王世偉，王卿惠，向文勝，李婷婷，趙晨晨，周智強(qiáng)

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命與農(nóng)林學(xué)院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161005;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速增長，石油短缺已成為制約經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的瓶頸[1]。為了解決這一難題，生物柴油產(chǎn)業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，然而生物柴油生產(chǎn)過程中又必然產(chǎn)生副產(chǎn)物甘油[2]，如何處理廢棄的甘油成為目前棘手的新問題。粗甘油作為一種廉價(jià)碳源，可被微生物轉(zhuǎn)化為有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的化合物，如1,3-丙二醇(1,3-PDO)、乳酸、乙醇、3-羥基丙酸、2,3-丁二醇和琥珀酸。其中1,3-PDO具有開發(fā)價(jià)值，可作為生產(chǎn)聚酯新產(chǎn)品——聚對苯二甲酸1.3丙二醇酯(PTT)的單體[3-4]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PDO操作簡便，反應(yīng)溫和，副產(chǎn)物少，污染少，且容易處理[5]。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是微生物甘油轉(zhuǎn)化的重要菌株。利用肺炎克雷伯氏菌以粗甘油為底物生產(chǎn)1,3-PDO具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 產(chǎn)1,3-PDO的微生物

早在1881年，August[6]首次報(bào)導(dǎo)梭狀芽胞桿菌(Clostridiumpasteurianum)進(jìn)行甘油發(fā)酵能產(chǎn)1,3-PDO，為微生物法生產(chǎn)1,3-PDO 開辟了新途徑。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PDO既可利用天然微生物轉(zhuǎn)化底物甘油途徑實(shí)現(xiàn)，又可以通過重組大腸埃希菌轉(zhuǎn)化葡萄糖途徑完成[7-8]。肺炎克雷伯氏菌也是能夠高效轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PDO的菌株。

1.1 產(chǎn)1,3-PDO的細(xì)菌

經(jīng)自然分離獲得的菌株通常只能以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO。在厭氧條件下，僅少數(shù)兼性厭氧腸細(xì)桿菌，如克雷伯氏菌屬(Klebsiella)中的肺炎克雷伯氏菌[9]、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)[10]；腸桿菌屬(Enterobacter)，如絮凝腸細(xì)桿菌(Enterobacteraggglomean)[11]；檸檬酸菌屬(Citrobacter)，如弗式檸檬酸菌(Citrobacterfreundii)[12]、烏克曼枸櫞酸桿菌(Citrobacterwerkmanii)[13]；乳酸桿菌屬(Lactobacilli)，如羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)[14]以及完全厭氧菌梭菌屬(Clostridia)，如丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)[15]、巴氏芽胞梭菌(Clostridiumpasteurianum)[16]和糖丁基梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)[17]等可將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PDO?？梢姡芯课⑸锇l(fā)酵特性，闡明肺炎克雷伯氏菌代謝途徑，不僅能為菌株選育和改良提供參考，也能為甘油生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,3-PDO提供重要菌種資源和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1.2 常用產(chǎn)1,3-PDO兩種細(xì)菌的特點(diǎn)

肺炎克雷伯氏菌與梭狀芽胞桿菌(Clostridium)是兩種重要的1,3-PDO生產(chǎn)菌，前者對底物甘油和產(chǎn)物1,3-PDO具有很強(qiáng)的耐受性，后者的耐受性較弱。從代謝流量、細(xì)胞內(nèi)酶以及生長狀況上看，前者甘油脫水酶(glycerol dehydratase,GDH′t)和丙酮酸激酶(PK)是兩個(gè)關(guān)鍵酶；后者甘油脫水酶是限速酶；前者在有氧、微氧或厭氧條件下均以甘油為底物快速生長，而后者為典型嚴(yán)格厭氧菌，生長較慢[18-19]。

如表1所示，作為產(chǎn)1,3-PDO的兩種重要菌株，肺炎克雷伯氏菌和梭狀芽胞桿菌產(chǎn)1,3-PDO的摩爾產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度均較高。如果在不考慮條件致病菌的前提下，肺炎克雷伯氏菌是發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PDO的最理想菌株，通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高其1,3-PDO產(chǎn)量，具有十分廣闊的前景。

表1 不同微生物菌株發(fā)酵產(chǎn) 1，3-PDOTable 1 Microbial production of 1，3-propanediol using different bacteria species

2 肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO的厭氧代謝途徑

肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO厭氧代謝途徑的闡明是對其進(jìn)行應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。由于肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO的強(qiáng)度、產(chǎn)率均較高，近年來對其厭氧代謝途徑、代謝機(jī)理、關(guān)鍵酶等已經(jīng)進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，現(xiàn)總結(jié)歸納如下作為參考。

