唐 宇，徐驥遠(yuǎn)，張 英，羅水忠，吳志華

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；4.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

堅(jiān)果是一類外殼堅(jiān)硬，內(nèi)部包含可食用果仁的食物，也是8大類過敏食物之一。堅(jiān)果富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等多種營養(yǎng)成分，能有效降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還能提高免疫力、促進(jìn)生長發(fā)育和延緩衰老等。隨著經(jīng)濟(jì)和生活水平的提高，堅(jiān)果類休閑食品日益受到歡迎，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國堅(jiān)果行業(yè)市場銷售規(guī)模從2014年的556億 元迅速增長到2020年的1 800億 元，進(jìn)口堅(jiān)果包括開心果、碧根果和巴西堅(jiān)果越來越受到消費(fèi)者青睞。因此，人們接觸到堅(jiān)果過敏原的機(jī)會(huì)也變得更多。

巴西堅(jiān)果（）又名巴西栗，也稱鮑魚果，營養(yǎng)豐富，是玉蕊科巴西栗屬的植物，主要生長在亞馬遜地區(qū)如巴西、秘魯、哥倫比亞和委內(nèi)瑞拉等。巴西堅(jiān)果過敏的癥狀包括喉嚨瘙癢、唇腫、呼吸困難、黃斑疹等。國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)已經(jīng)確認(rèn)了其中的2 種過敏原蛋白，Ber e 1和Ber e 2。

Ber e 1屬于2S白蛋白家族，占巴西堅(jiān)果總蛋白含量的30%左右，富含甲硫氨酸（占18%）和半胱氨酸（占8%）。含硫氨基酸是人類和動(dòng)物飲食中必不可少的，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。Ber e 1中-螺旋占比30%～47%，合成時(shí)分子質(zhì)量為18 kDa，翻譯加工后分子質(zhì)量降為12 kDa，由一個(gè)9 kDa的大亞基和3 kDa的小亞基通過二硫鍵連接組成，等電點(diǎn)為6.3，有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和耐消化性。Pastorello等收集了11 名巴西堅(jiān)果過敏患者血清，它們均能識(shí)別過敏原蛋白Ber e 1。Ber e 2是一種11S球蛋白，分子質(zhì)量為29 kDa。Beyer等收集了27 名巴西堅(jiān)果過敏患者血清，其中有56%的患者血清能識(shí)別該蛋白。

對(duì)Ber e 1的深入研究，首先需要將過敏原蛋白純化出來。有較多研究采用高效液相色譜法或兩步法分離過敏原蛋白Ber e 1。Dearman等先使用尺寸排阻法分離目的蛋白，后通過反相高效液相色譜法進(jìn)一步純化Ber e 1，該方法得到的蛋白純度較高，但操作步驟繁瑣，對(duì)儀器要求也比較高。Moreno等利用凝膠過濾色譜和色譜聚焦梯度串聯(lián)法等純化獲得天然Ber e 1，但該方法操作較為復(fù)雜且耗時(shí)長。此外，這些方法僅能獲得較少量的目的蛋白。巴西堅(jiān)果過敏原蛋白純化量少，限制了對(duì)巴西堅(jiān)果過敏的研究。因此，探索建立簡單經(jīng)濟(jì)高效的Ber e 1純化方法，有望推動(dòng)其研究的深入。

花生過敏原蛋白Ara h 2和Ber e 1同屬于2S白蛋白家族，用陰離子交換層析法能夠分離純化獲得高純度的Ara h 2。陰離子交換層析法需要的設(shè)備簡單，操作較為方便，耗時(shí)較短，是一種經(jīng)濟(jì)高效的分離蛋白純化方法，用該方法分離純化Ber e 1，有望獲得較好的結(jié)果。

本研究將巴西堅(jiān)果粉碎脫脂提取粗蛋白后，采用陰離子層析法純化巴西堅(jiān)果過敏原蛋白Ber e 1，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）聯(lián)用和免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）對(duì)其進(jìn)行鑒定，通過圓二色譜和紫外分光光度計(jì)表征其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴西堅(jiān)果仁 微拉美（寧夏）進(jìn)出口有限公司；巴西堅(jiān)果過敏患者血清 重慶曼紐艾克科技有限公司；明膠美國Sigma公司；生物素化羊抗人IgE二抗 美國Bio-Rad公司；HRP酶標(biāo)親和素 深圳欣博盛生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FDV型超細(xì)粉碎機(jī) 中國臺(tái)灣佑崎有限公司；5804 R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；蛋白質(zhì)分離純化系統(tǒng)（包括HL-1恒流泵、HD-1核酸蛋白檢測儀、HD-A電腦采集器、TH-500 A梯度混合器、SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器） 上海青浦滬西儀器廠；DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析樹脂 美國通用電氣公司；Power PacBasic電泳儀、EPS 601蛋白轉(zhuǎn)印儀、GS-800型光密度掃描儀美國Bio-Rad公司；Easy-nLC 1200色譜系統(tǒng)、Q Exacitve HF-X質(zhì)譜儀、Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；MOS-450/AF-CD圓二色光譜儀法國Biologic公司；UV WinLab紫外分光光度計(jì) 美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 研磨脫脂

