馮翰杰，李濤，楊梅，鞏文杰，張軍

（天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392）

柿樹是一種柿科（Ebenaeeae）柿屬（Diospyros）落葉喬木，主要種植于亞熱帶和中溫帶，產(chǎn)區(qū)集中于中國、日本和韓國等地，此外朝鮮、菲律賓也有種植，生長環(huán)境溫暖且光照充足。柿樹原產(chǎn)于我國長江流域，在我國大部分地區(qū)均有栽種，已有千年種植歷史[1]。研究發(fā)現(xiàn)，每100 g 柿子中含糖28 g，其他碳水化合物25 g，蛋白質(zhì)1.36 g，脂肪0.2 g，磷19 mg，鈣10 mg，鐵8 mg，維生素C 16 mg，還含有胡蘿卜素、氨基酸和多酚類物質(zhì)[2]，易被人體消化吸收。柿子在抗動(dòng)脈硬化[3]、預(yù)防心血管疾病[4]、抗腫瘤和抗痙攣[5]、止血[6]、降低膽固醇[7]等方面發(fā)揮著重要作用。還有研究表明，柿子在治療皮膚病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、心血管疾病和泌尿系統(tǒng)疾病等方面也有一定的藥用價(jià)值[8-10]。

天津地區(qū)柿子產(chǎn)量較大，開發(fā)柿子酒可以避免柿子浪費(fèi)，不同的發(fā)酵工藝對柿子酒香氣成分的形成有很大影響。本試驗(yàn)采用電子鼻、氣相-質(zhì)譜及感官評價(jià)3 種技術(shù)手段對不同發(fā)酵方式柿子酒的香氣成分進(jìn)行研究，對比3 種不同發(fā)酵方式對柿子酒香氣成分的影響，并通過主成分分析，確定不同發(fā)酵方式柿子酒的主要香氣物質(zhì)，對比香氣物質(zhì)差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿子，購于天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場；酒樣，實(shí)驗(yàn)室不同發(fā)酵工藝的柿子酒；標(biāo)準(zhǔn)品，正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液nC6-nC16；氯化鈉，廣東化學(xué)試劑廠；SY 安琪酵母，安琪酵母有限公司；亞硫酸，天津大茂化學(xué)試劑廠；果膠酶，法國LAFFORT 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋，江蘇科研儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；7890A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；HeraclesII快速氣相電子鼻-氣味分析儀，法國AlphaMOS 公司；IT-09A5 磁力攪拌器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA2004 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵工藝

1.3.1.1 發(fā)酵方式

果漿發(fā)酵：將柿子清洗瀝干經(jīng)機(jī)械破碎，得到柿子果漿（加入亞硫酸、果膠酶），調(diào)整柿子果漿的糖度和酸度，加入酵母發(fā)酵，發(fā)酵后去除果渣，將柿子果漿酒澄清、除菌過濾、裝瓶儲(chǔ)藏。

清汁發(fā)酵：將柿子清洗瀝干經(jīng)機(jī)械破碎，得到柿子果漿（加入亞硫酸、果膠酶），將柿子果漿擠壓過濾得到柿子清汁，調(diào)整柿子清汁的糖度和酸度，加入酵母發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后終止發(fā)酵，將柿子清汁酒澄清、除菌過濾、裝瓶儲(chǔ)藏。

皮渣發(fā)酵：將柿子清汁制作過程中的柿子皮渣放入發(fā)酵罐，調(diào)整柿子皮渣的糖度和酸度，加入酵母發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后去除果渣，將柿子皮渣酒澄清、除菌過濾、裝瓶儲(chǔ)藏。

1.3.1.2 發(fā)酵方式的選擇

以SY 安琪酵母為發(fā)酵菌種，用白砂糖調(diào)整糖度為200 g/L，酒石酸調(diào)整酸度為7.5 g/L，在20 ℃條件下發(fā)酵，然后對不同發(fā)酵方式生產(chǎn)的柿子酒進(jìn)行理化分析與感官評定，選擇合適的發(fā)酵方式。

1.3.2 HeraclesⅡ快速氣相電子鼻-氣味分析儀的

程序設(shè)置及方法[11]

1.3.2.1 常規(guī)參數(shù)

柱溫箱溫度40 ℃，進(jìn)樣口溫度200 ℃，進(jìn)樣口壓力25.0 kPa，進(jìn)樣口流量10.0 mL/min，閥溫度250 ℃，捕集阱溫度40 ℃，檢測器溫度250 ℃，分流10.0 mL/min，柱壓80.0 kPa。