2.1 產(chǎn)1,3-PDO的厭氧代謝途徑

如圖1所示，肺炎克雷伯氏菌厭氧代謝途徑中甘油歧化有兩條途徑，一是生成ATP和還原當(dāng)量的乙酸/乙醇途徑，該途徑伴隨菌體細(xì)胞的生長；二是利用前一途徑生成的過量還原型輔酶I，將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PDO，其產(chǎn)率與丙酮酸代謝途徑密切相關(guān)，該途徑對于調(diào)節(jié)還原當(dāng)量的平衡起著重要作用。在生物轉(zhuǎn)化中，甘油被轉(zhuǎn)化為1,3-PDO的同時(shí)，還生成乙酸、2,3-丁二醇、乙醇或丁酸等副產(chǎn)品；主要副產(chǎn)物為乙酸和乙醇，次要副產(chǎn)物為2,3-丁二醇、乳酸和琥珀酸[25]。如何更有效地使甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PDO，減少副產(chǎn)物的積累，是該菌株應(yīng)用的關(guān)鍵。

圖1 肺炎克雷伯氏菌厭氧代謝相關(guān)途徑Fig.1 The relatecl anaerobic metabolism pathways of Klebsilla pneumonia

2.2 產(chǎn)1,3-PDO厭氧代謝的重要酶

在厭氧條件下，甘油脫水酶、1,3-PDO氧化還原酶(1,3-propanediol oxidoreductase，PDOR)、甘油脫氫酶(glyceroldehydogenase，GDH)和二羥丙酮激酶(Dihydroxyacetone kinase)四種酶起重要作用。甘油進(jìn)入細(xì)胞后除了為自身生長提供能量和原料外，還經(jīng)還原和氧化兩個(gè)途徑進(jìn)行代謝[26]。在還原支路中，甘油進(jìn)入細(xì)胞，部分被甘油脫水酶催化，生成3-羥基丙醛和水，產(chǎn)物3-羥基丙醛再經(jīng)1,3-PDO氧化還原酶作用，消耗還原力NADH生成終產(chǎn)物1,3-PDO。在限制底物情況下，甘油脫水酶是產(chǎn)物生成的限速酶；當(dāng)?shù)孜镞^量時(shí)，1,3-PDO氧化還原酶是限速酶，生成的3-HPA 抑制細(xì)胞生長和代謝[27]。在氧化途徑中，另一部分甘油在甘油脫氫酶作用下，轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮，后者再經(jīng)磷酸化脫氫進(jìn)入丙酮酸代謝途徑，生成各種副產(chǎn)物[28]。因此，在1,3-PDO生產(chǎn)中，要合理利用菌株，減少副產(chǎn)物積累，優(yōu)化工藝設(shè)計(jì)，提高1,3-PDO產(chǎn)量。

2.2.1 厭氧發(fā)酵中的“振蕩”現(xiàn)象 在肺炎克雷伯氏菌甘油厭氧連續(xù)發(fā)酵中，當(dāng)?shù)孜餄舛?、pH或稀釋速率發(fā)生變動(dòng)時(shí)，菌體生物量、比生長速率以及副產(chǎn)物生成呈規(guī)律性“振蕩”。推測“振蕩”可能歸因于參與代謝的丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和丙酮酸脫氫酶(PDH)作用的不同步性，以及還原當(dāng)量(NAD/NADH2)的不平衡所致[29]。而且副產(chǎn)物和還原當(dāng)量通量“振蕩”之間存在明顯關(guān)系。在振蕩條件下，受影響的主要是丙酮酸代謝，所有丙酮酸代謝產(chǎn)物的比生成速率差異顯著。相反，在振蕩期間，底物攝取、ATP生成和直接來自甘油衍生的1,3-PDO或丙酮酸代謝上游衍生產(chǎn)物形成的特定速率幾乎不受影響。在振蕩和穩(wěn)態(tài)條件下，除了丙酮酸甲酸裂解酶外，其他酶系統(tǒng)同時(shí)參與丙酮酸脫羧代謝；而在振蕩條件下，這些酶活性都會(huì)發(fā)生振蕩。因此，“振蕩”和“滯后”可能是由于底物過量和環(huán)境劇變，觸發(fā)了丙酮酸代謝中酶的調(diào)控失調(diào)所致[30]。