用超細(xì)粉碎機(jī)加液氮磨碎巴西堅(jiān)果仁，并與石油醚溶液按1∶10（g/mL）混合。磁力攪拌脫脂4 h后，用真空抽濾裝置進(jìn)行固液分離，棄去液體，沉淀反復(fù)脫脂2 次。通風(fēng)櫥自然風(fēng)干后得巴西堅(jiān)果脫脂粉。

1.3.2 巴西堅(jiān)果過敏原蛋白浸提

參考Pastorello等的方法并略加修改。將巴西堅(jiān)果脫脂粉與0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）按1∶10（g/mL）混合，設(shè)置3 個(gè)平行樣品。4 ℃磁力攪拌4 h后，6 000 r/min、4 ℃離心30 min，收集上清液。重復(fù)浸提沉淀2 次，-20 ℃冷藏備用。

1.3.3 Ber e 1蛋白分離純化

采用陰離子交換層析樹脂對(duì)過敏原蛋白Ber e 1進(jìn)行分離純化，先使用0.01 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗柱子至基線平，后加入巴西堅(jiān)果蛋白，繼續(xù)洗脫出現(xiàn)穿過峰至基線平后，用洗脫液（含0～0.5 mol/L氯化鈉的平衡緩沖液）進(jìn)行梯度洗脫，流速2 mL/min。使用紫外分光光度計(jì)在280 nm波長處檢測蛋白質(zhì)，收集各洗脫峰組分。

1.3.4 SDS-PAGE測定

1.3.4.1 粗提蛋白純度測定

采用SDS-PAGE對(duì)蛋白進(jìn)行純度鑒定。將提取的蛋白稀釋至2 mg/mL，與5×非還原上樣緩沖液按體積比4∶1混合，100 ℃加熱5 min。使用4%濃縮膠和12%分離膠，在恒流6 mA、30 min和恒流12 mA、90 min條件下進(jìn)行濃縮和分離。電泳結(jié)束后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色20 min，脫色12 h，對(duì)電泳凝膠進(jìn)行圖像采集，并利用Quantity one-4.6.2軟件進(jìn)行灰度掃描分析蛋白純度。

1.3.4.2 純化蛋白測定將純化的蛋白

進(jìn)行SDS-PAGE分析、考馬斯亮藍(lán)染色，切下目的蛋白條帶，將膠條脫色后用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解，收集酶解液后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.3.5 LC-MS/MS鑒定

色譜條件：EASY-Column毛細(xì)管色譜柱（75 μm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液（/），B為0.1%甲酸、80%乙腈、20%水混合溶液（/）；色譜柱以100%的A液平衡；梯度洗脫程序：0～2 min，97%～95% A、3%～5% B；2～42 min，95%～75% A、5%～25% B；42～52 min，75%～55% A、25%～45% B；52～55 min，55%～10% A、45%～90% B；55～70 min，10% A、90% B；柱溫50 ℃；進(jìn)樣量0.5 μg；流速300 nL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離；分析時(shí)長70 min；正離子模式；離子源溫度250 ℃；電壓2.1 kV；母離子掃描范圍：/300～1 800；二級(jí)質(zhì)譜采集：每次全掃描后觸發(fā)采集20 個(gè)最高強(qiáng)度母離子的二級(jí)質(zhì)譜圖譜。

使用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索軟件MaxQuant 1.6.1.0進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索及鑒定。

1.3.6 血清學(xué)鑒定

采用Western blot，參考閔芳芳和陳鵬等的方法并部分修改。純化的Ber e 1蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，通過轉(zhuǎn)膜儀在100 V、400 mA條件下電轉(zhuǎn)50 min，使其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%明膠的TBST室溫封阻1 h；加入1∶50（/）稀釋的巴西堅(jiān)果過敏患者的血清，4 ℃過夜孵育；TBST洗膜后加入1∶5 000（/）稀釋的生物素化羊抗人二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜后加入1∶60（/）稀釋的HRP酶標(biāo)親和素，室溫孵育1 h；洗膜后加ECL顯色液顯色成像。所有孵育過程均在滾軸上進(jìn)行。

