺青機(jī)進(jìn)行殺青（200 ℃，3 min）；揉捻30 min 后分別用毛火（110 ℃）、足火（90 ℃）進(jìn)行干燥。每次取樣后立即用微波爐進(jìn)行微波固定（中高火，3 min），然后在4 ℃下干燥和儲(chǔ)存，用于下一步研究。

1.2.2 茶葉感官評(píng)價(jià)和理化成分測(cè)定 供試樣品感官品質(zhì)、含水率、水浸出物、茶多酚、游離氨基酸總量均按照國(guó)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定分析。感官審評(píng)共20 人參與（11 個(gè)男生，9 個(gè)女生，年齡22～35 歲），以評(píng)分方式評(píng)定茶葉感官品質(zhì)，包括外形（20%）、湯色（5%）、香氣（30%）、滋味（35%）、葉底（10%）五個(gè)因素。

兒茶素、生物堿組分及含量采用高效液相色譜測(cè)定，檢測(cè)方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前的研究并已經(jīng)有過(guò)方法驗(yàn)證。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C（4.6 mm×150 nm，5 μm），柱溫38 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相A、B 分別為0.1%的三氟乙酸水溶液和HPLC 級(jí)甲醇，洗脫梯度見(jiàn)表1。采用278 nm 的波長(zhǎng)檢測(cè)兒茶素組分，測(cè)定時(shí)流速為0.8 mL/min；生物堿組分的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，采用1 mL/min 的流速進(jìn)行測(cè)定。

表1 高效液相檢測(cè)兒茶素、生物堿的洗脫梯度Table 1 Elution gradient for the determination of catechins and alkaloids by HPLC

供試樣品揮發(fā)性成分交由杭州農(nóng)業(yè)部茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心測(cè)定，樣品前處理采用固相萃取方法。

1.2.3 qRT-PCR 引物設(shè)計(jì)與合成 篩選出與多酚氧化酶和-葡萄糖苷酶相關(guān)的6 個(gè)基因，進(jìn)行不同做青方式和做青程度茶葉鮮葉相關(guān)基因表達(dá)驗(yàn)證水平。采用Primer Premier 5 軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，內(nèi)參基因選用茶葉。委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成設(shè)計(jì)所得引物，基因編號(hào)及引物序列見(jiàn)表2，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

表2 qRT-PCR 引物序列表Table 2 qRT-PCR primer sequence list

1.2.4 做青葉總RNA 提取及cDNA 合成 取做青葉0.5 g 于預(yù)冷研缽中加入液氮研磨，按照北京華越洋公司的超快型植物RNA 提取試劑盒步驟提取樣品的總RNA，其完整度檢測(cè)采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，而后用超微量核算檢測(cè)儀測(cè)定RNA 濃度及OD、OD、OD比值，判斷所提RNA 濃度及質(zhì)量，并選擇符合試驗(yàn)結(jié)果的RNA 用于后續(xù)試驗(yàn)。采用M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒合成cDNA 第一條鏈，轉(zhuǎn)錄體系組分如表3。

表3 轉(zhuǎn)錄組分體系Table 3 Transcription system components

將上表物質(zhì)輕輕混合均勻后稍微離心后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，該過(guò)程采用PCR 儀完成，程序如下：25 ℃，10 min；42 ℃，40 min；70 ℃，10 min，合成的cDNA-20 ℃保存。

1.2.5 qRT-PCR 檢測(cè) 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析，將每個(gè)cDNA 樣品稀釋12 倍，選用單內(nèi)參方法進(jìn)行熒光定量，qRT-PCR 擴(kuò)增體系共10 μL：SYBR qPCR MIX，5 μL；上下游引物各0.25 μL；cDNA，0.5 μL；RNase Free ddHO，4 μL。熒光染料采用BIO-RAD iTaqUniversal SYBR Green Supermix。qRT-PCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃，1 min；95 ℃，15 s，55 ℃，30 s，72 ℃，35 s，40 個(gè)循環(huán)；采用qRT-PCR 儀采集的數(shù)據(jù)做熔解曲線，熔解程序溫度參數(shù)是65～95 ℃，以0.5 ℃為單位遞增讀板，讀板頻率為5 s/次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

qRT-PCR 定量數(shù)據(jù)分析采用2方法，以連續(xù)第一次做青樣品定量值為參照分析所有樣品的表達(dá)量；試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基本統(tǒng)計(jì)分析及作圖采用Excel 2013 軟件，方差分析、因子分析和主成分分析等采用SAS 9.4 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同做青方式和搖青次數(shù)的烏龍茶感官品質(zhì)分析

