王貞利，王俊斌,b,通信作者，王敏，楊宗芬，王海鳳

（天津農(nóng)學(xué)院，a.基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，b.化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，c.農(nóng)業(yè)分析測(cè)試中心，天津 300392）

冰菜（Mesembryanthemum crystallinum）為番杏科日中花屬1 年或2 年生草本植物，原產(chǎn)于非洲南部，分布廣泛，具有極強(qiáng)的抗旱性和耐鹽堿性，可以在低鹽堿化土壤中維持正常生長(zhǎng)，生長(zhǎng)周期為3～6個(gè)月，是植物耐鹽性研究的代表植物之一。冰菜因其獨(dú)特的口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在很多國(guó)家作為一種新興健康蔬菜被人們食用[1]。研究表明，食用含有酚類和黃酮類化合物等植物化學(xué)物質(zhì)的功能性食品可以預(yù)防各類疾病。冰菜中含有黃酮、多酚、超氧化物歧化酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶等多種抗氧化活性高的物質(zhì)和酶類[2-3]。多酚是具有苯環(huán)并結(jié)合了多個(gè)羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的總稱[4]。天然來(lái)源的植物多酚具有顯著的抗氧化活性，可作為抗氧化劑、抑菌劑、防腐劑等廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)保健、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。天然多酚類物質(zhì)的抗氧化活性一直備受關(guān)注，尤其是植物來(lái)源的天然抗氧化劑[5-6]。植物多酚通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞膜的形成，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)容物發(fā)生滲透，抑制了細(xì)菌產(chǎn)酸及產(chǎn)霉活性等[7]。

已有研究證實(shí)冰菜多酚類提取物具有較高的抗氧化能力[8]，說(shuō)明冰菜多酚具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于冰菜活性物質(zhì)提取和應(yīng)用的相關(guān)研究較少，限制了其進(jìn)一步綜合利用。本研究主要對(duì)冰菜多酚的提取工藝進(jìn)行探索和優(yōu)化，并測(cè)定其對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥基自由基的清除能力和抑菌效果，以期為冰菜作為抗氧化食品的加工和開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

將新鮮冰菜沖洗干凈置于烘箱中，37 ℃烘干至恒重，粉碎，過(guò)60 目篩備用。沒(méi)食子酸，中國(guó)藥品生物制品檢定所，其余試劑均為分析純。試驗(yàn)儀器包括Elma P120 超聲儀、T6 新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)以及其他常規(guī)分析儀器。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用Folin-ciocalteau 方法并適當(dāng)修改[9]，以吸光度對(duì)沒(méi)食子酸含量進(jìn)行線性回歸（圖1），得到回歸方程：y＝95.657x-0.008，R2＝0.997 6。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3 冰菜多酚的提取和測(cè)定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素試驗(yàn)，稱取1 g冰菜粉末，放入50 mL 離心管中，在不同條件下對(duì)冰菜進(jìn)行提取，離心。將提取液脫色（加入液體體積1%的活性炭，60 ℃，保溫40 min）[10]，冷卻至常溫，離心（4 000 r/min，5 min）后過(guò)濾，根據(jù)料液比稀釋適當(dāng)倍數(shù)，即得冰菜提取液。

準(zhǔn)確量取冰菜多酚提取液10 mL，置于25 mL比色管中，按照1.2 所示方法測(cè)定吸光度，帶入回歸方程，求得冰菜提取液中多酚的質(zhì)量濃度，按公式（1）計(jì)算冰菜多酚提取率。

式中，C——提取液多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V——提取液體積，mL；N——提取液稀釋倍數(shù)；m——用于提取的冰菜粉末質(zhì)量，mg

1.4 單因素試驗(yàn)

采用超聲波輔助提取法[11]，超聲功率固定為300 W，37 Hz，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、提取時(shí)間（60、90、120、150、180 min）對(duì)冰菜多酚提取率的影響。

1.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4 個(gè)因素中最優(yōu)的3 個(gè)因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)[12]，正交試驗(yàn)表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