1.3.2.2 試驗(yàn)參數(shù)

初始條件：初始爐溫為50 ℃，以3 ℃/s 的速度升溫至250 ℃，數(shù)據(jù)采集時(shí)間為110 s，數(shù)據(jù)采集周期為0.01 s。

1.3.2.3 進(jìn)樣前處理方法及進(jìn)樣方式

將裝有5 mL待測酒樣的頂空瓶置于恒溫水浴鍋中，40 ℃下平衡10 min，在頂空瓶中抽取500 μL 氣體，手動(dòng)進(jìn)樣。每個(gè)樣品進(jìn)行5 次平行試驗(yàn)。

1.3.3 頂空固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（HS

SPME-GC/MS）試驗(yàn)

1.3.3.1 頂空固相微萃取[12]

將10 mL 酒樣置于裝有磁力攪拌器的頂空瓶（15 mL）中，加3 g NaCl，加蓋封口，平衡30 min。將PDMS 纖維頭插入頂空瓶，37 ℃恒溫水浴鍋中萃取30 min，然后將PDMS 纖維頭插入進(jìn)樣口，在270 ℃下解析10 min，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。

1.3.3.2 氣相色譜條件[13]

N-NOWAX 柱（60 mm×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫：在初始溫度40 ℃下維持10 min，然后以5 ℃/min 的升溫速度將溫度升至260 ℃并維持5 min，F(xiàn)ID 檢測器溫度為260 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為He，流量1 mL/min，不分流進(jìn)樣，GC 運(yùn)行時(shí)間約為50 min。

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

EI 電離源，電離電壓為70 eV，離子源溫度為230 ℃，掃描范圍為30～500 u。

1.3.4 柿子酒感官評價(jià)

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和GB/T10220—2012《感官分析方法學(xué)總論》制定柿子果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 柿子果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方式柿子酒揮發(fā)性香氣成分分析

2.1.1 電子鼻對不同發(fā)酵方式柿子酒進(jìn)行主成分分析[14]

由圖1 可知，第一主成分對數(shù)據(jù)信息貢獻(xiàn)率為99.751%，第二主成分貢獻(xiàn)率為0.149%，兩個(gè)主成分的總貢獻(xiàn)率為99.900%，表明此圖譜能夠較好地反應(yīng)所測樣品中氣味數(shù)據(jù)的完整性。識(shí)別指數(shù)為92，在80～100 之間，表示該數(shù)據(jù)區(qū)分分析結(jié)果為有效結(jié)果，識(shí)別指數(shù)值越大，區(qū)分效果越佳。

圖1 不同發(fā)酵方式柿子酒的主成分分析

由圖2 可知，3 種原料的樣本之間有差異，其中果漿發(fā)酵與清汁發(fā)酵、皮渣發(fā)酵的柿子酒相對氣味距離均較遠(yuǎn)，差異較大；清汁發(fā)酵、皮渣發(fā)酵的柿子酒氣味距離相對較近，差異較小。在對柿果加工過程中，柿果中部分成分會(huì)被擠壓過濾出去，導(dǎo)致果漿發(fā)酵與清汁發(fā)酵、皮渣發(fā)酵相比，氣味差距稍大。

圖2 不同發(fā)酵方式柿子酒的主成分分析三維圖

2.1.2 電子鼻對不同發(fā)酵方式柿子酒進(jìn)行判別因子分析

由圖3 可知，第一區(qū)分指數(shù)達(dá)到89.44%，第二區(qū)分指數(shù)達(dá)到10.56%，二者累計(jì)區(qū)分指數(shù)合計(jì)達(dá)到100%，說明判別因子分析能夠更好地顯示3種發(fā)酵方式柿子酒間的差異。從圖3 還可以看出，皮渣發(fā)酵和清汁發(fā)酵的香氣成分差異較小，果漿發(fā)酵與皮渣發(fā)酵和清汁發(fā)酵樣品間的香氣成分差異較大。

圖3 不同發(fā)酵方式的柿子酒的判別因子分析

2.1.3 電子鼻對不同發(fā)酵方式柿子酒揮發(fā)性香氣成分的定性分析

由表2 可知，3 種發(fā)酵方式柿子酒的香氣成分中大部分化合物都有存在，其中，醇類、酯類等分子量較小的揮發(fā)性物質(zhì)占絕大多數(shù)。皮渣發(fā)酵、清汁發(fā)酵、果漿發(fā)酵柿子酒的香氣成分中醇類和酯類分別約占50%、52%和46%。3 種方式發(fā)酵柿子酒香氣成分中都含有3-戊醇（果香味）、乙酸丙酯（梨和草莓樣果香）、辛醇（強(qiáng)烈的柑橘香氣）、己酸丁酯（特有的菠蘿香氣），使柿子酒增添了獨(dú)特風(fēng)味。皮渣發(fā)酵中含有β-紫羅酮（紫羅蘭、甜果香），清汁發(fā)酵中含有正壬基苯和磷酸三丁酯，果漿發(fā)酵中含有丙二醇甲醚，表示不同發(fā)酵方式柿子酒的香氣成分存在差異。

