葉 華， 鮑佐寶， 馬 垚 , 張喜玲, 姜城紅, 郭元新*

(1.江蘇科技大學(xué) 糧食學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212100)

(2.安徽科技學(xué)院 食品工程學(xué)院， 鳳陽(yáng) 233100)

γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA transaminaseGABA-T，EC2.6.1.19)是植物GABA轉(zhuǎn)化途徑中的第一步關(guān)鍵酶，可能與GABA的富集具有一定的聯(lián)系[1-3].目前，生產(chǎn)上提高植物GABA產(chǎn)量的主要方法是通過(guò)改進(jìn)提取工藝來(lái)提高產(chǎn)物收率[4-5]，但不能根本性解決產(chǎn)量問(wèn)題.有研究表明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制GABA次生代謝的關(guān)鍵酶基因，通過(guò)在目標(biāo)植物中實(shí)現(xiàn)GABA-T支路有關(guān)酶的高效表達(dá)或截?cái)喾种緩疥P(guān)鍵酶，從而改變代謝流的總量和流向，將顯著影響相關(guān)GABA的含量[6]，這可以從代謝調(diào)控相關(guān)基因方向開(kāi)發(fā)GABA高含量苦蕎品種.

近年來(lái)，高粱[7]、擬南芥[8]、水稻[9]、蘋(píng)果[10]等植物GABA-T基因相繼被克隆出來(lái).然而即使這些GABA-T基因同源性高，但它們都有著非常普遍的發(fā)育和組織器官的特異性以及亞細(xì)胞狀態(tài)的多樣性[11].很多研究表明，在一些脅迫境環(huán)境條件下，GABA-T對(duì)GABA的富集發(fā)揮著舉足輕重的作用[12].如文獻(xiàn)[13]研究發(fā)現(xiàn)水稻幼苗GABA在130 mM NaCl脅迫下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，同時(shí)其GABA-T轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含量也明顯上升.但目前有關(guān)發(fā)芽苦蕎中GABA-T基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦蕎進(jìn)行發(fā)芽處理，提取總RNA，然后利用RT-PCR、巢氏PCR 、RACE技術(shù)等成功克隆獲得了發(fā)芽苦蕎GABA-T基因，在此基礎(chǔ)上對(duì)GABA-T基因及其編碼的氨基酸進(jìn)行序列分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，為探討苦蕎GABA的合成代謝基因水平機(jī)制提供基礎(chǔ)，也為其它植物相關(guān)基因的研究提供借鑒意義.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

苦蕎：苦蕎一號(hào)，四川產(chǎn)，網(wǎng)購(gòu)于江蘇沭陽(yáng)縣新河鎮(zhèn)諾之星苗木經(jīng)營(yíng)部，購(gòu)買(mǎi)后置于4～8℃冰箱冷藏備用.

UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒(B511321)、第一鏈cDNA合成試劑盒(B532435)、柱式DNA膠回收試劑盒(B518131)、感受態(tài)細(xì)胞試劑盒(SK2301)、Reverse Transcriptase均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司，試驗(yàn)所用引物也由上海生工生物工程股份有限公司合成；LA Taq酶、 pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa Biotechnology (Dalian)公司； DNA分子量Marker: Marker(B600032)購(gòu)自BBI(Bio Basic Inc)公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純.

1.2 儀器和設(shè)備

PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，加拿大BBI公司；WS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)，江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，上海琪特分析儀器有限公司；YXJ-2離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；H6-1微型電泳槽，上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，Gene Genius公司；U-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，Hitachi公司；移液器，加拿大BBI公司.

1.3 發(fā)芽苦蕎制備

發(fā)芽苦蕎制備方法參考文獻(xiàn)[14]處理進(jìn)行制備，具體操作如下：取適量苦蕎種子，水浴浸泡(30 ℃)4 h后置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽(溫度30 ℃，濕度90%)5 d，期間每隔8 h換水1次，當(dāng)苦蕎芽長(zhǎng)至2～5 mm時(shí)，去除外殼，直接用于總RNA的提取.

1.4 引物合成及測(cè)序

本研究在前期獲得苦蕎轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定苦蕎GABA-T的中間序列，根據(jù)中間序列設(shè)計(jì)了3個(gè)接頭引物，即3’adaptor，5.3’outer，5.3’inner，以及一對(duì)特異性引物，即RC491-GABA-F1和RC491-GABA-F2，引物合成和測(cè)序均由上海生工生物工程股份有限公司完成.引物設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 引物設(shè)計(jì)

1.5 發(fā)芽苦蕎總RNA的提取

將1.3步驟制備的發(fā)芽苦蕎用于總RNA的提取，具體提取方法步驟參照上海生工UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒要求進(jìn)行.提取的總RNA分別用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳分析，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm以確保在1.8～2.0之間.

1.6 發(fā)芽苦蕎cDNA 第1鏈的合成

將發(fā)芽苦蕎總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體操作按照第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行.

1.7 3′ RACE獲得目的基因的3′端

1.7.1 目的cDNA的擴(kuò)增

目的cDNA擴(kuò)增分兩輪進(jìn)行：第一輪分別以RC491-GABA -F1和5.3’outer為發(fā)芽苦蕎GABA-T基因cDNA的正、反向引物，以GABA-T基因cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，72℃ 7 min，33個(gè)循環(huán))；第二輪巢氏PCR擴(kuò)增則以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，分別以RC491-GABA -F2和5.3’inner作為GABA-T基因cDNA正、反向引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增(95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火58 s，72℃延伸60 s，72℃ 7 min，33個(gè)循環(huán))，從而得到目的基因3’末端，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證.具體PCR反應(yīng)條件如表2.

