宋佳凝，馮國維

陜西省西安市兒童醫(yī)院口腔科，陜西西安 710003

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔癌常見病理分型，起源于口腔黏膜基底細(xì)胞層。流行病學(xué)調(diào)查顯示，國內(nèi)OSCC的發(fā)病有年輕化趨勢，國內(nèi)每年約有4.56萬OSCC新發(fā)病例，5年生存率僅30.0%[1]。既往多關(guān)注成人OSCC，而有關(guān)OSCC在兒童中的報(bào)道較少。腫瘤細(xì)胞侵襲遷移是OSCC不良預(yù)后的高危因素[2]。既往研究證實(shí)，微小RNA(miRNA)作為內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA，參與癌基因的激活或沉默表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲遷移[3]。報(bào)道顯示，miR-382-5p在乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[4-5]，推測miR-382-5p可能參與OSCC腫瘤細(xì)胞侵襲。抑癌基因張力蛋白同源基因(PTEN)具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶雙重磷酸酶活性，CHEN等[6]提出miR-382-5p與PTEN存在靶向作用關(guān)系，推測這可能是miR-382-5p調(diào)控OSCC腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。為驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究收集本院12例OSCC患兒臨床資料，并開展基礎(chǔ)試驗(yàn)研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年3月至2021年3月本院收治的12例OSCC患兒作為研究對象，取癌組織和癌旁組織作為檢測標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患兒均經(jīng)病理活檢確診為OSCC[7]；(2)臨床病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他惡性腫瘤者；(2)既往接受放化療或其他抗腫瘤治療者；(3)合并有嚴(yán)重心肺基礎(chǔ)疾病或肝腎功能不全者。12例患兒中男7例，女5例；年齡(9.42±3.36)歲；體質(zhì)量指數(shù)(16.73±2.26)kg/m2；腫瘤部位：舌4例，口底3例，軟腭2例，硬腭2例，唇1例；腫瘤分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期3例，Ⅲ期2例；分化程度：低分化6例，中分化5例，高分化1例。

1.2試劑 OSCC細(xì)胞CAL-27由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及胰酶-EDTA購自Gibco公司，D-hanks液購自南京森貝伽生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海賓智生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 采用含10% FBS的DMEM在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中對CAL-27細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，棄培養(yǎng)基后采用D-hanks液洗滌細(xì)胞3次，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。以對數(shù)生長期細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對象，種植于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞融合度≥50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以Lipofectamine RNAi Max轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-382-5p抑制物至CAL-27細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行。根據(jù)轉(zhuǎn)染內(nèi)容不同分為si-NC組(以Lipofectamine RNAi Max轉(zhuǎn)染miR-NC)和miR-382-5p抑制物組(以Lipofectamine RNAi Max轉(zhuǎn)染miR-382-5p抑制物)。

1.3.2細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn) 細(xì)胞遷移試驗(yàn)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后用胰酶-EDTA消化細(xì)胞，制備成106個(gè)/毫升濃度的細(xì)胞基液；分別在Transwell上室和下室加入100 μL細(xì)胞懸液和500 μL含10% FBS的DMEM，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h；取出小室，擦凈后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗；采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色；隨機(jī)取4～6個(gè)視野，計(jì)算視野內(nèi)穿過濾膜細(xì)胞數(shù)；以平均細(xì)胞數(shù)為遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)：取0.5 g/L Matrigel 人工基質(zhì)膠20 μL，置于Transwell上室，在37 ℃條件下孵育4.0 h，Matreigel凝固后去殘留液體，參照遷移試驗(yàn)方法制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞染色，根據(jù)干預(yù)方法不同將試驗(yàn)細(xì)胞分為miR-382-5p抑制物+si-NC組(轉(zhuǎn)染miR-382-5p抑制物陰性序列對照)和miR-382-5p抑制物+si-PTEN組(轉(zhuǎn)染miR-382-5p抑制物+PTEN小干擾RNA)，記錄兩組細(xì)胞侵襲遷移數(shù)。

1.3.3qPCR檢測 癌組織和癌旁組織解凍后送檢，采用Trizol法提取總RNA，以RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，完成后進(jìn)行qPCR反應(yīng)，引物設(shè)計(jì)見表1，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計(jì)算miR-382-5p和PTEN相對表達(dá)量。

表1 qPCR引物序列

1.3.4雙熒光素酶試驗(yàn) 采用Targetscan(http：//www.targetscan.org)對miR-382-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測，PTEN mRNA的野生型3′-UTR和突變型3′-UTR連接psi-CHECK-2載體，分別為PTEN-WT和PTEN-MUT(CAL-27細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-382-5p抑制物200 nmol/L)，根據(jù)共轉(zhuǎn)染對象不同分別記為PTEN-WT+miR-NC組、PTEN-WT+miR-382-5p組、PTEN-MUT-miR-NC組及PTEN-MUT-miR-382-5p組。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞裂解，采用Dual-Luciferase?Report Assay System 雙熒光報(bào)告酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1兩組細(xì)胞侵襲遷移試驗(yàn)結(jié)果 miR-382-5p抑制物組和si-NC組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(178.25±30.29)個(gè)和(142.46±26.83)個(gè)，兩組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(253.32±62.08)個(gè)和(202.41±54.54)個(gè)，兩組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.064，2.134；P=0.006，0.044)。