2.2.2 厭氧發(fā)酵中“振蕩”的酶學(xué)基礎(chǔ) 在穩(wěn)態(tài)、振蕩和瞬態(tài)厭氧連續(xù)培養(yǎng)中，對甘油脫氫酶、甘油脫水酶和1,3-PDO氧化還原酶三種酶的體內(nèi)外活性分析表明，盡管甘油濃度對上述三種酶的體外活性都有負(fù)面影響，但對體內(nèi)活性卻有促進(jìn)作用。在甘油濃度較低的情況下，生長速率顯著影響體外和體內(nèi)酶活性的比率；但在甘油過量的情況下，生長速率不影響酶活性比率。甘油氧化途徑流量主要由代謝水平上體內(nèi)酶活性調(diào)節(jié)控制，而還原途徑流量主要由酶合成控制。高甘油濃度下，甘油脫水酶是甘油消耗和1,3-PDO生成的關(guān)鍵酶，振蕩培養(yǎng)中該酶的體外和體內(nèi)活性都發(fā)生“振蕩”。菌體生長和產(chǎn)物生成對底物濃度變化十分敏感，這種敏感性是遺傳和代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)變化的結(jié)果[31]。可見，闡明代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)變化與1,3-PDO產(chǎn)量相關(guān)性是亟需解決的問題。

2.2.3 1,3-PDO產(chǎn)量與代謝流量變化之間的關(guān)系 基因組尺度(Genome scale)代謝網(wǎng)絡(luò)分析，是從基因組序列出發(fā)，結(jié)合基因、蛋白質(zhì)、代謝數(shù)據(jù)庫及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從系統(tǒng)角度定量研究代謝過程，闡明各個(gè)組分之間相互作用的有效方法[32]。為了研究肺炎克雷伯氏菌1,3-PDO產(chǎn)量與代謝途徑中流量變化之間的關(guān)系，Pan等[33]將基因組尺度流量平衡分析與細(xì)胞外代謝物動(dòng)力學(xué)模型相結(jié)合，構(gòu)建了一種基于動(dòng)態(tài)流量平衡分析的方法，擴(kuò)展了三條新的代謝途徑或位點(diǎn)，即在二羥基丙酮(DHA)節(jié)點(diǎn)引出的戊糖磷酸途徑(PPP)，提供更多還原當(dāng)量；3-磷酸甘油酯(3PG)節(jié)點(diǎn)上的合成氨基酸分支；三羧酸(TCA)循環(huán)中的α-酮戊二酸位點(diǎn)導(dǎo)出的通向谷氨酸和其他氨基酸合成的代謝途徑。通過代謝途徑中重要節(jié)點(diǎn)動(dòng)態(tài)流量分布與1,3-PDO產(chǎn)率之間的關(guān)系分析表明，DHA到PPP動(dòng)態(tài)通量變化和TCA循環(huán)中流量變化與1,3-PDO產(chǎn)量均呈正相關(guān)。輔助因子四氫葉酸形成反饋環(huán)，對氨基酸合成代謝途徑中TCA通量變化也有影響?？梢?，對產(chǎn)1,3-PDO肺炎克雷伯氏菌關(guān)鍵酶的深入研究，也可采用分子生物學(xué)技術(shù)對關(guān)鍵酶性質(zhì)做更深入研究。隨著代謝網(wǎng)絡(luò)途徑和節(jié)點(diǎn)同1,3-PDO產(chǎn)量相關(guān)性的闡明，以及甘油代謝途徑的拓展，肺炎克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO將發(fā)揮更大的優(yōu)勢。

3 產(chǎn)1,3-PDO肺炎克雷伯氏菌的篩選和培養(yǎng)

3.1 產(chǎn)1,3-PDO肺炎克雷伯氏菌的篩選

在篩選產(chǎn)1,3-PDO肺炎克雷伯氏菌時(shí)，可采用酸堿度和溫度變化的方法進(jìn)行。Raghunandan等[34]利用M9培養(yǎng)基，設(shè)置不同pH和溫度條件，使用純甘油底物，對12株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，考察其對底物利用能力，篩選到甘油降解率>80%的菌株SM7，經(jīng)鑒定為肺炎克雷伯氏菌，該菌最大甘油耐受質(zhì)量濃度達(dá)110 g/L。可見，傳統(tǒng)篩選法仍然可行，合理利用能獲得優(yōu)良的菌株。菌株的耐受性一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。趙紅英[35]通過提高培養(yǎng)基中甘油濃度和平板包埋培養(yǎng)馴化，提高了肺炎克雷伯氏菌甘油耐受力和厭氧生長能力，1,3-PDO發(fā)酵終濃度和甘油轉(zhuǎn)化率均有所提高。Wang等[36-37]在研究產(chǎn)腈水合酶紅球菌底物耐受性時(shí)發(fā)現(xiàn)，提高底物丙烯腈濃度的馴化，能獲得較高丙烯酰胺產(chǎn)量。通過復(fù)合誘變和雙親滅活原生質(zhì)體融合，可有效改良菌株?？梢?，在篩選產(chǎn)1,3-PDO肺炎克雷伯氏菌時(shí)，為了提高菌株的底物耐受性也可以借鑒傳統(tǒng)的篩選方式和菌種選育策略。Ma等[38]在肺炎克雷伯氏菌2e分批發(fā)酵粗甘油轉(zhuǎn)化1,3-PDO時(shí)發(fā)現(xiàn)，粗甘油及其主要雜質(zhì)對該菌生長、關(guān)鍵酶活性和1,3-PDO幾乎無影響。該菌含30個(gè)與甘油無氧代謝及1,3-PDO合成相關(guān)基因。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，與純甘油相比，在粗甘油中編碼甘油代謝和1,3-PDO生物合成關(guān)鍵酶的多數(shù)基因顯著上調(diào)。該菌株存在一種新甘油攝取促進(jìn)蛋白，比其他肺炎克雷伯氏菌應(yīng)激反應(yīng)蛋白數(shù)量更多。可見，獲得耐受粗甘油的肺炎克雷伯氏菌，并對甘油耐受性分子機(jī)制進(jìn)行研究，不但能提高1,3-PDO產(chǎn)量，而且對基因工程菌株構(gòu)建，優(yōu)化代謝途徑都有理論和應(yīng)用價(jià)值。

