孫承文，江小燕,賴迎迢,2，趙長(zhǎng)臣，劉春花，任 燕,2， 鞏 華,2，陳總會(huì)，陶家發(fā),2*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；2.農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬于弧菌科氣單胞菌屬，可引起人、獸及多種水生生物發(fā)病，如人體感染可導(dǎo)致胃腸炎、腹膜炎、敗血癥和外傷感染等疾病[1-3]，可感染魚、蝦、龜?shù)榷喾N水生動(dòng)物[4-10]，引起多種淡水魚腸炎、腹水及出血等癥狀發(fā)生，造成養(yǎng)殖魚類大規(guī)模發(fā)病死亡，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來，抗生素治療是針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖過程細(xì)菌性疾病的主要治療方法，但此方法極易使致病菌產(chǎn)生耐藥性特別是多重耐藥性[11-12]，且水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的藥物殘留也危及環(huán)境及食品安全。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)許多學(xué)者對(duì)多種魚類進(jìn)行維氏氣單胞菌疫苗免疫研究，已取得了很好的預(yù)防效果[13-16]。因此推進(jìn)維氏氣單胞菌疫苗的商品化、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和水產(chǎn)品安全具有十分重要的意義。然而關(guān)于該菌不同培養(yǎng)基組成對(duì)其發(fā)酵工藝及制備滅活疫苗的免疫效力影響的研究鮮見報(bào)道。本研究通過測(cè)定發(fā)酵菌液活菌數(shù)，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化維氏氣單胞菌滅活疫苗發(fā)酵培養(yǎng)基組成及用量，研究培養(yǎng)基碳源、氮源、硫酸鹽、磷酸鹽及其交互作用對(duì)發(fā)酵菌液活菌數(shù)的影響，并比較考察優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備的滅活疫苗免疫效力，為建立更高產(chǎn)穩(wěn)定的疫苗發(fā)酵工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)CA07，由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所分離自患細(xì)菌性敗血病鯽魚腎臟并鑒定、保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①基礎(chǔ)培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB)：蛋白胨 10.0 g/L，牛肉膏 3.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L。②營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+18.0 g/L瓊脂。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 恒溫?fù)u床(ZWY-211B，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)；自動(dòng)發(fā)酵罐(Cell-BF-7 L，中國(guó)齊志生物工程設(shè)備有限公司)；紫外分光光度計(jì)(UV1800PC，上海奧析科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 一級(jí)種子液制備 將維氏氣單胞菌CA07菌種用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基溶解后，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng) 24 h，挑取典型菌落接種于含營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，28 ℃，150 r/min震蕩培養(yǎng) 14～16 h，作為一級(jí)種子液。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 以營(yíng)養(yǎng)肉湯為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，其他條件保持不變，比較氮源(細(xì)菌學(xué)蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏)、碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉)、磷酸鹽(磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀)、硫酸鹽(硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅)對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)影響，確定最佳氮源、碳源、磷酸鹽、硫酸鹽因子，以及最佳添加量對(duì)活菌數(shù)的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)方案。

1.2.4 優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基驗(yàn)證試驗(yàn)及滅活疫苗制備 分別用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制的發(fā)酵培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)維氏氣單胞菌CA07，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定維氏氣單胞菌CA07的活菌數(shù)，比較優(yōu)化培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)活菌數(shù)的影響。分別添加甲醛溶液(添加后甲醛溶液終濃度為0.30%)于優(yōu)化培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵的菌液中，37 ℃滅活24 h，制備滅活疫苗后稀釋備用。

1.2.5 不同培養(yǎng)基制備的滅活疫苗免疫效力比較 將制備的滅活疫苗按活菌數(shù)以生理鹽水調(diào)整至滅活前活菌數(shù)約4.0×109cfu/mL。取健康鯽魚(體質(zhì)量12～16 g)90 尾，先在27～29 ℃的水環(huán)境下飼養(yǎng)7 d以上，確認(rèn)健活后，將魚隨機(jī)分為3 組，每組30 尾。免疫組腹腔分別注射滅活菌液0.2 mL/尾，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.2 mL/尾。免疫28 d后，免疫組和對(duì)照組腹腔各注射維氏氣單胞菌CA07菌液進(jìn)行攻毒，攻毒后觀察7 d，每日記錄各組的死魚數(shù)，比較不同發(fā)酵培養(yǎng)基制備的CA07株滅活疫苗免疫效力。按公式計(jì)算疫苗的相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS)：RPS(%)=(1-(免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率))× 100%

1.2.6 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn) 配制5 L 優(yōu)化后的培養(yǎng)基于 7 L 發(fā)酵罐中高壓滅菌，待冷卻至 28 ℃ 時(shí)，接種5%(體積分?jǐn)?shù))維氏氣單胞菌CA07菌液于優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，通氣量為4 L/min，每隔2 h 取樣測(cè)定OD600值，繪制該菌的生長(zhǎng)曲線及檢測(cè)活菌數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Design Expert 12.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳、氮源對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)的影響

以葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源時(shí)，活菌數(shù)最高為3.30×109cfu/mL，且顯著高于其他碳源組，其次為蔗糖、麥芽糖，以可溶性淀粉為碳源時(shí)，菌液活菌數(shù)最低(圖1)。因此，選擇葡萄糖作為培養(yǎng)基最佳碳源。

圖1 碳源種類對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of carbon source types oncounts of viable bacteria

以胰蛋白胨為氮源時(shí)，維氏氣單胞菌CA07的活菌數(shù)最高為4.20×109cfu/mL，且顯著高于其他氮源組，以大豆蛋白胨作為單一氮源時(shí)，維氏氣單胞菌CA07的活菌數(shù)次之，而以細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母膏做為氮源時(shí)，維氏氣單胞菌CA07活菌數(shù)最低(圖2)。說明胰蛋白胨作為維氏氣單胞菌CA07培養(yǎng)基氮源效果更好。因此，選擇胰蛋白胨作為維氏氣單胞菌CA07培養(yǎng)基氮源。

圖2 氮源種類對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of nitrogen source types on counts of viable bacteria

從圖3可以看出，碳氮比對(duì)維氏氣單胞菌CA07活菌數(shù)影響很大，碳源比例高活菌數(shù)低，隨著氮源比例升高，活菌數(shù)也逐漸增加，當(dāng)碳氮比為C∶N=1∶2時(shí)，活菌數(shù)最高，為4.57×109cfu/mL，說明氮源的用量在較高濃度區(qū)域時(shí)，有利于細(xì)菌發(fā)酵活菌數(shù)的增加。

圖3 不同碳氮比對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of carbon source nitrogen source ratio addition on counts of viable bacteria

2.2 磷酸鹽對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)的影響

從圖4可見，培養(yǎng)基中添加等量的磷酸二氫鉀作為培養(yǎng)基磷源時(shí)，維氏氣單胞菌CA07活菌數(shù)為4.43×109cfu/mL，最高且顯著高于其他組(P<0.05 )，其次為磷酸氫二鈉。因此，選擇磷酸二氫鉀作為培養(yǎng)基磷源。磷酸二氫鉀的添加量在1.5 g/L時(shí)，維氏氣單胞菌CA07活菌數(shù)最高(圖5)。

圖4 磷酸鹽種類對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of phosphate types on counts of viable bacteria

圖5 磷酸二氫鉀添加量對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of KH2PO4 on counts of viable bacteria

2.3 硫酸鹽對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)的影響

從圖6可見，在培養(yǎng)基中添加等量的硫酸鹽條件下，添加硫酸鎂時(shí)，維氏氣單胞菌CA07菌液活菌數(shù)最高為4.59×109cfu/mL，且顯著高于其他組 (P<0.05)，其次為硫酸亞鐵，最低為硫酸錳。因此，選擇硫酸鎂作為培養(yǎng)基無機(jī)鹽。硫酸鎂為0.40 g/L時(shí)，維氏氣單胞菌CA07的活菌數(shù)最高(圖7)。

圖6 硫酸鹽種類對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.6 Effect of sulfate types on counts of viable bacteria

圖7 硫酸鎂添加量對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.7 Effect of MgSO4 on counts of viable bacteria

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取碳氮比(A)、硫酸鎂(B)和磷酸二氫鉀(C)3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)(表1)，以活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值，維氏氣單胞菌活菌數(shù)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface model

2.4.3 響應(yīng)面圖分析 各因素交互作用對(duì)菌株發(fā)酵活菌數(shù)結(jié)果的影響見圖8。當(dāng)3個(gè)因素其中之一固定為零水平時(shí)，其他兩個(gè)因素存在交互作用且存在一個(gè)活菌數(shù)最大值的組合點(diǎn)。在3組交互影響的圖中，可以看出當(dāng)其中一個(gè)因素固定時(shí)，隨著另一因素的增大，維氏氣單胞菌活菌數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

圖8 各因素交互作用對(duì)活菌數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on counts of viable bacteria

由圖8可以看出，當(dāng)硫酸鎂用量固定時(shí)，活菌數(shù)隨碳氮比及磷酸二氫鉀用量的變化幅度較大，而活菌數(shù)隨著硫酸鎂用量的變化幅度較小，氮碳比、磷酸二氫鉀對(duì)發(fā)酵維氏氣單胞菌CA07的影響較為顯著。通過最優(yōu)化分析，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方組成及用量：胰蛋白胨10.8 g/L，葡萄糖5.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.4 g/L。

2.5 發(fā)酵活菌數(shù)比較試驗(yàn)

