譚利濤，成 勝，蘇 杭，孫正祥，2*，周 燚，2*

（1.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控工程技術(shù)研究中心，湖北 荊州 434025）

【研究意義】真菌內(nèi)生細(xì)菌（endohyphal bacteria，EHB），是一類生活在真菌菌絲或孢子內(nèi)的細(xì)菌，最早于1970年在叢枝菌根中被發(fā)現(xiàn)[1]，并于1996年被證實(shí)真菌體內(nèi)存在活的細(xì)菌[2]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化演變過程中，細(xì)菌可以通過某種方式進(jìn)入到真菌體內(nèi)并與宿主真菌形成共生體，與宿主共同應(yīng)答外界環(huán)境信號(hào)，以此來提高寄主真菌的生存適應(yīng)能力[3-5]。這對(duì)研究微生物多樣性以及開發(fā)新型生防資源具有重要啟示?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】EHB 存在于多種真菌中，但EHB 在不同種類真菌體內(nèi)的豐度上有差異，在同一科屬的真菌中其種類和數(shù)量也各不相同[4-7]。EHB 能影響宿主真菌的生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)孢，具體表現(xiàn)在影響真菌孢子的形成與萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物、環(huán)境信號(hào)應(yīng)答及生態(tài)位等方面[6,8-10]。其中最具代表性的是《Nature》報(bào)道了引起水稻致病的小孢根霉（Rhizopus microsporus），其主要毒素——根霉菌素，不是由真菌自身產(chǎn)生的而是由其內(nèi)生細(xì)菌伯克霍爾德氏菌（Paraburkholderia rhizoxinica）產(chǎn)生的[11]；當(dāng)小孢根霉的內(nèi)生細(xì)菌被脫除后，小孢根霉無致病性且無法正常產(chǎn)孢[12]，并且在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，根霉菌素的合成也離不開宿主真菌的調(diào)控，因?yàn)楦咕氐那绑w物質(zhì)2，3-環(huán)氧乙烷環(huán)的合成酶類是由宿主小孢根霉提供的[13]。一系列的發(fā)現(xiàn)對(duì)研究細(xì)菌在調(diào)節(jié)其宿主真菌的基礎(chǔ)生物學(xué)中的作用具有里程碑的意義，但是細(xì)菌是如何發(fā)揮作用的還不清楚，目前仍有許多問題亟待解決?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物源內(nèi)生菌種類數(shù)目繁多，分布范圍廣，是開發(fā)新生物農(nóng)藥的寶貴資源庫(kù)，而有些EHB 能夠與植物內(nèi)生真菌形成共生關(guān)系影響宿主的功能，從植物內(nèi)生真菌中分離出EHB對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有巨大應(yīng)用價(jià)值?！緮M解決的關(guān)鍵問題】課題組前期從盤龍參植株中共分離得到內(nèi)生菌263 株，其中根系內(nèi)生真菌共41 株[14]。筆者對(duì)41 株真菌總DNA進(jìn)行16S rDNA 引物序列擴(kuò)增及細(xì)菌高通量測(cè)序，篩選到了菌絲內(nèi)含有多種內(nèi)生細(xì)菌的莖點(diǎn)霉屬真菌YZU172013。本文將以YZU172013為材料，分離鑒定其菌絲內(nèi)生細(xì)菌，為后續(xù)挖掘YZU172013體內(nèi)細(xì)菌的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株及其它材料 盤龍參內(nèi)生真菌YZU172013（Phomasp.）由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物與微生物互作研究室保存；蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579（Bacillus cereus）受贈(zèng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物殺蟲實(shí)驗(yàn)室；新鮮桑葉采自于長(zhǎng)江大學(xué)太湖農(nóng)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地；各蟲齡家蠶購(gòu)自于市場(chǎng)。

1.1.2 供試試劑 生化試劑基因組DNA 快速抽提試劑盒（細(xì)菌）購(gòu)自于OMEGA 公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自于擎科生物科技有限公司；STYO-9 Green-Fluorescent Nucleic Acid Stains 購(gòu)自于Thermo Fisher 公司；6×Loading Buffer、DNA Marker-D等均購(gòu)自于華大基因科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 盤龍參內(nèi)生真菌YZU172013 內(nèi)生細(xì)菌的檢測(cè) （1）內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA 的檢測(cè)。根據(jù)CTAB 法提取盤龍參內(nèi)生真菌YZU172013 的DNA，然后基于細(xì)菌的16S rDNA 序列設(shè)計(jì)特異引物（ER10：5'-GGCG GACGGGTGAGTAA-3'；ER11：5'-ACTGCTGCCTCCCGTAG-3')[15]，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證，同時(shí)送至華大基因科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系和程序見表1。