感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表4 所示。10 個(gè)處理茶樣中，以LX4 感官品質(zhì)最佳，其次是LX5 號(hào)樣以及CT3，其共同特征是花蜜香明顯，茶湯醇厚帶花香；而因香氣品質(zhì)稍差，帶青氣熟悶味，CT4 和CT1 感官品質(zhì)最差。

表4 茶樣感官審評(píng)結(jié)果Table 4 sensory evaluation results

單以搖青次數(shù)來(lái)看，傳統(tǒng)做青方式下的烏龍茶品質(zhì)在一定范圍內(nèi)隨著做青次數(shù)的增加而上升，CT3 品質(zhì)最佳，但當(dāng)搖青達(dá)到適宜程度時(shí)再繼續(xù)搖青，品質(zhì)會(huì)略微降低；對(duì)于連續(xù)搖青方式而言，在本次試驗(yàn)設(shè)置的范圍內(nèi)，搖青時(shí)間越長(zhǎng)，烏龍茶感官品質(zhì)越佳。就做青方式而言，在相同做青時(shí)間下，連續(xù)搖青方式下的烏龍茶品質(zhì)皆優(yōu)于傳統(tǒng)做青。

2.2 不同做青方式和次數(shù)的烏龍茶理化成分分析

2.2.1 做青葉含水量變化 烏龍茶品質(zhì)的形成與做青過(guò)程茶梢體內(nèi)發(fā)生特殊的水分傳輸、擴(kuò)散方式有關(guān)，葉細(xì)胞膨壓的多次消長(zhǎng)，是做青引起的特殊生理過(guò)程，它可能對(duì)烏龍茶品質(zhì)的形成的有關(guān)生化途徑進(jìn)行具有特殊意義。由圖2 可知，曬青后青葉經(jīng)過(guò)晾青，含水量有所回升；而后的整個(gè)搖青過(guò)程中，青葉含水率基本呈下降趨勢(shì)；不同做青階段的含水率之間存在較大差異。

圖2 不同做青方式和次數(shù)青葉含水量變化Fig.2 Change of water content in different ways and times

比較兩種做青方式發(fā)現(xiàn)，第一階段做青結(jié)束時(shí)，傳統(tǒng)做青方式的青葉含水率（73.76%）低于連續(xù)低速搖青（75.23%）；但隨著做青進(jìn)程的深入，從第二階段搖青開(kāi)始，連續(xù)低速搖青方式的青葉含水率的下降幅度低于傳統(tǒng)做青，但其含水率一直低于傳統(tǒng)搖青方式，直至做青結(jié)束，傳統(tǒng)做青含水率為73.50%，連續(xù)慢速做青含水率為72.92%。兩種不同做青方式對(duì)青葉含水率的影響不存在顯著性差異。說(shuō)明做青能促進(jìn)水分散失，并且連續(xù)低速搖青相比于傳統(tǒng)做青方式，促進(jìn)青葉失水的過(guò)程更加平緩均勻。

