王天琦,劉紫雯,史曉淵,王永暉,王鑫瑞,任 薇,黃炳艦,王長法,2*

(1.聊城大學(xué) 黑毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東 聊城 252000；2.山東省驢產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 聊城 252000)

隨著人們生活水平的提高，驢肉高蛋白、低脂肪的特性越來越受人們喜愛，更多的人開始食用驢肉，但國家統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明近十年來驢的存欄量已經(jīng)從510.1萬頭降至2020年的232.43萬頭(中國統(tǒng)計(jì)年鑒，2002-2020)。和豬、禽等經(jīng)濟(jì)動物相比，驢生長周期長、孕期長，這也限制了驢養(yǎng)殖數(shù)量的快速恢復(fù)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)德州驢胸椎骨數(shù)目有三種類型，分別為17、18、19根，腰椎骨數(shù)目有兩種類型，分別為5根和6根，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)德州驢多一根椎骨，其體長、胴體重均有一定的正增長，胸椎數(shù)增加一根，體長平均增加5.14 cm，胴體重平均增加11.17 kg；腰椎數(shù)增加一根，體長平均增加 2.0 cm，胴體重平均增加2.83 kg。因此，在驢分子育種領(lǐng)域進(jìn)行與胸腰椎數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記研究,選育多胸腰椎數(shù)驢個體，對于提高驢產(chǎn)肉及產(chǎn)皮量具有重要意義。先前研究表明基因其多態(tài)性與多個物種的體重、體高、骨骼以及體型有關(guān)，然而該基因?qū)H生長性狀和胸腰椎數(shù)性狀的影響沒有相關(guān)研究報道?；诨蛟谄渌麆游镏械难芯砍晒茰y該基因極可能與驢胸腰椎數(shù)性狀相關(guān)。基于此，本文綜述了基因及其對家畜生長性狀影響的研究進(jìn)展，期待為基因?qū)H胸腰椎數(shù)性狀影響的下一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 驢LCORL基因及蛋白的結(jié)構(gòu)

1.1 驢LCORL基因結(jié)構(gòu)

在NCBI數(shù)據(jù)庫檢索到了人、牛、馬、小鼠、羊、豬的基因，但未檢索到驢基因，在Ensembl數(shù)據(jù)庫檢索到了驢的該基因信息(見表1)。在驢上，該基因有兩個轉(zhuǎn)錄本，分別由6、7個外顯子組成，在其他物種中該基因轉(zhuǎn)錄本都較多，這可能與該基因序列長，核苷酸序列均在1.4～1.9 bp，外顯子數(shù)目多相關(guān)。除驢外，基因在其他物種中外顯子數(shù)目均在10個以上，因此發(fā)生可變剪切的可能性也就更大。驢基因編碼區(qū)核苷酸序列結(jié)構(gòu)簡圖見圖1，對驢基因兩個轉(zhuǎn)錄本的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個轉(zhuǎn)錄本外顯子數(shù)目不同，轉(zhuǎn)錄本1無外顯子7；此外兩個轉(zhuǎn)錄本的第1外顯子序列也存在差異，轉(zhuǎn)錄本2的第1外顯子比轉(zhuǎn)錄本1多91個核苷酸。

表1 不同物種中的LCORL基因的信息Table 1 Information of LCORL genes in different species

圖1 驢LCORL基因編碼區(qū)核苷酸序列結(jié)構(gòu)簡圖Fig. 1 Nucleotide sequence structure of the coding region of the Donkey LCORL gene

1.2 驢LCORL蛋白結(jié)構(gòu)

利用Psipred在線程序預(yù)測驢LCORL蛋白二級結(jié)構(gòu)(見圖2)，圖2A為轉(zhuǎn)錄本1翻譯得到的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)模式圖，圖2B為轉(zhuǎn)錄本2翻譯得到的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)模式圖。轉(zhuǎn)錄本1翻譯得到的蛋白質(zhì)由318個氨基酸殘基構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，其中α-螺旋由153個氨基酸殘基組成，占整個二級結(jié)構(gòu)的48.11%；無規(guī)卷曲由151個氨基酸構(gòu)成，占整體的47.48%；伸展鏈由14個氨基酸殘基構(gòu)成，在整體中所占比例為4.4%。轉(zhuǎn)錄本2翻譯得到的蛋白質(zhì)由518個氨基酸殘基構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主，由271個氨基酸殘基組成，占整個二級結(jié)構(gòu)的52.32%；α-螺旋由211個氨基酸構(gòu)成，占整體的40.73%；伸展鏈由36個氨基酸殘基構(gòu)成，在整體中所占比例為 6.95%。

圖2 驢LCORL蛋白轉(zhuǎn)錄本1和轉(zhuǎn)錄本2二級結(jié)構(gòu)模式圖Fig. 2 Secondary structure pattern of transcript 1 and transcript 2 of donkey LCORL protein