1.6 對(duì)DPPH 自由基清除能力測(cè)定

向2.50 mL 0.20 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液中加入1 mL 冰菜多酚提取液，提取液質(zhì)量濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL，反應(yīng)30 min（避光），在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定其吸光度，記作A1。另取具塞試管加入2.50 mL 0.20 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液和1 mL 無(wú)水乙醇混合，測(cè)定其吸光度，記作A0。再另取具塞試管加入2.50 mL 無(wú)水乙醇和1 mL不同質(zhì)量濃度的冰菜多酚提取液混合均勻，吸光度記為A2。用同質(zhì)量濃度的維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照，按公式（2）計(jì)算冰菜多酚提取液對(duì)DPPH 的清除率[13]。

1.7 對(duì)羥基自由基清除能力測(cè)定

利用水楊酸法測(cè)定冰菜多酚提取液對(duì)羥基自由基的清除率。取6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液各1 mL 加入試管，混勻，再分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 冰菜多酚提取液1 mL 及6 mmol/L 過(guò)氧化氫溶液1 mL，混勻，于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，蒸餾水調(diào)零，于510 nm 處測(cè)定樣品管吸光度A1，以1 mL 蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定A0，以1 mL 蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)定A2。用相同質(zhì)量濃度的維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照，按公式（3）計(jì)算多酚提取液對(duì)羥基自由基的清除率[13-14]。

1.8 冰菜多酚提取物抑菌活性測(cè)定

利用濾紙片法[10]對(duì)冰菜粗提物（多酚）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。選用常見(jiàn)菌種大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，觀察多酚提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比1∶10（g:mL）、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間120 min 的條件下提取冰菜多酚，離心過(guò)濾，旋蒸濃縮多酚提取液，定容使多酚含量為3 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響

由圖2 可以看出，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%～70%范圍內(nèi)，冰菜多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%時(shí)，多酚提取率呈逐漸下降趨勢(shì)。這是由于溶劑體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，可能導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出增多，造成多酚含量減少。故選擇70%乙醇用于后續(xù)單因素試驗(yàn)，此時(shí)冰菜多酚提取率達(dá)到最高。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)冰菜多酚提取率的影響

2.1.2 料液比對(duì)多酚提取率的影響

比較不同料液比冰菜多酚的提取率可知，當(dāng)料液比在1∶10 時(shí)多酚提取率最高，之后隨著料液比降低，提取率不斷下降（圖3）。這可能是由于料液比較低時(shí)，溶質(zhì)和溶劑接觸不充分，導(dǎo)致細(xì)胞中的多酚不易溶出，而過(guò)大的料液比會(huì)降低超聲波的超聲效果，使冰菜細(xì)胞壁不易被破壞，多酚難以溶出，提取率也隨之下降。

圖3 料液比對(duì)冰菜多酚提取率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響

溫度是影響植物活性物質(zhì)提取的重要因素。由圖4 可以看出，當(dāng)提取溫度低于70 ℃時(shí)，隨著提取溫度的不斷上升，多酚提取率也不斷增加。當(dāng)提取溫度大于70 ℃時(shí)，多酚提取率略有下降。這是由于適當(dāng)提高溫度會(huì)加快分子運(yùn)動(dòng)，有利于冰菜多酚的擴(kuò)散和浸出，但溫度過(guò)高時(shí)，因化學(xué)和酶促降解使不穩(wěn)定的多酚類物質(zhì)受熱分解，造成提取率下降，這可能與酚類物質(zhì)的熱敏性有關(guān)。此結(jié)果與尚紅梅等[15]的研究結(jié)果相符。故選取70 ℃作為后續(xù)單因素試驗(yàn)的提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)冰菜多酚提取率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

由圖5 可以看出，當(dāng)提取時(shí)間在30～90 min范圍內(nèi)，多酚提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在提取時(shí)間為90 min 時(shí)，提取率達(dá)到最高。但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)90 min 時(shí)，多酚提取率呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎陔S著提取時(shí)間的增加，部分多酚遭到破壞，導(dǎo)致提取率下降。

圖5 提取時(shí)間對(duì)冰菜多酚提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)確定冰菜多酚的最佳提取條件，如表2 所示。由表2 可知，多酚最佳提取工藝條件為A1B2C3D2，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比1∶10（g:mL）、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間120 min。在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，多酚提取率為1.42%。表2 還表明，各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響順序?yàn)椋禾崛囟龋–）＞料液比（B）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞提取時(shí)間（D），其中提取溫度對(duì)提取率的影響最為明顯。忻曉庭等[16]研究了熱風(fēng)干燥溫度對(duì)多酚含量和抗氧化活性的影響，表明80 ℃時(shí)多酚含量最高，與本研究結(jié)果一致。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 冰菜多酚提取物的抗氧化能力