2.2miR-382-5p靶基因 通過軟件預(yù)測顯示，PTEN可能是miR-382-5p潛在靶基因，見圖1。miR-382-5p和PTEN在癌組織中的相對表達(dá)水平分別為0.87±0.31和0.72±0.26，癌旁組織相對表達(dá)水平分別為0.62±0.19和0.51±0.20。癌組織和癌旁組織miR-382-5p和PTEN相對表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.382，2.218；P=0.026，0.037)。雙熒光素酶試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，PTEN-WT+miR-NC組和PTEN-WT+miR-382-5p組熒光活性變化倍數(shù)分別為0.87±0.12和0.33±0.09，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.471，P<0.05)，PTEN-MUT-miR-NC組和PTEN-MUT-miR-382-5p組熒光活性變化倍數(shù)分別為0.79±0.22和0.77±0.18，兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.244，P=0.810)。

注：Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，PTEN 3′UTR存在miR-382-5p結(jié)合位點(diǎn)。圖1 Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果

2.3抑制PTEN表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-382-5p對CAL-27細(xì)胞遷移侵襲的影響 miR-382-5p抑制物+si-NC組和miR-382-5p抑制物+si-PTEN組細(xì)胞遷移數(shù)分別為(170.45±35.56)個(gè)和(274.10±81.36)個(gè),細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(138.96±32.25)個(gè)和(180.04±25.63)個(gè)，兩組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.044，3.455；P=0.001，0.002)。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞侵襲遷移是OSCC生長轉(zhuǎn)移的重要病理基礎(chǔ)，而腫瘤細(xì)胞與腫瘤局部微環(huán)境的相互作用與OSCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，二者共同作為靶點(diǎn)[8]，這將是優(yōu)化OSCC治療方案的重要方向。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)是腫瘤微環(huán)境主要的間質(zhì)細(xì)胞，來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，基礎(chǔ)研究證實(shí)CAFs可通過分泌趨化因子、生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而加快腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤血管生成[9]。曹娟等[10]還發(fā)現(xiàn)CAFs可通過外泌體調(diào)控OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為。因而，本研究選取CAF-27作為OSCC細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

miRNA作為非編碼單鏈RNA分子，通過與靶mRNA 3′-UTR區(qū)特異性位點(diǎn)結(jié)合，降解mRNA，從而調(diào)控靶基因，發(fā)揮生物學(xué)功能，參與腫瘤癌變[11]。miR-382-5p已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，趙樹鵬等[12]發(fā)現(xiàn)miR-382-5p可通過介導(dǎo)PTEN表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖侵襲，而劉冬冬等[13]則發(fā)現(xiàn)miR-382-5p可通過抑制PTEN阻斷白血病NB4細(xì)胞分化。PTEN編碼蛋白由N端磷酸酶催化域和C端結(jié)構(gòu)域2個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，定位于10q23.3染色體，是機(jī)體重要抑癌基因，PTEN活性作用可通過磷酸化、泛素化、乙酰化等多種途徑參與下游基因的調(diào)節(jié)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[14]。PORS等[15]也認(rèn)為PTEN可經(jīng)細(xì)胞核參與細(xì)胞染色體DNA的修復(fù)，并通過PIK/AKT信號通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移侵襲。另外，PTEN通過小泛素樣修飾蛋白分子翻譯后途徑參與腫瘤生物學(xué)行為[16]。但PTEN是否參與CAF-27細(xì)胞分裂增殖，臨床尚未形成定論。

本研究行細(xì)胞侵襲遷移試驗(yàn)，結(jié)果顯示，miR-382-5p可促進(jìn)OSCC細(xì)胞侵襲，而雙熒光素酶試驗(yàn)檢測進(jìn)一步說明PTEN為miR-382-5p的靶基因，提示miR-382-5p可與PTEN的3′-UTR區(qū)位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控OSCC生長。另外，本研究行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Transwell試驗(yàn)檢測，結(jié)果顯示，miR-382-5p抑制物+si-PTEN組細(xì)胞侵襲遷移數(shù)顯著增加，這提示抑制PTEN表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-382-5p抑制物對CAL-27細(xì)胞侵襲遷移的抑制作用。此外，本研究收集OSCC患兒癌組織和癌旁組織，采用qPCR法進(jìn)一步證實(shí)miR-382-5p和PTEN在癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)水平不同，結(jié)果也說明miR-382-5p可能通過調(diào)控PTEN參與OSCC病理進(jìn)程。

綜上所述，miR-382-5p在OSCC患兒中呈高表達(dá)，可能通過調(diào)控PTEN參與CAL-27細(xì)胞的侵襲遷移。