葛侖華，江博赟，孫敬鋒，呂愛(ài)軍，胡秀彩，陳麗梅

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）具有肉質(zhì)鮮美、個(gè)體大、生長(zhǎng)快等優(yōu)良性狀，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[1]。近年來(lái)隨著工廠(chǎng)化、集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，半滑舌鰨病害發(fā)生頻繁，嚴(yán)重降低了養(yǎng)殖的成活率[2]。腸道菌群在水產(chǎn)動(dòng)物健康、生長(zhǎng)、生理等多個(gè)方面發(fā)揮了重要作用，其結(jié)構(gòu)組成與多樣性對(duì)宿主健康具有重要影響[3-4]。對(duì)半滑舌鰨腸道菌群的研究有助于了解宿主與其腸道菌群之間的相互作用關(guān)系，并為疾病監(jiān)控及預(yù)防提供新思路[5-7]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究集中于分析水生動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)[8]。早期研究主要是對(duì)獲得的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行鑒定分析，但這種方法的應(yīng)用局限于可培養(yǎng)微生物，只能鑒定到少數(shù)的細(xì)菌群落，無(wú)法深入了解菌群組成結(jié)構(gòu)[9]。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，使用高通量測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA 分子進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)分析微生物的單一基因或全基因組，可以鑒定出大部分腸道菌群的類(lèi)別[10]。目前具有代表性的高通量測(cè)序技術(shù)主要有454 焦磷酸測(cè)序、Solexa 聚合酶合成測(cè)序、SOLiD 連接酶測(cè)序[11]。以Roche 454 和Illumina MiSeq 為代表的高通量測(cè)序平臺(tái)也已應(yīng)用在半滑舌鰨[5]、對(duì)蝦（Penaeus monodon）[12]、尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）[13]等多種水生動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析。

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為腸道菌群結(jié)構(gòu)分析研究提供了技術(shù)支持。如何高質(zhì)量地從樣品中獲得微生物基因組DNA是運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析腸道菌群的關(guān)鍵步驟。理想的微生物DNA提取方法既要考慮到DNA 產(chǎn)量和純度，又要盡量避免DNA 的降解及降低試劑材料的成本[14]。目前有很多用于提取DNA 的試驗(yàn)方法，如酶促DNA提取技術(shù)[15]、超聲波破碎技術(shù)[16]、玻璃珠機(jī)械裂解技術(shù)[17]、磁性分離技術(shù)[18]。

不同試驗(yàn)方法提取的DNA，經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定后，對(duì)應(yīng)的菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果存在偏差[19]。溫崇慶等[20]用三種不同DNA 提取試劑盒（Omega，美國(guó)）提取凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的腸道菌群DNA，并經(jīng)高通量測(cè)序分析，得到的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)分析結(jié)果差異顯著。本試驗(yàn)室曾以溶菌酶結(jié)合超聲波裂解法（Combination of Lysozyme and Ultrasonic Lysis，CLU）、Zirmil-beating 細(xì)胞破碎法（Zirmil-beating Cell Disruption，ZBC）和德國(guó)Qiagen 公司的QIA 試劑盒法（QIA）三種方法提取錦鯉（Cyprinus carpio）腸道菌群DNA，發(fā)現(xiàn)其高通量測(cè)序結(jié)果存在差異[21]。但目前不同DNA 提取方法對(duì)半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果的影響未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以CLU、ZBC 和QIA 三種方法提取半滑舌鰨腸道菌群DNA，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析不同DNA提取方法引起的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果偏差，旨在為半滑舌鰨腸道菌群多樣性研究方法，特別是DNA 提取策略提供參考資料，同時(shí)有助于全面了解健康半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 半滑舌鰨腸道微生物收集

試驗(yàn)用半滑舌鰨購(gòu)于天津市某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)（30.0±2.5）cm，體重（220.0±6.5）g，將魚(yú)運(yùn)至天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物疾病及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在溫度為20 ℃，鹽度為30 的海水中暫養(yǎng)一周，每日投喂顆粒飼料兩次。選取3 尾健康半滑舌鰨用于腸道微生物的收集。首先用75%酒精棉球擦拭魚(yú)體表，然后用無(wú)菌解剖刀剖開(kāi)腹腔。從腹腔取出完整腸道，并將腸內(nèi)容物收集至50 mL 離心管中。將樣品與10 mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2）混合，渦旋震蕩30 s，然后將懸濁液在4 ℃，150 g 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的無(wú)菌50 mL 離心管中。隨后在4 ℃，2 700 g離心5 min，棄上清后獲得沉淀。最后用3 mL PBS重新懸浮沉淀，將腸道菌群懸液平均分為三份，每份1 mL，分別用CLU、ZBC、QIA 三種方法進(jìn)行DNA 提取。