3.2 產(chǎn)1,3-PDO肺炎克雷伯氏菌的培養(yǎng)優(yōu)化

對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化是提高1,3-PDO產(chǎn)量的常用方法。Supaporn等[39]采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，推導(dǎo)出甘油、(NH4)2SO4、微量元素、pH值和培養(yǎng)時(shí)間等因子對1,3-PDO濃度、產(chǎn)量、選擇性和生產(chǎn)力等單一效應(yīng)和交互效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，確定了產(chǎn)1,3-PDO的最佳條件。Hiremath等[40]對肺炎克雷伯氏菌ATCC15380利用麻瘋樹生物柴油產(chǎn)生的粗甘油為底物生產(chǎn)1,3-PDO反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的1,3-PDO產(chǎn)量高達(dá)56 g/L，甘油轉(zhuǎn)化率達(dá)0.85 mol/mol。Rosarin等[41]采用常規(guī)方法，研究了表達(dá)融合蛋白的新型重組大腸埃希菌BP41Y3，優(yōu)化了生產(chǎn)1,3-PDO的環(huán)境和營養(yǎng)條件。在10個(gè)營養(yǎng)變量中，選擇富馬酸鹽、(NH4)2HPO4和蛋白胨，研究它們之間的交互作用，獲得最佳培養(yǎng)基。通過厭氧培養(yǎng)24 h后，“振蕩”最大質(zhì)量濃度為11.92 g/L?？梢?，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)、采用響應(yīng)面等方法對培養(yǎng)基成分和條件進(jìn)行優(yōu)化，仍然是常規(guī)有效的方法。

4 影響肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO的因素

4.1 氧氣對肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO的影響

肺炎克雷伯氏菌屬于兼性厭氧菌。作為重要發(fā)酵參數(shù)的氧氣，對菌株發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO具有重要影響。在低、中、高甘油濃度下，Wang等[42]在厭氧和有氧條件下，研究了肺炎克雷伯氏菌連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO。在有氧高甘油濃度發(fā)酵條件下(通氣量為0.04 vvm)，1,3-PDO隨甘油濃度增加而增加，最高可達(dá)266 mmol/L(此時(shí)甘油濃度達(dá)760 mmol/L)。然而，在厭氧條件下，隨著甘油濃度增加，1,3-PDO產(chǎn)率卻逐漸降低；在較低甘油濃度條件下(270 mmol/L)，1,3-PDO最高產(chǎn)率為520 mmol/L。在高甘油濃度條件下進(jìn)行有氧發(fā)酵，甘油脫水酶比活性最高為0.04 U/mg。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的所有甘油濃度和有氧條件下，甘油脫氫酶和1,3-PDO氧化還原酶的比活性都有所提高，這意味著在微需氧條件下dha操縱子不會(huì)受到抑制。隨著甘油濃度增加，更多碳通量轉(zhuǎn)移到氧化途徑，導(dǎo)致1,3-PDO生成通量降低，該途徑氧化分支中碳通量增加并不均勻分布。Chen等[43]研究了肺炎克雷伯氏菌在微需氧條件下分批發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，產(chǎn)生的乙醇比厭氧條件下少，間歇微需氧發(fā)酵時(shí)間明顯短于厭氧發(fā)酵，導(dǎo)致1,3-PDO產(chǎn)率增加。Liu等[44]在微需氧條件下，利用肺炎克雷伯氏菌，以甘油為原料生產(chǎn)1,3-PDO，補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的發(fā)酵罐體積已成功擴(kuò)大到1 m3。在微需氧條件下，1,3-PDO的最終濃度和產(chǎn)率(72 g/L ～2.1 g/(L·h))與厭氧條件下相近?？梢姡芯坎煌鯕猸h(huán)境對發(fā)酵的影響，應(yīng)該有針對性地設(shè)計(jì)1,3-PDO生產(chǎn)發(fā)酵工藝。Ma等[45]在不同曝氣方式下，研究了肺炎克雷伯氏菌XJPD-Li分批發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)1,3-PDO產(chǎn)量和產(chǎn)率分別呈“厭氧條件﹥無曝氣條件﹥好氧條件”的規(guī)律減少。在好氧條件下，甘油對1,3-PDO產(chǎn)率最低，但生物量最高。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，就1,3-PDO產(chǎn)量而言，好氧條件﹥厭氧條件﹥無曝氣條件；就產(chǎn)率而言，厭氧條件﹥好氧條件﹥無曝氣條件。三種條件下，在最初12 h內(nèi)，1,3-PDO產(chǎn)量均較好。可見，發(fā)酵形式不同，獲得的1,3-PDO最終濃度和產(chǎn)率也不同。因此應(yīng)根據(jù)不同需要，采取不同的氧氣控制的發(fā)酵形式。