表1 擴(kuò)增16S rDNA及AHL基因的PCR程序Tab.1 PCR Procedure for amplifying 16S rDNA and AHL gene

（2）內(nèi)生細(xì)菌DNA 的SYTO-9 染色。參考STYO-9 Green-Fluorescent Nucleic Acid Stains 說明書，將真菌YZU172013培養(yǎng)至產(chǎn)孢，用無菌水洗滌并收集孢子，然后將適量的孢子接入PDB 培養(yǎng)液，28 ℃震蕩培養(yǎng)48 h，之后收集由孢子萌發(fā)形成的菌絲球，用8.5 g/L NaCl漂洗3次，加入100μL的8.5 g/L NaCl輕輕地懸浮菌體，再加入100μL 10μmol/L SYTO-9 綠色熒光核酸染色劑，混勻后在黑暗中孵育15～30 min，之后樣品用ECLIPSE NiU顯微鏡（尼康，日本）進(jìn)行熒光染色檢測(cè)。

1.2.2 內(nèi)生真菌YZU172013內(nèi)生細(xì)菌的分離 參照Obasa 等[15]的方法，將真菌接種于PDB 中，在28 ℃下180 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h。收集菌絲體，菌絲體先用無菌水漂洗2 次，再用體積分?jǐn)?shù)75%酒精表面消毒2 min，并用無菌水清洗5 次，取100μL 第5 次沖洗液涂布于LA 培養(yǎng)基上，并在30 ℃下培養(yǎng)過夜，以確定沒有細(xì)菌污染；用0.5 mL無菌水將表面消毒的菌絲體重懸并使用無菌研缽研磨，隨后將100μL的研磨混合物轉(zhuǎn)接到5 mL LB 培養(yǎng)基中（含100μg/mL 的潮霉素），在28 ℃下150 r/min 富集培養(yǎng)4 h；隨后涂布于LA培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)并觀察細(xì)菌菌落，挑取單菌落純化細(xì)菌得到單一菌株。

1.2.3 菌株7-1Y 的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定。采用平板稀釋涂布法得到內(nèi)生細(xì)菌在LA 平板上的單菌落，之后根據(jù)細(xì)菌單菌落的形態(tài)特征（顏色、大小、邊緣等）初步鑒定；采用革蘭氏染色來進(jìn)一步判斷細(xì)菌屬性；采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察菌體的微觀形態(tài)[16]。（2）分子生物學(xué)鑒定。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取細(xì)菌DNA，利用細(xì)菌的16S rDNA 通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR 反應(yīng)程序擴(kuò)增（表1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。經(jīng)16S rDNA 測(cè)序初步判斷菌株7-1Y 為蠟樣芽孢桿菌后，再?gòu)腘CBI 網(wǎng)站下載蠟樣芽孢桿菌類群的特異基因序列——高絲氨酸環(huán)內(nèi)酯酶基因（homoser-ine lactonese gene，AHLgene），基于primer 6 設(shè)計(jì)特異引物（AHL94：5'-ACTATCAGTTAAACGAAG-3'；AHL625：5'-AGGTATGCCAGAAAGTGC-3'），按相關(guān)程序擴(kuò)增目的片段（表1），測(cè)序后用MEGA軟件（版本7.0）基于鄰接法（neighbour-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