表2 不同發(fā)酵方式柿子酒中可能的風(fēng)味信息

續(xù)表

2.1.4 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析不同發(fā)酵方式柿子酒的香氣成分

由表3 可知，異戊醇（蘋果白蘭地香氣、辛辣味）、正己醇（草本植物、青草味）、丁二酸二乙酯（愉快氣味）、乙酸異丁酯（柔和水果酯香味）等是柿子酒香氣成分中相對峰面積最高的物質(zhì)，為柿子酒香氣成分中的主要成分。

表3 不同發(fā)酵方式的柿子酒樣香氣成分的GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表

由圖4 可知，3 種發(fā)酵方式柿子酒的香氣成分大部分為醇類、酯類、醛類，醇類是柿子酒香氣的主要成分。皮渣發(fā)酵、清汁發(fā)酵、果漿發(fā)酵總醇類相對峰面積分別為39.62%、33.47%、45.32%，其中異戊醇相對峰面積最高，分別為32.03%、32.03%、29.32%。皮渣發(fā)酵、清汁發(fā)酵、果漿發(fā)酵總酯類相對峰面積分別為2.79%、21.65%、3.53%，其中丁二酸二乙酯相對峰面積最高，分別為1.18%、0.04%、1.39%。皮渣發(fā)酵、清汁發(fā)酵、果漿發(fā)酵總?cè)╊愊鄬Ψ迕娣e分別為 12.56%、0.00%、7.97%，其中縮醛相對峰面積最高，分別為12.43%、0.00%、7.85%。酸類、烷類、酚類和其他類物質(zhì)含量較低，對酒的香氣起重要的修飾作用。清汁發(fā)酵柿子酒香氣成分中酯類數(shù)量最多，為27 種，果漿發(fā)酵次之。清汁發(fā)酵的柿子酒香氣更濃郁，具有典型性。

圖4 柿子酒中香氣物質(zhì)分類

2.1.5 不同發(fā)酵方式柿子酒的感官分析

由圖5 可知，根據(jù)柿子果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)，對3 種發(fā)酵方式柿子酒進(jìn)行感官評價(jià)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，清汁發(fā)酵柿子酒香氣得分與皮渣發(fā)酵比較接近，在柿子壓榨過程中香氣成分有所損失，與電子鼻檢測結(jié)果相同。清汁發(fā)酵柿子酒綜合感官評分大于果漿發(fā)酵和皮渣發(fā)酵柿子酒，與氣相-質(zhì)譜檢測到清汁發(fā)酵柿子酒香氣成分較多的結(jié)果相同。

圖5 不同發(fā)酵方式的柿子酒感官評價(jià)雷達(dá)圖

2.2 主成分分析

用SPSS 軟件對表3 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到兩個(gè)主成分，如表4 所示。其中第一主成分貢獻(xiàn)率為59.027%、第二主成分貢獻(xiàn)率為40.973%。

表4 主成分分析中解釋的總方差

由表5 表明，因子載荷量＞0.950 的物質(zhì)共有89 種，在第一主成分中有48 種，其中有35 種在清汁發(fā)酵的樣品中檢測出，有25 種在皮渣發(fā)酵的樣品中檢測出，有23 種在果漿發(fā)酵的樣品中檢測出。第二主成分中有30 種，其中有26 種在皮渣發(fā)酵的樣品中檢測出，有6 種在清汁發(fā)酵的樣品中檢測出，有6 種在果漿發(fā)酵的樣品中檢測出。

表5 成分矩陣

主成分分析可知，主成分為兩類香氣，一類香氣在皮渣發(fā)酵酒和果漿發(fā)酵酒中基本一致，主要為縮醛、丁二酸二乙酯、3-羥基-2-丁酮，相比于果漿發(fā)酵，皮渣發(fā)酵酒的縮醛成分更高；清汁發(fā)酵酒的主要香氣成分為乙酸異戊酯、2-糠酸乙酯、乳酸乙酯。二類香氣在皮渣發(fā)酵酒中種類最多、含量最高，主要為2-甲基丁醇，清汁發(fā)酵和果漿發(fā)酵酒的香氣成分種類相同，主要成分為S-（-）-2-甲基-1-丁醇，但其在果漿發(fā)酵酒中含量遠(yuǎn)高于清汁發(fā)酵。