由于PDB數(shù)據(jù)庫沒有收錄該蛋白三維結(jié)構(gòu)，因此利用 Phyre2在線工具中Normol模式對LCORL三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測， LCORL蛋白三級結(jié)構(gòu)如圖3所示，圖3A為轉(zhuǎn)錄本1翻譯得到的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖，圖3B為轉(zhuǎn)錄本2翻譯得到的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖，顯示兩個轉(zhuǎn)錄本翻譯得到的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相似，均含有多種二級結(jié)構(gòu)單元，以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，這與預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)相符。

圖3 驢LCORL蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig. 3 Predicted tertiary structure of donkey LCORL protein

用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測轉(zhuǎn)錄本1翻譯得到的蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域，未發(fā)現(xiàn)有任何結(jié)構(gòu)域；對轉(zhuǎn)錄本2翻譯得到的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)第196到229個及第442到487個氨基酸區(qū)域?yàn)镠TH psq超家族(HTH psq super family)結(jié)構(gòu)域。HTH psq超家族結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA結(jié)合域，是一個約由50 個氨基酸組成的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)域。Psq在果蠅中是重要的發(fā)育調(diào)節(jié)因子，Glehmann等研究表明，Psq在卵子發(fā)生、胚胎模式形成和成蟲發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

2 LCORL基因的生物學(xué)功能

2.1 對體重的影響

大量研究表明基因與家畜的體重密切相關(guān)。Purfield等檢測與胴體重相關(guān)的基因組區(qū)域，結(jié)果表明包含基因的區(qū)域與胴體重顯著相關(guān)。Lindholm-Perry等發(fā)現(xiàn)牛基因區(qū)域中的位于38255270、38284737、38376731 bp處的三個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與胴體重和脂肪厚度顯著相關(guān)。Tozaki等發(fā)現(xiàn)基因與日本純種賽馬體重顯著相關(guān)。Han等結(jié)果表明，位于內(nèi)含子1的SNP g. INT+52098A>G位點(diǎn)與秦川牛胴體重顯著相關(guān)。

對不同性別牛基因與采食量以及平均日增重的關(guān)系也有一定的研究，Lindholm-Perry等研究發(fā)現(xiàn)，公牛和母牛肌肉組織中基因轉(zhuǎn)錄本豐度均與平均日采食量(ADFI)呈正相關(guān)，LCORL蛋白水平也與ADFI呈正相關(guān)；而在母牛的脂肪組織中，基因轉(zhuǎn)錄本豐度與ADFI呈負(fù)相關(guān)，在公牛脂肪組織中該基因轉(zhuǎn)錄本豐度與ADFI未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，這表明該基因還可作為評估生長性能的一個重要遺傳標(biāo)記。

2.2 對體高的影響

在馬上有大量研究表明該基因與體高之間的相關(guān)性。Tozaki等通過對322匹純血馬基因附近的BIEC2-808543位點(diǎn)(位置見圖4)基因型與體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)公馬和母馬的體高均與該位點(diǎn)基因型顯著相關(guān)，與基因型的馬相比，具有基因型的馬體高更高，兩種基因型的公馬體高的最大差異為1.8 cm，母馬為2.1 cm。Metzger等通過對包含42個不同品種在內(nèi)的1851 匹馬進(jìn)行GWAS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體高在130 cm和160 cm之間的馬在BIEC2-808543位點(diǎn)為基因型和基因型，而體高在160 cm以上的馬則主要表現(xiàn)出基因型。在伊犁馬上也證明了具有C等位基因的馬比沒有該等位基因的馬體高更高，基因型的馬體高顯著大于和基因型馬，Signer-Hasler等的研究同樣證明了這一點(diǎn)。

圖4 馬LCORL基因及其臨近基因以及BIEC2-808543位點(diǎn)分布圖Fig. 4 Distribution of horse LCORL gene, its proximategenes and BIEC2-808543 locus

緬甸本地馬和寧強(qiáng)矮馬均為小型馬，在這兩種小型馬基因上游發(fā)現(xiàn)的BIEC2-808543 SNP位點(diǎn)存在明顯的優(yōu)勢等位基因。Okuda等研究了7個緬甸本地馬群體中的基因上游BIEC2-808543 SNP位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率，基因分型結(jié)果顯示與體高相關(guān)的C等位基因頻率為0.08～0.27，平均為0.13，在緬甸本地馬中C等位基因頻率極低。Bai等對22匹寧強(qiáng)矮馬的基因上游的BIEC2-808543 SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該SNP位點(diǎn)T等位基因與寧強(qiáng)矮馬的體高顯著相關(guān)。表明基因的SNP突變可以作為緬甸本地馬和寧強(qiáng)矮馬體高的篩選標(biāo)記，為稀有種質(zhì)資源的選育和保護(hù)提供新的方法。

