潘天龍，潘駿

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨腫瘤之一，由于其惡性程度高，侵襲性強，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，病情進展十分迅速，導致患者的長期生存率不高[1]。因為骨肉瘤細胞對放療不敏感，所以化療是骨肉瘤的主要臨床治療方法。尋找一種更加有效且不良反應較小的新型化療藥物則成為了骨肉瘤治療的主要方向。相關研究表明Wnt/β-catenin信號通路對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定的調(diào)控作用[2-3]。人參皂苷Rh2是人參皂苷中主要活性物質(zhì)的水解成分之一，具有多種藥理活性，其對肺癌、乳腺癌及黑色素瘤等腫瘤細胞均具有較強的抗腫瘤作用[4-5]。然而，對于Rh2在骨肉瘤細胞中具體的抗腫瘤作用的相關研究報導相對較少。因此，本研究旨在探討Rh2是否可以通過調(diào)節(jié)GSK-3β/Wnt雙信號通路抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲、遷移并誘導其凋亡，為骨肉瘤的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試劑 人參皂苷Rh2購于北京Solarbio科技有限公司；MMP2、MMP9、E-cadherin、Bcl-2、Bax、PARP均購自美國Cell Signaling Technology公司；Cyclin D1、GSK-3β、β-catenin、C-myc均購自美國Abcam Technology公司；胎牛血清、DMEM基本培養(yǎng)基等均購于美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞株U2OS和MG63購自上海基因化學有限公司。U2OS和MG63骨肉瘤細胞均在含有10%的胎牛血清，1%青、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中的條件為37 ℃，5% CO2。

1.3 細胞活性檢測 用不同濃度的Rh2（0、35、70和100 μmoL/L）處理U2OS和MG63骨肉瘤細胞24和48 h，隨后按照說明書使用MTT檢測試劑盒檢測骨肉瘤細胞活性的變化。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測相關蛋白的表達 用不同濃度的Rh2（0、35和70 μmoL/L）處理U2OS和MG63骨肉瘤細胞24 h后提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉液封閉2 h，隨后加入一抗（MMP2、MMP9、E-cadherin、Bcl-2、Bax、PARP、Cyclin D1、GSK-3β、β-catenin、C-myc；抗體比例1: 1 000）并在4 ℃搖床冰箱孵育過夜。次日使用相應的二抗（抗體比例1:3 000）室溫孵育2 h，隨后加入ECL顯影液并在化學發(fā)光顯像儀上曝光，收集圖像并定量分析。

1.5 骨肉瘤細胞的遷移和侵襲實驗 在細胞遷移實驗中將U2OS和MG63骨肉瘤細胞（5×104）接種在無血清培養(yǎng)基中的Transwell平板的上孔中，下孔添加600 μL培養(yǎng)基（含10% FBS）。U2OS和MG63骨肉瘤細胞在37 ℃含5% CO2的增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用含有Rh2（分別為0、35和70 μmoL/L）的新鮮培養(yǎng)基替換上孔中的培養(yǎng)基，并再培養(yǎng)24 h。隨后使用結(jié)晶紫溶液對遷移的細胞進行染色處理并收集圖像分析。在細胞侵襲實驗中用預冷的培養(yǎng)基將Matrigel試劑按1:10進行稀釋。隨后將50 μL Matrigel稀釋液加入Transwell平板的上孔中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，聚合成凝膠。隨后在培養(yǎng)孔中添加無血清培養(yǎng)基（每個培養(yǎng)孔50 μL）并在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)30 min。將剩余液體從培養(yǎng)孔中吸出，之后的程序與上述細胞遷移實驗相同。

1.6 骨肉瘤細胞的凋亡實驗 將U2OS和MG63細胞（3×105）接種在6孔細胞培養(yǎng)板中，并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，用Rh2（0、35和 70 μmoL/L）處理骨肉瘤細胞24 h。然后，按照CA1020-100T試劑說明（北京Solarbio科技有限公司），使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒收集細胞并通過流式細胞儀檢測骨肉瘤細胞的凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，每組實驗重復3次，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Rh2對骨肉瘤細胞活性的影響 用不同濃度的Rh2（0、35、70和100 μmoL/L）處理U2OS和MG63骨肉瘤細胞24和48 h后，細胞的活性顯著下降，并呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 Rh2對骨肉瘤細胞活性的影響

2.2 Rh2對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響 經(jīng)Rh2預處理后，骨肉瘤細胞的遷移與侵襲能力呈濃度依賴性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2AD。而在蛋白表達的水平上，Rh2可以顯著地降低MMP2和MMP9蛋白的表達，并同時增強E-cadherin蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2E、圖2F。Rh2通過調(diào)節(jié)MMP2、MMP9和E-cadherin蛋白的表達來抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲。