一類香氣在皮渣發(fā)酵酒和果漿發(fā)酵酒中的含量分別為16.37%和11.99%，且種類相近，而清汁發(fā)酵酒香氣物質(zhì)含量為22.49%。因此，一類主成分在皮渣發(fā)酵酒和果漿發(fā)酵酒中基本相同，和清汁發(fā)酵酒對比明顯。二類香氣在皮渣發(fā)酵酒和果漿發(fā)酵酒中的含量分別為8.06%和6.59%，在清汁發(fā)酵酒中的含量僅為0.97%，對比結(jié)果與一類主成分類似。

如表6 所示，一類香氣在皮渣發(fā)酵、清汁發(fā)酵、果漿發(fā)酵酒中體積占比分別為16.37%、22.49%和11.99%，其中皮渣發(fā)酵縮醛占比12.43%，丁二酸二乙脂占比1.18%；清汁發(fā)酵乙酸異戊酯占比12.43%，2-糠酸乙酯占比6.76%；果漿發(fā)酵縮醛占比7.85%，丁二酸二乙脂占比1.39%。二類香氣在皮渣發(fā)酵、清汁發(fā)酵、果漿發(fā)酵酒中體積占比分別為8.06%、0.97%和6.59%。其中皮渣發(fā)酵2-甲基丁醇占比6.76%，清汁發(fā)酵S-（-）-2-甲基-1-丁醇占比0.87%，果漿發(fā)酵S-（-）-2-甲基-1-丁醇占比6.39%。通過對比成分一和成分二得知，皮渣發(fā)酵酒的香氣物質(zhì)種類最多，清汁發(fā)酵酒的香氣成分以成分一為主，果漿發(fā)酵酒的香氣種類和含量較少。3 類不同發(fā)酵方式的柿子酒中，皮渣發(fā)酵和果漿發(fā)酵的香氣成分具有相關(guān)性，清汁發(fā)酵的香氣成分和另外2 種發(fā)酵酒的香氣成分具有很大差別。

表6 各類香氣物質(zhì)占比

3 結(jié)論

利用電子鼻、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用及感官評價(jià)3 種技術(shù)從不同方面對柿子酒揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行了檢測和評價(jià)。

3.1 電子鼻對不同發(fā)酵方式柿子酒揮發(fā)性香氣成分分析

通過電子鼻主成分分析和判別因子分析發(fā)現(xiàn)，清汁發(fā)酵與皮渣發(fā)酵柿子酒中揮發(fā)性香氣成分差異較小，與果漿發(fā)酵柿子酒中揮發(fā)性香氣成分差異較大。通過電子鼻定性分析，清汁發(fā)酵、皮渣發(fā)酵、果漿發(fā)酵柿子酒香氣成分中，醇類酯類分別約占52%、50%和46%。3 種方式發(fā)酵柿子酒香氣成分中都含有3-戊醇（果香味）、乙酸丙酯（梨和草莓樣果香）、辛醇（強(qiáng)烈的柑橘香氣）、己酸丁酯（特有的菠蘿香氣），為柿子酒增加了獨(dú)特風(fēng)味。

3.2 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用對不同發(fā)酵方式柿子酒揮發(fā)性香氣成分分析

通過氣相-質(zhì)譜聯(lián)用對不同發(fā)酵方式柿子酒揮發(fā)性香氣成分分析可知，異戊醇、正己醇、乙酸異丁酯等物質(zhì)相對峰面積最大，是柿子酒香氣成分中的主要成分。清汁發(fā)酵柿子酒揮發(fā)性香氣成分中脂類數(shù)量多，為27 種，果漿發(fā)酵次之。因此，清汁發(fā)酵的柿子酒酒香更濃郁，更具典型性，感官得分最高。

3.3 柿子酒中主要香氣成分

皮渣發(fā)酵柿子酒主要香氣物質(zhì)為縮醛、丁二酸二乙酯、3-羥基-2-丁酮、2-甲基丁醇。清汁發(fā)酵柿子酒主要香氣成分為乙酸異戊酯、2-糠酸乙酯、乳酸乙酯、S-（-）-2-甲基-1-丁醇。果漿發(fā)酵柿子酒主要香氣物質(zhì)為縮醛、丁二酸二乙酯、3-羥基-2-丁酮、S-（-）-2-甲基-1-丁醇。