4.2 pH對肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO的影響

Ji等[46]在不同分批發(fā)酵條件下進(jìn)行pH靜態(tài)補(bǔ)料分批發(fā)酵研究，發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物2,3-丁二醇和乳酸產(chǎn)量與pH值密切相關(guān)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)副產(chǎn)物和殘余甘油濃度較高，不利于1,3-PDO產(chǎn)生。pH值為5.0～6.5時(shí)，主要副產(chǎn)物為2,3-丁二醇，而在pH值7.1～8.0時(shí)，主要副產(chǎn)物為乳酸，說明菌體產(chǎn)生了自我保護(hù)機(jī)制，在環(huán)境pH值變化時(shí)，菌體細(xì)胞會(huì)對代謝途徑進(jìn)行更改。采用周期性pH值波動(dòng)(6.3～7.3)投喂策略，在pH周期性低或高脅迫下，2,3-丁二醇和乳酸代謝途徑處于亞活躍狀態(tài)，采用該種分批補(bǔ)料策略，實(shí)現(xiàn)了1,3-PDO高效生產(chǎn)(質(zhì)量濃度達(dá)70 g/L，每摩爾甘油獲得0.700 毫摩爾1,3-PDO，產(chǎn)率達(dá) 0.97g/(L·h)，兩個(gè)主要副產(chǎn)物和殘甘油濃度均較低。pH是影響發(fā)酵的一個(gè)重要參數(shù)，對pH的合理調(diào)控就可達(dá)到增加生成量，減少副積累的目的。Petrov等[47]研究發(fā)現(xiàn)，采用“強(qiáng)制pH波動(dòng)”分批發(fā)酵，以一定ΔpH(振幅范圍1.0～2.0)連續(xù)升高pH值，不僅可提高肺炎克雷伯氏菌的1,3-PDO產(chǎn)量，而且產(chǎn)生副產(chǎn)品較少。方法是按照ΔpH=1.0的增加量，每隔3 h增加一次pH。與相應(yīng)進(jìn)料批次(恒定pH=7.0)發(fā)酵相比，1,3-PDO最高增加10%；副產(chǎn)物顯著減少?？梢?，掌握周期性變化規(guī)律，遵循pH的周期性規(guī)律，能提高1,3-PDO產(chǎn)量。

4.3 底物和產(chǎn)物對肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO的影響

4.3.1 底物甘油對產(chǎn)1,3-PDO的影響 為了使發(fā)酵過程穩(wěn)定、重復(fù)性好，可精確控制底物甘油的投料來提高1,3-PDO產(chǎn)量。Huang等[48]設(shè)計(jì)了一種基于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的甘油自動(dòng)進(jìn)料策略，采用轉(zhuǎn)基因肺炎克雷伯氏菌LDH526，以甘油為唯一碳源，使1,3-PDO生產(chǎn)質(zhì)量濃度﹥90 g/L。將底物投料速率與pH、發(fā)酵時(shí)間等變量耦合，進(jìn)行甘油自啟動(dòng)投料和甘油濃度動(dòng)態(tài)控制，72 h后1,3-PDO最終質(zhì)量濃度﹥95 g/L?？梢姡米詣?dòng)化技術(shù)準(zhǔn)確地進(jìn)行底物的投放，可有效提高1,3-PDO產(chǎn)量。