通過對(duì)優(yōu)化后培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基在發(fā)酵維氏氣單胞菌活菌數(shù)的比較，優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)維氏氣單胞菌活菌數(shù)為5.94×109cfu/mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)維氏氣單胞菌活菌數(shù)為4.15×109cfu/mL，活菌數(shù)增加了43.13%，效果顯著(圖9)。

圖9 維氏氣單胞菌兩種培養(yǎng)基的比較Fig.9 Comparison among the two culture mediums of Aeromonas veronii

2.6 免疫效力比較試驗(yàn)

免疫效力比較結(jié)果見表4，以優(yōu)化培養(yǎng)基制備的滅活疫苗相對(duì)免疫保護(hù)率為77.78%，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備的滅活疫苗相對(duì)免疫保護(hù)率為62.97%以上，以優(yōu)化培養(yǎng)基制備的滅活疫苗相對(duì)免疫保護(hù)率提高了14.81%。通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成在獲得更高的活菌數(shù)同時(shí)，能顯著提高該疫苗的相對(duì)免疫保護(hù)率。

表4 不同發(fā)酵培養(yǎng)基菌液制備的疫苗免疫效力比較Table 4 Comparison of immune efficacy of vaccines prepared by different fermentation mediums

2.7 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵生長(zhǎng)試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，配制含蛋白胨10.8 g/L、牛肉膏3.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、硫酸鎂0.40 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，300 r/min培養(yǎng)12 h，維氏氣單胞菌生長(zhǎng)曲線見圖10。結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌CA07培養(yǎng)10～12 h進(jìn)入生長(zhǎng)高峰期，發(fā)酵10 h達(dá)到生長(zhǎng)高峰，活菌數(shù)達(dá)到8.85×109cfu/mL，發(fā)酵12 h后進(jìn)入衰亡期。

圖10 維氏氣單胞菌發(fā)酵生長(zhǎng)曲線Fig.10 Growth curve of Aeromonas veronii during the fermentation

3 討 論

本研究以發(fā)酵維氏氣單胞菌菌液活菌數(shù)為目標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化，對(duì)碳氮比、硫酸鎂、磷酸二氫鉀三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果顯示模型顯著，失擬不顯著，說明這個(gè)因素對(duì)維氏氣單胞菌菌液活菌數(shù)有顯著影響。建立了一個(gè)維氏氣單胞菌活菌數(shù)產(chǎn)量與三個(gè)因素的數(shù)學(xué)模型，此模型能很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其預(yù)測(cè)條件與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)基本吻合。得到維氏氣單胞菌的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為胰蛋白胨10.8 g/L，葡萄糖5.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，發(fā)酵活菌數(shù)為5.94×109cfu/mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)維氏氣單胞菌活菌數(shù)為4.15×109cfu/mL，活菌數(shù)增加了43.13%。在此發(fā)酵培養(yǎng)基條件下維氏氣單胞菌在7 L發(fā)酵罐活菌數(shù)達(dá)到8.85×109cfu/mL。相較于BHI、TSB等商品化培養(yǎng)基，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基能顯著降低生產(chǎn)成本。

通常對(duì)細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化多采用單因素法、正交試驗(yàn)法、響應(yīng)面法。單因素試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，但忽略了因素之間的交互作用；正交設(shè)計(jì)無法確定試驗(yàn)影響因素的最佳組合和試驗(yàn)結(jié)果響應(yīng)值的最大值；響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)整個(gè)面進(jìn)行全面分析，研究因素與響應(yīng)值之間，因素與因素之間的關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化，得到的數(shù)據(jù)更精確、更全面，對(duì)試驗(yàn)有顯著影響的因素都可以應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行優(yōu)化[14]。較多的研究采用響應(yīng)面法對(duì)芽胞桿菌、乳酸桿菌等發(fā)酵培養(yǎng)基組分、用量進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)[15-17]。本研究使用的響應(yīng)面法即可考察因素之間的交互作用，又可尋找到整個(gè)區(qū)域內(nèi)的最優(yōu)解，進(jìn)一步降低了培養(yǎng)基用量，從而降低成本。通過單因素試驗(yàn)確定了主要培養(yǎng)基種類及最佳適用量范圍后，再通過響應(yīng)面分析充分考慮活菌數(shù)與用量之間的交互作用，并通過相應(yīng)曲面尋找最優(yōu)解。

細(xì)菌疫苗免疫效力的提升方法常見的包括改造菌株抗原制備亞單位疫苗、活疫苗、DNA疫苗等，或者通過與佐劑等提呈作用以達(dá)到提高免疫效力的目的，具有較好的效果，然而這些方法較為復(fù)雜、成本相對(duì)較高。本研究通過對(duì)細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成、用量的優(yōu)化最終獲得低成本、高效的疫苗目標(biāo)。優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵菌液制備的滅活疫苗免疫鯽魚的相對(duì)免疫保護(hù)率為77.78%，相對(duì)免疫保護(hù)率比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了14.81%，表明優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵菌液制備的滅活疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果。