表2 PCR反應(yīng)體系組成

1.7.2 目的片段的回收、純化、載體連接及轉(zhuǎn)化

PCR產(chǎn)物電泳后采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化.將純化后的目的片段按照操作說(shuō)明連接到pMD18-T載體上并進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞(SK2301)轉(zhuǎn)化.

1.7.3 菌落PCR及測(cè)序

以藍(lán)白斑法從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取陽(yáng)性單克隆，接入1 mL含有100 μg/mL Amp 的LB液體培育基中，在220 r/min轉(zhuǎn)速、37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)8～10 h后，以菌液為模板，以pMD18-T載上的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃ 10 min，25個(gè)循環(huán)).擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序.具體PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表3.

表3 菌落PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽苦蕎總RNA電泳結(jié)果

發(fā)芽苦蕎總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖1(a).從圖可以很明顯地看到28S和18S條帶，并且此時(shí)其亮度比值為2∶1，由此說(shuō)明RNA基本穩(wěn)定未降解，可用于下一步試驗(yàn).

圖1 電泳圖

2.2 3’端擴(kuò)增結(jié)果及序列拼接序列分析

圖1(b)為3’端RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果.由圖可以看到一條大小約為305 bp的條帶，將該目的片段進(jìn)行測(cè)序.隨后將其與苦蕎轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得的中間序列進(jìn)行拼接，得到長(zhǎng)度為1 556 bp的苦蕎GABA-T基因的全長(zhǎng)序列(表4). 利用ORF finder工具分析發(fā)現(xiàn)該發(fā)芽苦蕎GABA-T序列包含一個(gè)完整的1 347 bp(21-1 367)的開(kāi)放閱讀框即CDS序列和長(zhǎng)306 bp (1 251～1 556)的3’RACE擴(kuò)增序列；且GABA-T基因編碼448個(gè)氨基酸(表5).這與ProtParam(https://web.expasy.org /protparam/)程序預(yù)測(cè)發(fā)芽苦蕎GABA-T基因結(jié)果相同，其分子量為49.19 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.28.

表4 發(fā)芽苦蕎GABA-T基因cDNA序列

表5 發(fā)芽苦蕎GABA-T基因CDS區(qū)所推導(dǎo)氨基酸序列

2.3 發(fā)芽苦蕎GABA-T基因編碼的蛋白質(zhì)同源性分析

利用BLAST和DNAMAN軟件對(duì)發(fā)芽苦蕎GABA-T基因編碼的蛋白質(zhì)與藜麥、甜菜等10種植物來(lái)源的GABA-T基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性性分析和序列對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2可以看出發(fā)芽苦蕎GABA-T基因編碼的蛋白質(zhì)與菠菜(XP_021843601.1)和歐洲栓皮櫟樹(shù)GABA-T基因編碼的蛋白(XP_023870495.1)序列具有較高的相似度，其相似度分別達(dá)87.05%和86.83%.

圖2 GABA-T編碼氨基酸序列多重比較分析

(注釋：上圖中左側(cè)基因編號(hào)標(biāo)注依次為：Fagopyrumtataricum：苦蕎GABA-T；XP_023870495.1：歐洲栓皮櫟樹(shù)GABA-T；XP_021713818.1：藜麥GABA-T；XP_021275305.1：哥倫比亞錦葵GABA-T；XP_017980501.1：可可樹(shù)GABA-T；XP_012491166.1：雷蒙德氏棉GABA-T；XP_009349580.1：梨GABA-T；XP_022771798.1：榴蓮GABA-T；XP_015575910.1：蓖麻GABA-T；XP_010680154.1：甜菜GABA-T；XP_021843601.1：菠菜GABA-T)

2.4 發(fā)芽苦蕎GABA-T基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)化樹(shù)分析

為了解發(fā)芽苦蕎中GABA-T的進(jìn)化歷程，以及與其他植物GABA-T的親緣關(guān)系，對(duì)發(fā)芽苦蕎GABA-T與藜麥、甜菜等其他多種植物的GABA-T構(gòu)建系統(tǒng)利用MEG6.06軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果如圖3.從進(jìn)化樹(shù)分析圖可以看出，發(fā)芽苦蕎GABA-T與甜菜、藜麥和菠菜的GABA-T為同一分支，表明它們基因可能具有相同的起源.

圖3 GABA-T基因進(jìn)化樹(shù)分析

3 結(jié)論

文中將四川苦蕎一號(hào)進(jìn)行發(fā)芽處理提取總RNA，利用RT-PCR、巢式PCR和RACE技術(shù)擴(kuò)增成功獲得了發(fā)芽苦蕎GABA-T基因cDNA 3′末端基因，其長(zhǎng)度為1 556 bp，包括一個(gè)長(zhǎng)度為1 347 bp的開(kāi)放閱讀框.序列分析結(jié)果表明，其編碼一個(gè)全長(zhǎng)為448個(gè)氨基酸的蛋白，且其預(yù)測(cè)分子量 49.19 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.28.同源性分析結(jié)果表明，該基因序列與菠菜(Spinaciaoleracea)GABA-T3和蓖麻子(Ricinuscommunis)GABA-T1序列具有較高的相似度(相似度分別為82.79%和80.31%)；在氨基酸水平上，其與菠菜(Spinaciaoleracea)GABA-T3、歐洲栓皮櫟樹(shù)(Quercussuber)GABA-T3和藜麥(Chenopodiumquinoa)GABA-T3序列相似度分別為87.05%、86.83%和86.16%.進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因與甜菜、藜麥和菠菜的GABA-T為同一分支，表明它們基因可能具有相同的起源.