4.3.2 輔助底物對產(chǎn)1,3-PDO的影響 除了甘油底物，添加輔助底物進(jìn)行共底物生產(chǎn)1,3-PDO是一種改良的新方法。添加半纖維素水解物，能使菌株獲得更多的生物量和還原力，從而提高1,3-PDO產(chǎn)量。Jin等[49]發(fā)現(xiàn)，木糖和甘露糖能促進(jìn)1,3-PDO產(chǎn)生和細(xì)胞生長；低濃度糠醛和醋酸鈉能促進(jìn)菌體生長和1,3-PDO、乙酸鹽生成。以半纖維素水解物為共底物的補(bǔ)料分批發(fā)酵，最終1,3-PDO產(chǎn)量、甘油轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率比單一底物甘油發(fā)酵均有所提高。NADH消耗量是調(diào)節(jié)還原當(dāng)量平衡的關(guān)鍵，甘油和木糖共發(fā)酵可提高1,3-PDO還原當(dāng)量。Jin等[50]添加木糖作為共底物，發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生更多還原當(dāng)量，提高細(xì)胞生長速度。在微需氧分批發(fā)酵中，共發(fā)酵相關(guān)的1,3-PDO濃度、甘油轉(zhuǎn)化率和生物量都有提高。陳琳等[51]研究表明，肺炎克雷伯氏肺桿菌經(jīng)過磷酸戊糖途徑可利用D-木糖為菌體代謝提供大量還原力，促進(jìn)1,3-PDO的合成。在以木糖作為輔助底物的微氧批次補(bǔ)料發(fā)酵中，1,3-PDO質(zhì)量濃度、甘油轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量均明顯提高。吳家鑫等[52]研究了輔助碳源蔗糖與葡萄糖對重組肺炎克雷伯氏菌批式發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO的影響。對發(fā)酵工藝進(jìn)行放大，并優(yōu)化流加策略，發(fā)現(xiàn)葡萄糖作為輔助碳源優(yōu)于蔗糖。以葡萄糖為輔助碳源，采用指數(shù)流加策略，30 L發(fā)酵罐中1,3-PDO的產(chǎn)量顯著提高?？梢?，共底物發(fā)酵比甘油單一底物發(fā)酵能顯著提高1,3-PDO產(chǎn)量。

4.3.3 產(chǎn)物對1,3-PDO生成的影響 不同代謝產(chǎn)物對1,3-PDO生產(chǎn)影響不同。Barbirato等[53]發(fā)現(xiàn)，無論初始甘油含量如何，聚團(tuán)腸桿菌甘油發(fā)酵在消耗大約430 mmol/L甘油后會(huì)產(chǎn)生3-羥基丙醛，阻止了菌體生長和產(chǎn)物1,3-PDO生成。經(jīng)質(zhì)子核磁共振證實(shí)3-羥基丙醛對菌體生長具有抑制作用。Lin等[54]發(fā)現(xiàn)，在肺炎克雷伯氏菌培養(yǎng)液中添加5 mmol/L延胡索酸，甘油消耗率和1,3-PDO生成均有提高；同時(shí)，NAD+與NADH比值下降。Zhong等[55]研究了乳酸和3-羥基丙醛對肺炎克雷伯氏菌發(fā)酵產(chǎn)1,3-PDO的影響，發(fā)現(xiàn)它們對正常和乳酸途徑缺陷菌株生產(chǎn)1,3-PDO均有影響。直接抑制1,3-PDO產(chǎn)生的原因是3-羥基丙醛的早期積累，而非發(fā)酵后期產(chǎn)生的乳酸。通過減少發(fā)酵初期3-羥基丙醛的積累，1,3-PDO濃度和產(chǎn)率分別比初始實(shí)驗(yàn)水平提高了18%和16%?？梢姡怯捎?-羥基丙醛的早期積累，而非發(fā)酵后期乳酸積累，才導(dǎo)致了1,3-PDO最終濃度的降低。劉龍飛等[56]分析了產(chǎn)乳酸和2,3-丁二醇途徑基因敲除菌的乳酸代謝特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前期添加乳酸能使1,3-PDO產(chǎn)量迅速降低；而發(fā)酵10 h后添加乳酸，幾乎對1,3-PDO的生產(chǎn)無抑制作用。乳酸敲除菌株發(fā)酵后期能夠消耗培養(yǎng)基中的乳酸，對乳酸具有耐受性。副產(chǎn)物2,3-丁二醇基因工程敲除菌前期乳酸過早積累被解除后，1,3-PDO的產(chǎn)量大幅度提高?？梢?，分析代謝途徑中導(dǎo)致1,3-PDO產(chǎn)量下降的真正原因，然后適當(dāng)刪除或過表達(dá)副產(chǎn)物產(chǎn)生的關(guān)鍵酶基因，構(gòu)建基因工程菌株有望提高1,3-PDO產(chǎn)量；了解乳酸在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律，不但有利于工藝的合理設(shè)計(jì)，而且也有利于對基因工程菌株的構(gòu)建提供科學(xué)指導(dǎo)。