1.3.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)的表征

參考Wu Zhihua等的方法，在氮?dú)獯祾叩臈l件下，用圓二光譜儀檢測純化的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。測定條件：掃描波長范圍190～240 nm；平均掃描速率60 nm/min；光譜寬帶1 nm。比色皿光徑1 mm；蛋白樣品質(zhì)量濃度0.1 mg/mL。通過圓二色譜在線分析軟件（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析轉(zhuǎn)換，得到樣品的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)各成分單元的含量。

1.3.8 三級(jí)結(jié)構(gòu)的初步表征

參照Zhang Ying等的方法，用紫外分光光度計(jì)檢測純化蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。測定條件：掃描波長范圍250～360 nm；比色皿光徑1 cm；設(shè)置掃描速率100 nm/min；光譜寬帶2.0 nm；響應(yīng)時(shí)間0.2 s；波長間隔1.0 nm。蛋白樣品質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，體積為1 mL。

1.3.9 蛋白定量及得率計(jì)算

參照李娟等的方法并進(jìn)行部分修改，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)量濃度，以牛血清白蛋白作質(zhì)量濃度工作曲線，通過不同波長光吸收確定蛋白樣品質(zhì)量濃度。Ber e 1得率計(jì)算如下：

式中：純化Ber e 1蛋白質(zhì)量由測得蛋白質(zhì)量濃度及對(duì)應(yīng)體積所得；上樣總蛋白中Ber e 1質(zhì)量以Ber e 1約占其總蛋白含量的30%為依據(jù)計(jì)算所得。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 25.0軟件對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，并進(jìn)行單因素方差分析，使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西堅(jiān)果粗提蛋白SDS-PAGE分析

圖1 巴西堅(jiān)果粗提蛋白SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profile of crude protein extracted from Brazil nuts

結(jié)果表明3 個(gè)平行中，第1次提取的粗蛋白質(zhì)量濃度為（43.4±1.7）mg/mL，第2次提取的粗蛋白質(zhì)量濃度為（11.2±1.2）mg/mL，而第3次提取的粗蛋白質(zhì)量濃度僅為（1.9±0.1）mg/mL。說明巴西堅(jiān)果脫脂粉經(jīng)兩次浸提后，剩余可溶蛋白已經(jīng)很少。由圖1可知，3 個(gè)平行間及每個(gè)平行的3 次提取間，獲得的蛋白沒有明顯的組分差別；但隨著提取次數(shù)的增多，粗提蛋白質(zhì)量濃度顯著下降，目的蛋白Ber e 1的含量也有所降低。由于第3次提取液中蛋白質(zhì)量濃度不到第1次提取液的5%，所以只取前兩次提取液混合進(jìn)行Ber e 1的分離純化，灰度掃描顯示，混合液中目的蛋白Ber e 1含量約占總蛋白的30%，與文獻(xiàn)報(bào)道的巴西堅(jiān)果中過敏原蛋白Ber e 1的含量一致。

2.2 離子交換層析分離純化巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1分析

圖2 純化巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1的陰離子交換層析曲線（a）及SDS-PAGE（b）圖Fig. 2 Anion-exchange chromatographic curve (a) and SDS-PAGE profile (b) of Brazil nut allergen Ber e 1

如圖2所示，峰1（即穿過峰）中含大量高純度的過敏原蛋白Ber e 1，Ber e 1的等電點(diǎn)為pH 6.3，在所選平衡緩沖液的pH值下帶負(fù)電荷，可以被陰離子交換樹脂吸附，但可能由于目的蛋白Ber e 1和陰離子交換樹脂的結(jié)合能力較弱，可直接被不含NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫下來，也有部分蛋白結(jié)合在柱上，在梯度洗脫過程中被高鹽溶液洗脫下來。峰1處收集到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE及灰度掃描，顯示Ber e 1純度大于95%。

2.3 巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1的LC-MS/MS鑒定分析

由表1可知，共檢測到4 條Ber e 1的特征肽段，除信號(hào)肽外檢測出的肽段覆蓋率為36.5%，質(zhì)譜結(jié)果認(rèn)定該蛋白為巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1。

表1 巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1檢測肽段Table 1 Identification of peptides in Brazil nut allergen Ber e 1 by LC-MS/MS

2.4 巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1的血清識(shí)別分析

圖3 巴西堅(jiān)果蛋白粗提物及純化過敏原Ber e 1的Western blot分析Fig. 3 Western blot analysis of crude protein extracted from Brazil nuts and purified allergen Ber e 1