綜上所述，BIEC2-808543位點(diǎn)可以作為馬體高的遺傳診斷標(biāo)記，BIEC2-808543位點(diǎn)TC突變破壞了轉(zhuǎn)錄因子TFIID的一個特定結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生改變。轉(zhuǎn)錄因子TFIID是一種大型多蛋白組裝體，可作為真核生物RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄起始的通用轉(zhuǎn)錄因子，Metzger等的研究發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子對基因的轉(zhuǎn)錄過程非常重要。因此BIEC2-808543位點(diǎn)的突變破壞了轉(zhuǎn)錄因子TFIID的結(jié)合位點(diǎn)，造成基因轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生改變，最終導(dǎo)致基因表達(dá)量發(fā)生改變，從而影響體高的差異。

2.3 對骨骼的影響

基因的表達(dá)還與骨骼發(fā)育之間存在相關(guān)性。Chen等通過對31頭婆羅門牛和131頭云嶺牛進(jìn)行GWAS，發(fā)現(xiàn)與體型性狀有關(guān)的重要位點(diǎn)20個，其中與尻寬最顯著相關(guān)的SNP位于基因，該SNP位于38272802 bp處。Jennifer等在利木贊牛的6號染色體中鑒定了與胸寬、胸深具有高度關(guān)聯(lián)的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)，該QTL包含 NCAPG/LCORL 復(fù)合體，且鑒定了該QTL與利木贊牛的尻寬顯著相關(guān)。Staiger等發(fā)現(xiàn)在基因3'末端的候選位點(diǎn)與馬的骨骼大小相關(guān)。野豬的馴化和隨后的選擇導(dǎo)致家豬包括體長和椎骨數(shù)目等許多性狀發(fā)生了顯著變化，Carl-Johan等利用全基因組重測序來探究影響這一變化的基因座，結(jié)果表明基因與體長和椎骨數(shù)目密切相關(guān)。Miao等為了確定骨重的遺傳決定因素，對1225頭西門塔爾牛骨重性狀進(jìn)行了GWAS，結(jié)果表明包括基因在內(nèi)的7個基因是影響骨重的候選基因，Chang等的研究也表明了同樣的結(jié)果。Silvia等發(fā)現(xiàn)了基因與皮埃蒙特牛的難產(chǎn)顯著相關(guān)，骨盆狹窄是造成牛難產(chǎn)的一大因素，這可能是由于髖骨小造成的，可以推測該基因與髖骨大小具有相關(guān)性，但還需進(jìn)一步研究。Soranzo等發(fā)現(xiàn)基因與人髖關(guān)節(jié)軸長顯著相關(guān)。Healey等發(fā)現(xiàn)基因與犬的脛骨長度、外側(cè)脛骨骨干寬度、脛骨結(jié)節(jié)長度相關(guān)。

軟骨病在馬中是一種常見的疾病，主要影響馬關(guān)節(jié)/骨骺復(fù)合體的軟骨生長，患馬的軟骨可增厚、塌陷，嚴(yán)重情況下軟骨會發(fā)生斷裂，導(dǎo)致解剖性軟骨病。Naccache等通過GWAS確定了基因上游的BIEC2-808543位點(diǎn)與跗關(guān)節(jié)軟骨病密切相關(guān)。Sevane等探究了與 144 匹西班牙純種馬體型大小相關(guān)的基因座并尋找與軟骨病病變相關(guān)的基因座之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BIEC2-808543位點(diǎn)，和基因型的馬相比基因型的馬體高和體長分別平均增加了3.6%和4.5%，這也導(dǎo)致了粗大的膝關(guān)節(jié)和管圍，使軟骨病發(fā)生的風(fēng)險大大提高。

2.4 對體型的影響

在馬上已發(fā)現(xiàn)少量對體型具有較大影響的等位基因位點(diǎn)，這些基因在馴化過程中被反復(fù)選擇，作為極端體型多樣化的主要驅(qū)動因素，其中，多個研究表明基因與馬的體型顯著關(guān)聯(lián)。Makvandi-Nejad等研究發(fā)現(xiàn)，基因上游的BIEC2-808543 SNP位點(diǎn)與馬的體型大小顯著關(guān)聯(lián)。Grilz-Seger等利用基因分型技術(shù)，對來自12個品種的1476匹馬進(jìn)行連續(xù)純合片段(runs of homozygosity, ROH)分析，通過品種間比較鑒別出具有選擇特征的ROH島，并對種群間的相似性和差異性進(jìn)行評估，確定了與毛色、奔跑能力、環(huán)境適應(yīng)能力以及體型等性狀相關(guān)的基因，其中基因與體型大小顯著相關(guān)。Abri等研究發(fā)現(xiàn)，基因在六個不同品種中均與體型大小顯著相關(guān)。另外Gurgul等結(jié)果也證實(shí)了基因與胡克爾馬和科尼克馬體型的關(guān)聯(lián)性。