4.4 鹽對菌體產(chǎn)1,3-PDO的影響

無機(jī)鹽是培養(yǎng)基的重要成分。Xu等[57]發(fā)現(xiàn)在低鹽濃度下，細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成率較高；高鹽濃度下細(xì)胞生長緩慢，1,3-PDO最終濃度、甘油的1,3-PDO轉(zhuǎn)化率以及1,3-PDO氧化還原酶活性均有所降低。李莉莉等[58]發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯氏菌(HSL4)發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO的培養(yǎng)基中，磷酸鹽對發(fā)酵過程影響較大。利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵，在培養(yǎng)基中高、低初始磷酸根濃度條件下，1,3-PDO終質(zhì)量濃度均在75 g/L左右。在低磷條件下，底物甘油消耗量較少，1,3-PDO轉(zhuǎn)化率較高；除2,3-丁二醇外，其他副產(chǎn)物積累均比高磷條件下少。高磷促進(jìn)乙酸、乙醇、乳酸等副產(chǎn)物生成，且改變中、后期發(fā)酵環(huán)境，增加下游分離提取1,3-PDO壓力。Zheng等[59]采用含有過量甘油的銨和磷酸鹽限制的恒化培養(yǎng)基，研究了肺炎克雷伯氏菌1,3-PDO生產(chǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在限氨和限磷酸鹽培養(yǎng)基中，大約50%分解代謝通量直接作用于1,3-PDO合成。在36 h內(nèi)，限氨分批培養(yǎng)產(chǎn)生的1,3-PDO明顯高于有機(jī)酸產(chǎn)量。但是，限磷酸鹽分批培養(yǎng)產(chǎn)生1,3-PDO小于乳酸產(chǎn)量?？梢?，在肺炎克雷伯氏菌甘油發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PDO過程中，要控制培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的種類和含量。

5 肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO的工程技術(shù)策略

5.1 單一輔因子工程和多模塊工程策略

單一輔因子策略能提高1,3-PDO和2,3-丙二醇的產(chǎn)量。Wang 等[60]采用輔因子工程策略，構(gòu)建糖酵解中具有較高NAD(P)H再生率的ED途徑和轉(zhuǎn)氫化酶為基礎(chǔ)的NADH再生體系，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比值，利用葡萄糖和甘油混合物提高1,3-PDO和2,3-丙二醇濃度。NADH/NAD+比值提高能影響中樞碳途徑基因轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞生長。構(gòu)建后菌體NADH/NAD+比值比原始菌丙二醇質(zhì)量濃度增加到110.8 g/L，增加了92.8%；摩爾產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別增加到0.78 mol/mol和3.46 g/(L·h)。聯(lián)合使用若干策略，形成疊加效應(yīng)能更好地提高1,3-PDO的產(chǎn)量。Wang等[61]利用多模塊工程技術(shù)，提高了肺炎克雷伯氏菌1,3-PDO產(chǎn)量和耐受性。首先采用集中在甘油途徑進(jìn)化，使1,3-PDO產(chǎn)量增加25%，副產(chǎn)物顯著降低，1,3-PDO耐受性提高到150 g/L；接著對共底物轉(zhuǎn)運(yùn)體系進(jìn)行調(diào)控，突變體1,3-PDO濃度、產(chǎn)量和產(chǎn)率進(jìn)一步提高(分別達(dá)到76.4 g/L、0.53 mol/mol、2.55 g/(L·h))；最后引入NADH再生體系，重組菌株獲得了最高的1,3-PDO產(chǎn)量、摩爾產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度(86 g/L、0.59 mol/mol、2.69 g/(L·h))?？梢?，不同模塊組合不斷升級，可一步步增加1,3-PDO產(chǎn)量，比單一模塊工程更有潛力。

5.2 采用集成建模預(yù)測和優(yōu)化策略

動(dòng)力學(xué)模型固有的不確定性限制了其產(chǎn)物的預(yù)測能力。利用數(shù)學(xué)模型和計(jì)算機(jī)模擬優(yōu)化是目標(biāo)產(chǎn)物形成的優(yōu)化策略。Pan等[62]以甘油為底物，對肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO產(chǎn)量提高進(jìn)行了優(yōu)化，采用集成建模技術(shù)降低了模型對發(fā)酵過程的不確定性，提高了其預(yù)測性能。①通過靈敏度分析，確定了對模型有顯著影響的參數(shù)作為集成建模可調(diào)參數(shù)。②確定合適模型誤差閾值系數(shù)，并采用抽樣方法生成盡可能多的等效參數(shù)集。③每一組參數(shù)分別應(yīng)用于模擬，并將所有預(yù)測值整合為加權(quán)平均值，得到預(yù)測期望值。與傳統(tǒng)單參數(shù)模擬相比，集成建模預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相對誤差小，模型預(yù)測性能顯著提高，獲得了1,3-PDO最佳產(chǎn)率和收率。集成建模補(bǔ)償了模型不確定性，預(yù)測更準(zhǔn)確。