做青促使茶梢從生理失調(diào)狀態(tài)轉(zhuǎn)向有序的工藝狀態(tài)，其水勢(shì)變化歷程具有工藝節(jié)奏性，傳統(tǒng)做青方式中，茶梢水勢(shì)會(huì)隨著搖青和晾青的交替呈升降變化并累進(jìn)下降。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種做青方式下青葉含水率的總變化趨勢(shì)類似，隨著做青次數(shù)的增加，含水率呈波動(dòng)式下降，但傳統(tǒng)做青方式的青葉相較于連續(xù)慢速做青單次變化幅度更大，且做青后期，傳統(tǒng)做青青葉含水率高于連續(xù)慢速做青。潘玉華研究發(fā)現(xiàn)，搖青后茶青含水率上升，推測(cè)其除梗葉水分重新分布外，大分子物質(zhì)分解及細(xì)胞呼吸作用生成水分導(dǎo)致含水率上升。傳統(tǒng)做青方法搖青和晾青交替進(jìn)行，一搖至三搖含水率上升可能為梗葉水分重新分布及呼吸作用等水分增加量大于失水量。連續(xù)慢速做青下茶青一直處于慢速地?fù)u青狀態(tài)，故其一直處于失水狀態(tài)。

2.2.2 水浸出物含量比較 從做青開(kāi)始到結(jié)束，整個(gè)過(guò)程中兩種做青方式對(duì)應(yīng)的成品茶水浸出物的含量（圖3），均在曬青后即出現(xiàn)峰值，均為25.33%，而后水浸出物含量隨做青次數(shù)的增加而逐步減少，做青結(jié)束后傳統(tǒng)做青的水浸物含量為23.08%，連續(xù)慢速做青為23.72%，兩種方式下水浸出物含量不存在顯著性差異。

圖3 不同做青方式和次數(shù)烏龍茶水浸出物含量Fig.3 Content of water extract in different ways and times

傳統(tǒng)做青方式下，水浸出物含量最高的為CT1，隨后不斷降低。CT5 與CT1、CT2 存在極顯著差異（＜0.01），其他各處理間不存在顯著性差異。

連續(xù)慢速做青方式下，水浸出物含量在LX2 達(dá)到最大值。隨后搖青次數(shù)越多，水浸出物含量越少。LX1與其他連續(xù)搖青次數(shù)處理均存在極顯著差異（＜0.01）。

水浸出物是指茶葉內(nèi)茶多酚、生物堿、氨基酸、茶色素、可溶性糖類和芳香物質(zhì)等能溶于沸水的物質(zhì)的總和，一般占總含量的45%。晏嫦妤等對(duì)廣東鳳凰單叢43 個(gè)茶樣進(jìn)行主要品質(zhì)成分分析發(fā)現(xiàn)，鳳凰單叢水浸出含量較高，在35.63%～49.41%范圍內(nèi)。

2.2.3 茶多酚含量比較 如圖4 所示，不同做青方式下茶多酚含量變化趨勢(shì)有所不同，隨著做青次數(shù)增加，傳統(tǒng)做青下茶多酚呈先增后減的趨勢(shì)，而連續(xù)慢速做青呈先減后增趨勢(shì)，兩種不同做青方式的成品茶茶多酚含量不存在顯著性差異。

圖4 不同做青方式和次數(shù)烏龍茶茶多酚含量比較Fig.4 Comparison of the polyphenol content in different ways and times

傳統(tǒng)做青方式下，萎凋后青葉經(jīng)歷第一次搖青后，茶多酚含量下降，隨后的做青過(guò)程中，茶多酚含量上升且在CT4 達(dá)到最大值為19.71%，之后茶多酚含量下降。不同搖青次數(shù)處理間的成品茶的茶多酚含量存在極顯著性差異。連續(xù)慢速做青方式下，LX1茶多酚含量最高，為17.92%；隨著做青次數(shù)的增多，茶多酚含量持續(xù)降低。除LX2 與LX5 存在顯著性差異外（＜0.05），各處理之間茶多酚含量存在極顯著性差異（＜0.01）。