建昌馬和安寧果下馬都屬于中國矮馬。周凡莉等隨機(jī)選取了16頭建昌馬和4頭安寧果下馬，檢測已經(jīng)報道的的SNP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建昌馬和安寧果下馬基因的上游的BIEC2-808543位點(diǎn)存在明顯的優(yōu)勢等位基因，該位點(diǎn)的T等位基因占明顯優(yōu)勢，等位基因頻率在0.8以上，可推測基因上游的BIEC2-808543位點(diǎn) T 等位基因與建昌馬和安寧果下馬的小體型性狀相關(guān)。

基因除在馬上研究較多外，在其他動物上也有研究。Saif等研究發(fā)現(xiàn)，5個中大型巴基斯坦山羊品種在6號染色體上的一個區(qū)域有一個共同的選擇標(biāo)志，而基因也位于此區(qū)域。Signer-Hasler等對來自8個瑞士本土綿羊品種的939只綿羊個體進(jìn)行特征基因篩選，發(fā)現(xiàn)基因是與體型最顯著相關(guān)的選擇信號。He等對635頭中國美利奴羊的ROH運(yùn)行的數(shù)量、長度和頻率進(jìn)行了估算，并使用OvineSNP50全基因組基因分型芯片確定了基因是與體型相關(guān)的候選基因。Sahana等的研究表明基因與北歐紅牛新生犢牛和成年后體型均具有顯著相關(guān)性。在驢上，Shen等對包含體型大小不同的12個品種在內(nèi)的78頭驢進(jìn)行選擇性掃描、基因注釋、功能富集和差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了包括基因在內(nèi)的與快速生長和大體型相關(guān)的選擇性信號,在基因上發(fā)現(xiàn)了11個非同義位點(diǎn)，這些非同義位點(diǎn)的基因型在大小體型驢之間存在顯著差異。此外，對基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果表明該區(qū)域的SNP具有強(qiáng)連鎖，因此該基因可作為影響驢生長性狀的遺傳標(biāo)記。

3 LCORL基因的表達(dá)

國內(nèi)外關(guān)于基因在各組織器官中表達(dá)水平的研究存在大量報道，這些研究對于進(jìn)一步驗(yàn)證基因的功能具有重要意義。Metzger等利用RT-qPCR探究基因在馬毛囊中的表達(dá)量時發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)水平與BIEC2-808543位點(diǎn)的基因型有明顯的關(guān)聯(lián)，相對于基因型馬，在基因型馬中基因的表達(dá)水平降低了40%，在基因型馬中降低了56%，結(jié)合上文描述的該SNP位點(diǎn)的基因型與體型之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步證明基因?yàn)檩^有希望的體型性狀候選基因。

對睪丸、毛囊、大腦、腎臟、肌肉和肝臟組織的半定量表達(dá)分析表明，基因及鄰近基因和16(位置見圖4)在這些組織和毛根的表達(dá)量基本相同，因此可選擇馬這6個組織中的任一個組織進(jìn)行該基因的表達(dá)水平分析。La等采用RT-qPCR對基因在湖羊組織中的分布進(jìn)行研究，結(jié)果表明該基因在湖羊組織表達(dá)廣泛，在心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、十二指腸、肌肉、脂肪、下丘腦、垂體11個組織中均有發(fā)現(xiàn)，其中在脾臟、十二指腸和肺部表達(dá)水平最高。Liu等使用RT-qPCR分析確定了成年秦川牛和受精后135 d的胚胎背腰最長肌中、和16三個基因的相對表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三個基因在胎兒肌肉中表達(dá)量均高于成年牛，且在三個基因中基因表達(dá)量最高。在驢上，Wang等對驢包括心、肝、脾、肺、腎等在內(nèi)的16個組織進(jìn)行了RNA-seq，確定了基因在各組織相對表達(dá)量，其中附睪和夜眼的表達(dá)水平最高，在血液表達(dá)水平最低，其次為肝臟。

4 小結(jié)和展望

綜上所述，基因可作為影響椎骨發(fā)育的候選基因之一，目前對該基因結(jié)構(gòu)以及功能的研究較成熟，還發(fā)現(xiàn)該基因?qū)倚笊L性狀具有影響。盡管基因?qū)ιL性狀影響的大量研究都是該基因與單一性狀之間的關(guān)聯(lián)性，但也有一些研究描繪了該基因與多個生長性狀之間的關(guān)聯(lián)性，這是目前研究的一個新熱點(diǎn)。驢生長速度慢、養(yǎng)殖利潤低等成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，基因?qū)H椎骨數(shù)量的影響以及作用機(jī)制還需要大量的研究，從而可以提高產(chǎn)皮量及產(chǎn)肉量，獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。