5.3 采用肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)1,3-PDO的生產(chǎn)監(jiān)測策略

5.3.1 化學(xué)計(jì)量學(xué)模型和熒光光譜技術(shù)優(yōu)化產(chǎn)1,3-PDO的監(jiān)測 Rossi等[63]應(yīng)用化學(xué)計(jì)量學(xué)模型和熒光光譜技術(shù)，監(jiān)測了肺炎克雷伯氏菌在不同通氣條件下的代謝過程。在需氧和厭氧條件下，將多波長熒光技術(shù)應(yīng)用于培養(yǎng)過程參數(shù)在線監(jiān)測，觀察到光譜差異可反映細(xì)胞代謝不同的狀態(tài)。為了預(yù)測生物量、甘油和1,3-PDO等工藝變量，根據(jù)連續(xù)測量熒光光譜建立了化學(xué)計(jì)量模型。雖然甘油和1,3-PDO不是熒光化合物，但可作為變量應(yīng)用于在線監(jiān)測代謝過程以提高1,3-PDO產(chǎn)量。

5.3.2 ORP監(jiān)測優(yōu)化1,3-PDO生產(chǎn) 細(xì)胞外氧化還原電位(ORP)可作為科學(xué)監(jiān)測指標(biāo)。Du等[64]在分批發(fā)酵過程中，利用ORP監(jiān)測肺炎克雷伯氏菌1,3-PDO生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)-190 mV的ORP水平下，細(xì)胞生長快，1,3-PDO濃度較高。測定了不同ORP水平下NAD+/NADH比值，確定NAD+/NADH比值關(guān)鍵點(diǎn)為4，將大于這一關(guān)鍵點(diǎn)的發(fā)酵環(huán)境設(shè)為相對氧化環(huán)境，反之為相對還原環(huán)境。在氧化環(huán)境中1,3-PDO產(chǎn)率和比生長速率均高。Du等[65]也提出了基于ORP的突變體篩選新方法。具體步驟：①確定野生型菌株生長和生產(chǎn)1,3-PDO的首選ORP范圍；②將化學(xué)誘變培養(yǎng)物置于對野生型菌株有害的低ORP水平內(nèi)；③選擇在有害ORP水平下表現(xiàn)出高比生長率的菌落，并研究其產(chǎn)生1,3-PDO能力。當(dāng)ORP控制在-280 mV，從11個(gè)分離菌株中篩選出4個(gè)陽性突變株。補(bǔ)料分批發(fā)酵中，突變體首選ORP水平(-280 mV)顯著低于其親本(-190 mV)。突變體細(xì)胞內(nèi)還原通量增強(qiáng)，促進(jìn)了1,3-PDO的生成?？梢姡浞掷肙RP監(jiān)測特點(diǎn)和規(guī)律或通過ORP篩選突變菌可有效獲得高產(chǎn)突變菌株，有效提高1,3-PDO產(chǎn)量。

6 展 望

生物柴油在全球大規(guī)模生產(chǎn)，給其副產(chǎn)物甘油的利用帶來了挑戰(zhàn)。與化學(xué)合成法相比，微生物法可有效利用剩余的甘油副產(chǎn)物生產(chǎn)1,3-PDO，具有明顯的優(yōu)勢，微生物法也有助于解決甘油過剩帶來的環(huán)境污染問題，并有利于生物柴油行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。隨著發(fā)酵工藝研究的進(jìn)展，對甘油生物轉(zhuǎn)化過程的代謝途徑、動(dòng)力學(xué)特征和動(dòng)態(tài)行為的認(rèn)識逐漸深入，今后一方面要通過控制培養(yǎng)條件改變代謝途徑，在保持高轉(zhuǎn)化率的情況下提高1,3-PDO濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度；進(jìn)一步優(yōu)化甘油或輔助底物代謝中還原當(dāng)量的分布和平衡，減少副產(chǎn)物的積累和抑制作用，提高 1,3-PDO產(chǎn)率和濃度；另一方面要重視通過基因工程、蛋白質(zhì)工程和代謝網(wǎng)絡(luò)工程等方法構(gòu)建優(yōu)良工程菌株，闡明更多的代謝途徑和相關(guān)機(jī)理，為1,3-PDO的產(chǎn)生開辟新途徑。相信微生物發(fā)酵法在生物技術(shù)領(lǐng)域生產(chǎn)1,3-PDO將成為新范例。