利用高效液相色譜測(cè)得的兒茶素有8 種，其中EGC 的含量在儀器檢出限以下，不納入分析范圍。由圖4 可知，從兒茶素總量來(lái)看，12 個(gè)茶樣兒茶素總量處于7.67%～14.16%，并在晾青和搖青前期增加，搖青后期降低，因此做青次數(shù)對(duì)兒茶素總量影響較大。兒茶素是茶葉中多酚類物質(zhì)的主體部分，占茶葉干重的12%～24%，主要包括EGCG、ECG、EGC和EC，且以EGCG 含量最為豐富。由表5 可知，在烏龍茶加工過(guò)程中，兒茶素總量逐漸減少，其中又以搖青工序減少最多；L-表沒(méi)食子兒茶素EGC 及其沒(méi)食子酸酯EGCG 的氧化還原勢(shì)最低，首先被氧化，L-EGC、L-EGCG、L-ECG 為兒茶素中減幅最大的成分。本試驗(yàn)中，從兒茶素單體來(lái)看，晾青后的茶青7 種兒茶素含量均上升，其中GCG 和EGCG 變化幅度最大，分別為61.81%和33.24%。搖青開(kāi)始后，除EC 外的6 種兒茶素含量均呈下降趨勢(shì)，下降幅度較小。酯型兒茶素主要是造成茶湯的苦澀味，而非酯型兒茶素則是甜味的主要貢獻(xiàn)者，苦澀味不利于茶湯品質(zhì)評(píng)定，而甘甜是茶葉品質(zhì)好的一個(gè)表現(xiàn)。與傳統(tǒng)做青相比，連續(xù)慢速做青擁有較低的酯型兒茶素的含量，這可能是連續(xù)慢速做青茶樣感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)比傳統(tǒng)做青分?jǐn)?shù)高的原因。

表5 兒茶素組分及含量（%）Table 5 Catechin components and content (%)

2.2.4 游離氨基酸總量比較 氨基酸是茶葉中的主要成分之一，其組分會(huì)直接影響茶葉的鮮爽度和相關(guān)香氣成分。做青過(guò)程中，蛋白質(zhì)部分水解為氨基酸，茶葉內(nèi)氨基酸也會(huì)與其他物質(zhì)結(jié)合形成部分香氣物質(zhì)，因此氨基酸含量并不總是增加或減少。

由圖5 可知，隨著搖青次數(shù)的增加，兩種搖青做青方式下成品茶的氨基酸含量呈先減少后增加的趨勢(shì)。傳統(tǒng)做青方式下，與萎凋葉相比，CT1 和CT2 的氨基酸含量稍低，CT3 的氨基酸含量為2.42%，達(dá)到最大值；隨后含量不斷降低。連續(xù)慢速做青方式下，LX1 下氨基酸含量最低，隨著搖青次數(shù)的增加，氨基酸含量上升，在LX2 時(shí)達(dá)到峰值，為2.61%；隨后含量不斷降低。本試驗(yàn)中氨基酸變化趨勢(shì)與黃福平等研究結(jié)果相似。

圖5 游離氨基酸總量變化Fig.5 Changes of free amino acid

2.2.5 生物堿組分及含量 研究發(fā)現(xiàn)咖啡堿是導(dǎo)致茶湯苦味的一個(gè)因素；然而，咖啡堿也被證明可以增強(qiáng)茶氨酸的味覺(jué)強(qiáng)度。從圖6 可以看出，可可堿含量在晾青后有明顯回升，在搖青過(guò)程中其含量不斷下降；不同做青方式下，咖啡堿變化趨勢(shì)較為相似，做青次數(shù)對(duì)咖啡堿含量有較大影響，在第二次做青后，咖啡堿含量下降最為明顯；嘌呤生物堿總量變化趨勢(shì)與咖啡堿一致，連續(xù)慢速做青下，做青前后嘌呤生物堿總量不存在極顯著差異。兩種做青方式下，隨著做青次數(shù)增加，可可堿含量減少，咖啡堿含量出現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，這與陳泉賓等的研究結(jié)果一致。研究表明，搖青次數(shù)對(duì)咖啡堿含量有較大影響，搖青4 次烘焙溫度100 ℃、烘焙時(shí)長(zhǎng)2 h最有利于提高咖啡堿含量。目前，關(guān)于咖啡堿的研究集中于其在鮮葉中的合成代謝，在加工過(guò)程的變化機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)道。