1.2 DNA 的提取

1.2.1 CLU 方法

參照HAN等[22]應(yīng)用CLU方法提取腸道菌群基因組DNA，將DNA 沉淀用1 mL 70%乙醇洗滌兩次，風(fēng)干，隨后用100 μL 50 ℃預(yù)熱的TE 緩沖液溶解。DNA 放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ZBC 方法

參照J(rèn)IANG 等[23]應(yīng)用ZBC 方法提取菌群基因組DNA，最后將EP 管倒置15 min，待DNA 沉淀風(fēng)干，然后用100 μL TE 緩沖液溶解DNA。DNA放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 QIA 方法

將1 mL 腸道菌群懸液在4 ℃，2 700 g 離心5分鐘，用220 μL PBS 重懸細(xì)菌沉淀。然后應(yīng)用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen，德國(guó)）提取腸道菌群DNA。最后用100 μL TE 緩沖液洗脫DNA。提取的DNA 放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rDNA 高通量測(cè)序

選取16S rRNA 的V3-V4 可變區(qū)基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增所用的引物為341F（5′-CCC TACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGC WGCAG-3′）和805R（5′-GACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTA ATCC-3′）。PCR 反應(yīng)體系包含10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 10 ng，正反向引物（50 μmol/L）各0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL，加無(wú)菌超純水至50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。然后引入Illumina 橋式PCR 兼容引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，模板DNA 20 ng，正反向引物（50 μmol/L）各0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL，加無(wú)菌超純水至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，5 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，使用Qubit 2.0 核酸和蛋白定量?jī)x（Thermo Scientific，美國(guó)）對(duì)DNA 含量進(jìn)行測(cè)定。在每個(gè)腸道菌群DNA 樣品中摻入獨(dú)特的條形碼，利用Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

完成測(cè)序后，根據(jù)樣品獨(dú)特的條形碼將測(cè)序讀數(shù)分配給每個(gè)樣品。數(shù)據(jù)分析的方法參照HAN等[21]，首先使用FLASH 合并來(lái)自原始DNA 片段的成對(duì)讀數(shù)[24]，然后使用質(zhì)量控制程序，包括剪切條形碼和引物、通過(guò)PRINSEQ 軟件過(guò)濾低質(zhì)量讀數(shù)、校正潛在的測(cè)序錯(cuò)誤、應(yīng)用UCHIME 去除嵌合體[25]。最后，計(jì)算Rarefaction，Chao1 和Simpson指數(shù)進(jìn)行Alpha 多樣性分析，計(jì)算加權(quán)UniFrac 度量距離進(jìn)行Beta 多樣性分析。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，采用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（RDP）分類(lèi)器[26]對(duì)97%相似度水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并在門(mén)、屬水平，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品的菌落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控與OTU 聚類(lèi)分析

將CLU、ZBC、QIA 三種方法提取的DNA 樣品用于高通量測(cè)序分析，得到的測(cè)序序列讀數(shù)（filtered-number）分別為32 215、38 745、25 122（表1）。這些序列的平均長(zhǎng)度分別為420.0 bp、417.0 bp、418.7 bp。根據(jù)97%的相似性聚類(lèi)后，所有腸道細(xì)菌樣品共發(fā)現(xiàn)7 516 個(gè)OTU（圖1）。CLU、ZBC、QIA 方法對(duì)應(yīng)樣品中的OTU 數(shù)量分別為3 761、3 859、2 850（表1），其中三個(gè)樣品共有的OTU數(shù)量為881，分別占三種樣本各自O(shè)TU數(shù)量的23.42%、22.82%、30.91%。

表1 三種方法提取的DNA樣品的序列讀數(shù)、OTU、Alpha多樣性指數(shù)

圖1 三種DNA 提取方法對(duì)應(yīng)樣品中的OTU 數(shù)目

2.2 Alpha 多樣性分析

三種方法對(duì)應(yīng)樣本的稀釋曲線(xiàn)都接近平緩，其中CLU 和ZBC 對(duì)應(yīng)樣本呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，與QIA 相比，兩者曲線(xiàn)斜率更大（圖2a）。在Alpha多樣性分析中，CLU、ZBC、QIA 方法對(duì)應(yīng)的Chao1指數(shù)分別為5 668、5 868、4 090（圖2b），Simpson指數(shù)分別為0.021、0.022、0.018（圖2c），QIA 方法對(duì)應(yīng)的Chao1 和Simpson 指數(shù)均低于CLU 和ZBC 方法。