圖2 Rh2對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響

2.3 Rh2對骨肉瘤細胞凋亡的影響 Rh2可以呈劑量依賴性地促進骨肉瘤細胞的凋亡，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3A。Rh2增加了骨肉瘤細胞中Bax的表達，抑制了Bcl-2和PARP的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3B、圖3C。提示Rh2通過調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白的表達促進骨肉瘤細胞的凋亡反應。

圖3 Rh2對骨肉瘤細胞凋亡的影響

2.4 Rh2對骨肉瘤細胞中GSK-3β/Wnt雙信號通路的影響 Rh2可下調(diào)骨肉瘤細胞中β-catenin、Cyclin D1和C-myc蛋白的表達，同時上調(diào)GSK-3β蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。Rh2可能是通過調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞中GSK-3β/Wnt雙信號通路相關蛋白的表達起到抗腫瘤的作用。

圖4 Rh2對骨肉瘤細胞中GSK-3β/Wnt雙信號通路的影響

3 討論

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤之一，因為其具有高度的侵襲與易復發(fā)的特性，患者的預后通常都不理想。目前臨床上對于骨肉瘤患者的主要治療方法為手術聯(lián)合化療，但多數(shù)化療藥物在治療的同時也具有一定的不良反應，導致患者的治療效果不佳[6]。因此，研發(fā)一種對骨肉瘤治療敏感且不良反應較弱的新型高效化療藥物成為了迫切的需求。

多項研究表明Rh2具有抗侵襲、抗轉(zhuǎn)移、抗增殖等多種抗腫瘤作用[7]。此外，Rh2還可以減輕患者化療后的各種不良反應，如脫發(fā)、貧血和嘔吐等癥狀[8]。SONG等[9]研究表明Rh2在抑制人肝癌細胞系增殖方面具有良好的作用，且其抑制作用呈現(xiàn)時間-劑量依賴性。POPOVICH等[10]研究證明Rh2對結(jié)直腸癌細胞具有顯著的細胞毒性作用。LEE等[11]指出Rh2還在抑制乳腺癌細胞增殖方面具有較好的作用。以上研究結(jié)果證明Rh2作為一種新型抗腫瘤藥物可以在多種腫瘤細胞中起到良好的治療作用。

細胞凋亡也被稱為細胞的程序性死亡，分為內(nèi)源性及外源性凋亡途徑兩種主要方式[12]。細胞凋亡作用的缺失是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，而Rh2可以通過促進腫瘤細胞凋亡來達到抗腫瘤的作用[13]。 抗凋亡相關蛋白Bcl-2和凋亡相關蛋白Bax是調(diào)節(jié)細胞凋亡反應的主要蛋白之一，通過下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax蛋白在腫瘤細胞中的表達量可以促進其凋亡反應[14]。本研究發(fā)現(xiàn)Rh2可以促進骨肉瘤細胞中Bax蛋白的表達，并下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，進而起到抗腫瘤的作用。

研究表明GSK-3β/Wnt雙信號通路在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及細胞的凋亡等方面均有一定的調(diào)節(jié)作用，在多種腫瘤細胞中均可以發(fā)現(xiàn)GSK-3β/Wnt雙信號通路及其相關蛋白被大量激活[15]。因此，通過抑制GSK-3β/Wnt信號通路及其相關蛋白的表達即可起到抗腫瘤的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Rh2可以通過下調(diào)β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白的表達，上調(diào)GSK-3β蛋白的表達，進而起到抗腫瘤的作用。

本研究通過使用不同濃度的人參皂苷Rh2處理骨肉瘤細胞以探討其抗腫瘤的作用。MTT實驗結(jié)果表明，Rh2對MG63和U2OS骨肉瘤細胞的增殖有顯著的抑制作用，且其抑制作用呈時間及劑量依賴性。通過遷移和侵襲實驗可以證明Rh2能有效抑制骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移。通過FITC-Annexin V/PI雙染色法檢測骨肉瘤細胞的凋亡，結(jié)果表明Rh2可以促進骨肉瘤細胞的凋亡反應，進而起到抗腫瘤的作用。本研究還通過Western blot法證明Rh2可調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞中細胞周期相關蛋白、凋亡相關蛋白、轉(zhuǎn)移相關蛋白和GSK-3β/Wnt信號通路相關蛋白的表達來起到抗腫瘤的作用。