圖6 嘌呤生物堿組分及其含量Fig.6 Purine alkaloids components and content

2.2.6 不同做青方式和次數(shù)的烏龍茶香氣主成分分析 烏龍茶的香氣是區(qū)別于其他茶類的突出點(diǎn)，在品質(zhì)評(píng)定中的地位至關(guān)重要。烏龍茶中目前已檢測(cè)鑒定的香氣多達(dá)幾百種，本文主要以檢測(cè)鑒定出的其中40 種作為研究對(duì)象，探討做青方式和做青次數(shù)對(duì)烏龍茶香氣品質(zhì)的影響。通過(guò)對(duì)40 種香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，得到5 個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率為83.71%，每個(gè)主成分對(duì)香氣的貢獻(xiàn)依次遞減（表6）。第一主成分（Z1）中絕對(duì)值較高且為正值的有-芳樟醇、水楊酸甲酯、4-萜烯醇、苯甲醛、-水芹烯和橙花醇，主要反映了萜類物質(zhì)對(duì)香氣成分的貢獻(xiàn)；第二主成分（Z2）中絕對(duì)值較高且為正值的有1-乙基吡咯、4-異丙烯基甲苯、檸檬烯、5-甲基-2-糠醛，反映了雜環(huán)類物質(zhì)對(duì)香氣的貢獻(xiàn)；第三主成分（Z3）中絕對(duì)值較大且為正值的有反--羅勒烯、-紫羅酮、反-3,7-二甲基-2,6-丁二烯酸，反映了脂肪族類香氣衍生物對(duì)香氣成分的貢獻(xiàn)；第四主成分（Z4）中絕對(duì)值較高且為正值的成分包括香葉酸甲酯、橙花叔醇和卡達(dá)烯；第五主成分（Z5）中絕對(duì)值較高的有順-2,6-二甲基-2,5,7-三烯-4-酮、二甲基戊酸甲酯和香葉基丙酮，反映了酮類物質(zhì)對(duì)香氣成分的貢獻(xiàn)。

表6 主分量貢獻(xiàn)率及特征向量Table 6 Principal component contribution rate and eigenvector

反式-橙花叔醇、吲哚等是烏龍茶香氣不同于其他茶類的主要成分，而構(gòu)成嶺頭單叢花蜜香的主要香氣組分是橙花叔醇、芳樟醇及其氧化物、香葉醇、順-茉莉酮、3、7-二甲基-1、5、7-辛三烯-3-醇、己醛、吲哚、（反）-2-己烯醛、（順）-3-己烯基己酸酯等。芳樟醇、香葉醇、橙花叔醇屬于萜烯醇類，具有花香或果香，其中芳樟醇具有百合花或玉蘭花香氣，香葉醇具有玫瑰香氣，橙花叔醇具有木香、花木香和水果百合香韻。

制烏龍茶過(guò)程中，隨著搖青次數(shù)的增加，芳樟醇、吲哚類、己酸-順-3-己烯酯、-環(huán)檸檬醛、橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、法呢烯、植酮、植物醇等物質(zhì)濃度大大增加，隨著做青強(qiáng)度的增加，己醛、正戊醇、芳樟醇氧化物Ⅰ芳樟醇氧化物Ⅱ、香葉醇、-紫羅酮、茉莉酮、橙花叔醇、吲哚等香氣組分逐漸積累。王爾茂等研究發(fā)現(xiàn)，不同于手工做青，機(jī)械重做青會(huì)降低茶湯主體香氣物質(zhì)芳樟醇及其氧化物的含量，而增加特征呈香物質(zhì)3,7-二甲基-1,5,7-辛三烯-醇水楊酸甲酯、-紫羅酮降低，順-己酸已烯酯、香葉醇和吲哚。而本文研究結(jié)果表明，搖青次數(shù)越多，2,6-二甲基-1,3,5,7-辛四烯、橙花叔醇、脫氫芳樟醇、2-乙酰吡咯橄欖醇、吲哚、順-己酸-3-己烯酯、茶香螺烷含量越高；而水楊酸甲酯、-芳樟醇、4-萜烯醇、-松油烯、3，7-二甲基-2,6-二辛烯醛、-水芹烯、-紫羅酮含量越低。