圖2 Alpha 多樣性分析

2.3 半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析

在門(mén)的水平上，三種方法提取的DNA 樣品中共鑒定出31 個(gè)細(xì)菌門(mén)。其中CLU、ZBC、QIA 方法對(duì)應(yīng)樣品分別鑒定到26、29、28 個(gè)細(xì)菌門(mén)，共有的細(xì)菌門(mén)25 個(gè)。10 個(gè)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）（表2）。在CLU、ZBC、QIA 對(duì)應(yīng)的樣品中，這10 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均被鑒定到，且大部分序列屬于前四種細(xì)菌門(mén)（變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、螺旋菌門(mén)、擬桿菌門(mén)），所占比例分別為85.94%、86.88%、83.45%（圖3）。6 個(gè)存在差異的菌門(mén)為嗜熱絲菌門(mén)（Caldiserica）、奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）、脫鐵桿菌門(mén)（Deferribacteres）、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）、待定菌群（Candidate_division_OD1 和 Candidate_division_WS3）。這些類(lèi)群均為低豐度菌群，這表明三種方法對(duì)一些豐度較低的菌群類(lèi)別鑒定結(jié)果存在偏差。

圖3 三種方法提取的DNA 樣品中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相對(duì)豐度

表2 三種方法提取的DNA樣品間優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和OTU豐度比較

在屬的水平上，所有樣品序列共鑒定出799個(gè)屬。CLU、ZBC、QIA 樣品分別鑒定到593、599、495 個(gè)屬，三個(gè)樣品共有的細(xì)菌屬362 個(gè)。以占樣品平均豐度≥1%的屬作為優(yōu)勢(shì)菌屬，CLU 和ZBC各有20 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，其中有14 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬為兩者共有；而QIA 有19 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，與CLU、ZBC均共享13 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，三個(gè)樣品之間共有的優(yōu)勢(shì)菌屬為12 個(gè)。其中10 個(gè)最高豐度的菌屬為短螺旋體屬（Brevinema）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）、肉桿菌屬（Carnobacterium）、類(lèi)似芽球菌屬（Blastocatella）、乳球菌屬（Lactococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（圖4）。其中CLU、ZBC 方法鑒定到的豐度最高菌屬均為短螺旋體屬（Brevinema），分別占樣品的10.61%和9.15%，這個(gè)菌屬在QIA 中僅為2.48%。QIA 方法提取的樣品中豐度最高菌屬為微小桿菌屬（Exiguobacterium），在CLU 中僅為第四優(yōu)勢(shì)屬。這表明在門(mén)、屬水平上，三種不同DNA 提取方法導(dǎo)致了半滑舌鰨腸道菌群測(cè)序分析結(jié)果的差異。

圖4 三種方法提取的DNA 樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度

2.4 Beta 多樣性分析

基于UniFrac 距離計(jì)算樣本間的距離矩陣來(lái)衡量三種樣本間物種組成的相似度，發(fā)現(xiàn)CLU 和QIA 方法提取的樣品之間的微生物群落結(jié)構(gòu)和物種豐富度更相似（圖5）。