研究表明，多酚類物質(zhì)具有清除自由基的能力。本試驗(yàn)中采用DPPH 自由基和羥基自由基清除率來(lái)評(píng)價(jià)冰菜多酚提取物的抗氧化活性。

2.3.1 冰菜多酚對(duì)DPPH 自由基的清除能力

由圖6 可以看出，隨著提取物質(zhì)量濃度的上升，對(duì)DPPH 自由基的清除能力也在不斷增加，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH的清除率達(dá)到 64.19%，但冰菜多酚提取物對(duì)DPPH 自由基的清除能力略低于維生素C。

圖6 冰菜多酚提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.3.2 冰菜多酚對(duì)羥基自由基的清除能力

圖7 表明，冰菜多酚提取物對(duì)羥基自由基的清除能力隨多酚質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度高于0.04 mg/mL 時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除能力明顯強(qiáng)于維生素C，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL 時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率最高可達(dá)88.10%。與薺菜相比，冰菜多酚提取物對(duì)羥基自由基的清除率較高[17]。

圖7 冰菜多酚提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

2.4 冰菜多酚提取物的抑菌活性能力

研究表明，很多抗氧化物質(zhì)同時(shí)具有抑菌活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，冰菜多酚提取物對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制效果，且隨提取物質(zhì)量濃度的增大抑制效果也明顯增強(qiáng)（圖8），當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到3 mmg/mL 時(shí)，抑菌圈直徑為12 mm。

圖8 冰菜多酚提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用

3 討論與結(jié)論

冰菜是一種含有多種活性物質(zhì)的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值蔬菜，具有降血糖、防脫發(fā)、促進(jìn)脂肪代謝等多種保健功能[3]。本研究中選取新鮮冰菜低溫干燥并粉碎成粉末，用超聲波輔助法提取多酚，探索和優(yōu)化冰菜多酚的提取條件，并對(duì)多酚提取物進(jìn)行抗氧化及抑菌活性試驗(yàn)。由試驗(yàn)可知，冰菜多酚提取率相對(duì)較低，可能是提取過(guò)程中溫度過(guò)高且時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)冰菜多酚造成了一定程度的破壞，這與忻曉庭等[16]的研究結(jié)果相符。植物組織中多酚類物質(zhì)有較強(qiáng)的抗氧化和抑菌活性，其評(píng)價(jià)方法很多[18-19]。IBTISSEM 等[20]研究表明，冰菜水提物具有抗氧化和抗菌活性。SEUNGMI 等[21]認(rèn)為，冰菜提取物具有抗氧化活性，可作為一種天然的抗氧化功能性食品。本研究以維生素C 為對(duì)照，采用DPPH 自由基和羥基自由基清除法測(cè)定冰菜乙醇-水溶液提取物的抗氧化和抑菌活性。結(jié)果表明，提取物的抗氧化活性大小與酚含量有關(guān)，當(dāng)冰菜多酚質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基和羥基自由基的清除率均超過(guò)60%，與維生素C 相比，提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率比較低。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度大于0.04 mg/mL 時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率明顯高于維生素C，說(shuō)明冰菜多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力。冰菜中含有的多酚類活性物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抑制作用，可以為冰菜抑制腸道細(xì)菌提供依據(jù)，或可用于預(yù)防或緩解腸道疾病[22]。本研究中冰菜多酚提取物只是一個(gè)粗提物，尚沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化，有待今后進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在最佳提取工藝條件下，冰菜多酚提取率為1.42%，且提取物的質(zhì)量濃度越大，對(duì)DPPH 自由基及羥基自由基的清除能力越強(qiáng)。當(dāng)冰菜多酚提取物質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基清除率達(dá)到最大，為64.19%，低于同質(zhì)量濃度的維生素C；羥基自由基清除率達(dá)到最大時(shí)，清除率為88.10%，遠(yuǎn)高于同質(zhì)量濃度的維生素C。并且冰菜多酚對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制作用。本研究結(jié)果表明，冰菜多酚可作為一種天然抗氧化劑與抑菌劑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。