由表7 可知，所有樣品中五個(gè)主成分得分最高的分別為CT1、LX4、LX3、CT2、LX1。從圖7 第一、二主成分散點(diǎn)圖觀察可知，CT3、LX4 在第二主成分部分得分較高，LX5 在第一主成分和第二主成分得分皆最低，三者位置分布比較分散；剩下的樣品可分為2 部分，一部分包含CT4、CT5 和LX1、LX2、LX3，在兩個(gè)主成分部分得分較均衡；一部分包含CT1 和CT2，在第一主成分得分最高。

圖7 第一主成分得分對(duì)第二主成分得分散點(diǎn)圖Fig.7 First principal component score versus the second principal component's scatter point diagram

表7 10 個(gè)樣品在各主成分的得分值Table 7 Score value of each principal component of 10 samples

2.3 不同做青方式和次數(shù)的烏龍茶相關(guān)酶基因表達(dá)量

利用熒光定量PCR 檢測(cè)了多酚氧化酶和-葡萄糖苷酶相關(guān)6 個(gè)基因在不同做青方式和做青次數(shù)青葉中的表達(dá)量情況。

由圖8 發(fā)現(xiàn)這6 個(gè)基因在不同狀態(tài)的青葉中均有較高表達(dá)量，不同做青方式下6 個(gè)基因表達(dá)量呈現(xiàn)出不一樣的變化趨勢(shì)，6 個(gè)基因均在LX4 有最高的表達(dá)量。

圖8 不同做青方式和做青次數(shù)6 個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of 6 genes in different ways and time

不同做青方式間，P1 基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)一致，隨著做青次數(shù)的增加逐漸上升；P2 基因的表達(dá)量隨著做青次數(shù)增加先上升，做青后期下降；P3 基因的表達(dá)量在做青過(guò)程中先升后降，整體的變化趨勢(shì)為上升。

傳統(tǒng)做青方式和連續(xù)慢速做青方式青葉的G1 基因的表達(dá)量在第一次做青后皆呈下降趨勢(shì)，隨后發(fā)生小幅度波動(dòng)，在第四次做青時(shí)達(dá)到峰值，做青結(jié)束時(shí)降低；G2 和G3 基因表達(dá)量的變化與G1 同步。

研究發(fā)現(xiàn)，-葡萄糖苷酶存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞壁以及液泡中，在烏龍茶做青過(guò)程中對(duì)香氣物質(zhì)形成有一定意義。在完整細(xì)胞中，由于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等阻隔，反應(yīng)底物無(wú)法與酶類充分接觸發(fā)生生化反應(yīng)。LX4 樣品中6 個(gè)基因的表達(dá)量在所有處理中最高，其可能為在連續(xù)慢速做青過(guò)程中，葉片與滾筒持續(xù)緩慢發(fā)生摩擦，在LX4 時(shí)最多細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞中原本被細(xì)胞膜、細(xì)胞壁阻隔的茶多酚等反應(yīng)底物與酶類接觸，從而使酶活性提高，相關(guān)的基因表達(dá)量也提高。

3 結(jié)論

本研究采用了兩種不同的做青方式，其一是傳統(tǒng)的烏龍茶做青方式，即搖青與晾青交替進(jìn)行，并且在不同階段搖青與晾青的時(shí)間長(zhǎng)度與比例有差異；另一種則是本研究的考察重點(diǎn)，連續(xù)做青，通過(guò)比較不同做青方式和做青次數(shù)烏龍茶物質(zhì)成分與品質(zhì)差，結(jié)果表明：傳統(tǒng)做青和連續(xù)慢速做青在水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、兒茶素和嘌呤生物堿方面表現(xiàn)出相似的總體變化趨勢(shì)；但是，這些變化的程度不同。在做青過(guò)程中，連續(xù)慢速做青的香氣化合物的變化范圍小于傳統(tǒng)做青。連續(xù)慢速做青烏龍茶的感官評(píng)價(jià)得分略高于傳統(tǒng)做青?？傮w而言，連續(xù)慢速是一種適用于烏龍茶加工的新技術(shù)，具有良好的應(yīng)用前景。