圖5 基于距離的加權(quán)UniFrac 分析三種DNA 樣本相似性

3 討論

3.1 影響DNA 提取效率的因素

高通量測(cè)序技術(shù)具有定量準(zhǔn)確和測(cè)序深度高的優(yōu)點(diǎn)，能夠更真實(shí)地反映菌群結(jié)構(gòu)特征，已廣泛應(yīng)用于分析復(fù)雜的腸道菌群結(jié)構(gòu)[27]。高質(zhì)量的DNA 提取是準(zhǔn)確測(cè)序的前提，現(xiàn)已有多種提取腸道菌群基因組DNA 的方法，但提取效率各不相同[28]。無(wú)論何種方法，DNA 的提取都需要細(xì)胞裂解和核酸純化兩個(gè)步驟，通常是利用物理、化學(xué)或酶解作用裂解細(xì)胞，使DNA 釋放出來(lái)，進(jìn)一步純化與裂解體系中其他雜質(zhì)分離。不同提取方法可能對(duì)裂解效果具有明顯差異，如何提高細(xì)胞裂解效率是腸道菌群多樣性研究中關(guān)鍵問(wèn)題。在DNA 提取過(guò)程中，不同的細(xì)菌類(lèi)群（如革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌等）對(duì)使用的化學(xué)試劑表現(xiàn)出不同程度的抗性[29]。常用的化學(xué)試劑有十二烷基硫酸鈉（SDS）和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）。SDS 是一種陰離子表面活性劑，可與膜脂蛋白作用從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；而CTAB 是一種陽(yáng)離子去污劑，能夠溶解細(xì)胞膜并與核酸形成復(fù)合物[30]。化學(xué)法具有成本低、DNA 提取產(chǎn)量高、降解少的優(yōu)點(diǎn)[31]。但化學(xué)試劑并不能穩(wěn)定地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，可能會(huì)阻礙DNA 釋放或在裂解過(guò)程中破壞DNA，這些因素導(dǎo)致微生物群落中不同細(xì)菌類(lèi)群的低估或高估。以往研究表明，溶菌酶可以選擇性分解微生物細(xì)胞壁而不破壞其他成分[32]，但溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌DNA 提取效率不高[33]。為了解決這一問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室利用CLU 方法將溶菌酶和超聲波裂解法結(jié)合以提取不同類(lèi)群細(xì)菌基因組DNA。在本研究中采用CLU 方法提取的半滑舌鰨腸道菌群DNA 經(jīng)測(cè)序分析后，鑒定到較多的細(xì)菌類(lèi)群。這表明使用適當(dāng)?shù)某暡ㄆ扑樘幚韥?lái)裂解革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁，可以使DNA 有效地釋放。此外，該方法中使用的水解酶、蛋白酶K 和RNase A 的協(xié)同作用也有助于DNA 釋放和純化。

3.2 不同DNA 提取方法引起菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果的差異

迄今，對(duì)于魚(yú)類(lèi)腸道菌群基因組DNA 的提取方法尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用三種不同方法提取半滑舌鰨腸道菌群DNA，所得樣品經(jīng)過(guò)測(cè)定得到的OTU 只有不到50%是共有的。與QIA 樣品相比，CLU 和ZBC 樣品中測(cè)定得到的腸道菌群OTU 數(shù)、Alpha 多樣性指數(shù)（Chao1 和Simpson）明顯較高。

在門(mén)水平上，螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）豐度在CLU 和ZBC 樣品中分別為9.18%和10.73%，而在QIA 中僅為2.52%。在屬水平上，短螺旋體屬（Brevinema）的豐度在CLU 和ZBC 樣品中分別為10.61%和9.15%，而在QIA 中僅為2.48%。不同細(xì)菌類(lèi)群豐度的差異代表相應(yīng)基因序列豐度不同，這可能是由于不同DNA 提取方法對(duì)腸道菌群DNA 的提取效率不同。本研究通過(guò)三種方法提取DNA，鑒定到的豐度較高的細(xì)菌門(mén)類(lèi)是相同的，但對(duì)于低豐度的細(xì)菌門(mén)類(lèi)不能完全鑒定到，在屬的水平上也發(fā)現(xiàn)了相似情況。因此，同時(shí)選用多種不同方法提取DNA，用于高通量測(cè)序分析，最后得到的菌群組成信息更加全面、準(zhǔn)確。

3.3 半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)特征

三種方法提取的DNA樣品經(jīng)高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨腸道菌群中豐度最高的菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria），其次是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），這與張正等[34]的研究結(jié)果相似，表明這些菌門(mén)可能是半滑舌鰨腸道內(nèi)核心菌群。本研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨腸道菌群中含有較高豐度的螺旋菌門(mén)（Spirochaetae），這與在錦鯉（Cyprinus carpiovar.Koi）[21]和異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[35]中的研究結(jié)果不同。由此推測(cè)，不同的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、飲食習(xí)性和生活環(huán)境等因素可能影響?hù)~(yú)類(lèi)腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成。另外，在患病半滑舌鰨中螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）豐富度明顯降低[36]，這表明螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）的豐富度可能與半滑舌鰨健康狀況密切相關(guān)。

本研究表明，不同方法提取的DNA 經(jīng)高通量測(cè)序分析鑒定到的主要優(yōu)勢(shì)菌群類(lèi)別是一致的，但對(duì)一些豐度較低的菌群類(lèi)別鑒定的結(jié)果存在偏差。此外，本研究揭示了健康半滑舌鰨腸道核心菌群主要包括變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）。研究結(jié)果為半滑舌鰨腸道菌群多樣性研究方法，特別是DNA 提取策略提供了參考資料，同時(shí)有助于全面了解健康半滑舌鰨的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征。