如圖3所示，粗蛋白泳道和純化的目標(biāo)蛋白泳道均有顯色，且Ber e 1對(duì)2 位過敏患者的血清都有較強(qiáng)的反應(yīng)，進(jìn)一步說明本實(shí)驗(yàn)分離得到了巴西堅(jiān)果過敏原，且蛋白Ber e 1免疫活性保持良好。此外，在粗蛋白泳道的29 kDa處（即Ber e 2）和30～100 kDa之間的蛋白條帶也有顯色，其中第1位堅(jiān)果過敏患者的血清（圖3b）對(duì)30～100 kDa之間的多個(gè)蛋白條帶識(shí)別更強(qiáng)，顯色更深。這說明除已知兩種過敏原蛋白Ber e 1、Ber e 2外，巴西堅(jiān)果中可能還存在其他種類的未知過敏原蛋白。

2.5 巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1二級(jí)結(jié)構(gòu)的表征

圓二色光譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)具有肽鍵吸收信號(hào)，并能反應(yīng)蛋白質(zhì)特征二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。從圖4可以看出，過敏原蛋白Ber e 1在193 nm波長處有最大吸收峰，在208 nm（-螺旋肽鍵的π-π*躍遷）和222 nm（-螺旋肽鍵的n-π*躍遷）波長處有2 個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶，表明Ber e 1中明顯存在-螺旋結(jié)構(gòu)。通過圓二色譜在線軟件分析，結(jié)果顯示巴西堅(jiān)果過敏原蛋白Ber e 1中-螺旋含量占30.6%，在文獻(xiàn)報(bào)道的-螺旋占比范圍內(nèi)，-折疊含量占19.0%，-轉(zhuǎn)角含量占22.9%，無規(guī)卷曲含量占27.6%。

圖4 巴西堅(jiān)果過敏原蛋白Ber e 1的圓二色光譜（a）和二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組分圖（b）Fig. 4 CD spectrum (a) and secondary structure composition of Brazil nut allergen Ber e 1 (b)

2.6 巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1三級(jí)結(jié)構(gòu)的初步表征

蛋白質(zhì)在近紫外處的吸收主要與酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸和二硫鍵有關(guān)。由圖5可知，在250～280 nm波長附近有較大吸收。由于芳香氨酸殘基的側(cè)鏈的譜峰常因微區(qū)特征的不同而改變，芳香族氨基酸殘基的側(cè)鏈之間及其與二硫鍵的譜峰均可能會(huì)產(chǎn)生重疊。已有研究表明Ber e 1的兩個(gè)亞基是通過4 個(gè)二硫鍵連接起來的，這可能對(duì)250～280 nm波長之間的吸收峰有影響，所以在275 nm及282 nm波長處沒有明顯的酪氨酸特征吸收峰，這在一定程度上說明了所純化的過敏原蛋白Ber e 1的二硫鍵未被破壞，其高級(jí)結(jié)構(gòu)未展開。此外，因Ber e 1的蛋白序列中不含色氨酸，所以在290～310 nm之間沒有色氨酸的特征峰。當(dāng)前鮮見表征過敏原蛋白Ber e 1三級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道，因此本研究為過敏原蛋白Ber e 1的后續(xù)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

圖5 巴西堅(jiān)果過敏原蛋白Ber e 1的紫外光譜圖Fig. 5 UV spectrum of Brazil nut allergen Ber e 1

2.7 巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1的得率分析

如表2所示，在一次典型的純化過程中，上樣體積為6 mL，總蛋白質(zhì)量濃度為26.0 mg/mL，獲得純化的Ber e 1約22.4 mg，計(jì)算可知，Ber e 1得率為47.8%，則1 g巴西堅(jiān)果脫脂粉可以得到約74.6 mg目的蛋白Ber e 1。

表2 陰離子交換層析法分離得到的巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1的得率Table 2 Recovery of Ber e 1 during anion-exchange chromatographic purification

3 結(jié) 論

以巴西堅(jiān)果仁為原料，通過粉碎、脫脂、浸提獲得粗蛋白，采用陰離子交換層析法分離純化Ber e 1蛋白，通過LC-MS/MS對(duì)純化的蛋白進(jìn)行鑒定。一步分離純化即可得到純度95%以上的巴西堅(jiān)果過敏原蛋白Ber e 1，純化過程中，蛋白得率為47.8%，一次純化量可超過20 mg。經(jīng)Western blot、圓二光譜儀及紫外分光光度計(jì)測定分析表明，純化的蛋白保持自身高級(jí)結(jié)構(gòu)，能夠被巴西堅(jiān)果過敏患者的血清準(zhǔn)確識(shí)別。當(dāng)前我國對(duì)巴西堅(jiān)果過敏原的研究較少，本研究純化Ber e 1的技術(shù)路線簡單，對(duì)設(shè)備要求低，耗時(shí)短且制備量大，可以為巴西堅(jiān)果過敏原Ber e 1相關(guān)研究和應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。