1.2.4 菌株7-1Y 的內(nèi)生驗(yàn)證 利用細(xì)菌的16S rDNA 的特異引物ER10/ER11 及特異引物AHL94/AHL625（表1），同時(shí)進(jìn)行宿主真菌及內(nèi)生細(xì)菌DNA的PCR擴(kuò)增，檢測(cè)目的條帶，同時(shí)PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 菌株7-1Y 的功能探索 （1）生理生化特征。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，在LA 培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，分別加入10 g/L 羧甲基纖維素鈉、5 g/L 可溶性淀粉及15 g/L 脫脂奶粉，依次制成纖維素降解培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基和蛋白降解培養(yǎng)基，然后用牛津杯制平板，接種7-1Y菌懸液，對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定，除此之外還包括甘露醇產(chǎn)酸和抗藥性等數(shù)項(xiàng)生理生化反應(yīng)的測(cè)定[17]。（2）殺蟲活性測(cè)定。采用注射法及喂飼法初步探究?jī)?nèi)生細(xì)菌7-1Y的殺蟲活性[18]，家蠶在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用新鮮桑葉人工繁殖一代后備用；7-1Y培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后離心收集菌體，用無菌水漂洗3次，之后用8 g/L NaCl溶液配置成1×107CFU/mL的菌懸液，備用。喂飼實(shí)驗(yàn)中，將生長(zhǎng)一致的新鮮桑葉浸泡在菌懸液中30 s，陰干后喂飼給家蠶，每12 h觀察家蠶情況，統(tǒng)計(jì)死亡率，對(duì)照為8 g/L NaCl 溶液；注射試驗(yàn)中，從5 齡家蠶的節(jié)間膜部位注射1μL 的菌懸液至血淋巴中，每12 h觀察家蠶情況，統(tǒng)計(jì)死亡率，對(duì)照為8 g/L NaCl溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌YZU172013內(nèi)生細(xì)菌的檢測(cè)

2.1.1 菌絲內(nèi)16S rDNA 的檢測(cè) 由圖1 可知，真 菌YZU172013 的DNA 經(jīng) 過PCR 擴(kuò) 增后，能擴(kuò)到單一且明亮的條帶，與目的條帶大小基本一致（220 bp），初步說明真菌YZU172013 里面可能含有內(nèi)生細(xì)菌；另外，PCR 產(chǎn)物的測(cè)序序列在NCBI 官網(wǎng)上進(jìn)行Blast 比對(duì)后，與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的匹配度達(dá)95.22%。

圖1 基于ER10/ER11引物對(duì)172013中內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的檢測(cè)Fig.1 Existent detection of 16S rDNA of EHB in 172013 with ER Primers

2.1.2 菌絲SYTO-9 染色 SYTO-9 染色劑是一種綠色熒光活體染色劑，在結(jié)合細(xì)胞內(nèi)核酸時(shí)可以顯示出強(qiáng)烈的熒光，用于染色真核細(xì)胞以及G+/G-細(xì)菌中的RNA 和DNA。經(jīng)SYTO-9染色劑染色后，能顯著觀察到內(nèi)生真菌YZU172013 菌絲內(nèi)的細(xì)胞核被染色（圖2），同時(shí)也觀察到了菌絲內(nèi)還存在多個(gè)形似細(xì)菌DNA 的小點(diǎn)，與Hoffman 等[4]報(bào)道的結(jié)果一致，進(jìn)一步證明菌絲內(nèi)含有內(nèi)生細(xì)菌。

圖2 172013基于SYTO-9綠色熒光核酸染色劑的染色Fig.2 Stains of 172013 with SYTO-9 green-fluorescent nucleic acid stains

2.2 菌株7-1Y的分離與鑒定

2.2.1 分離與形態(tài)鑒定 真菌菌絲通過漂洗磨碎后得到研磨物，研磨物經(jīng)富集一段時(shí)間后進(jìn)行稀釋涂布，3 d 后觀察到形態(tài)相似的菌落，產(chǎn)生特殊的氣味，挑取單菌落至LB 培養(yǎng)基，命名為7-1Y。菌落近圓形，大而平坦，表面光滑，不透明，邊緣不規(guī)則呈波浪狀，不產(chǎn)色素，前期淺白色，后期變?yōu)槿榘咨?，菌落特征與蠟樣芽孢桿菌模式菌株ATCC 14579 相似（圖3）。革蘭氏染色呈紫色，桿狀；在掃描電鏡觀察下，菌體兩端平齊呈短桿狀，與Bacillus cereusU1s 5 相似[19]，菌體大小為（1～1.5）μm×（0.3～0.5）μm，比普通蠟樣芽孢桿菌小。

圖3 7-1Y在不同條件下的形態(tài)特征Fig.3 Morphology characters of 7-1Y under various conditions

2.2.2 分子鑒定 由16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）顯示，菌株7-1Y 與模式菌株Bacilus cereusATCC 14579（NR_114582.1）同源性最高，支持率達(dá)100%；而基于AHL基因序列的構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）表明，與Bacillus cereusSGAir0260（CP028009.1）的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)95%。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定將菌株7-1Y鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖4 7-1Y基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 7-1Y with 16S rDNA sequences

圖5 7-1Y基于AHL基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 7-1Y with AHL gene sequences

2.3 細(xì)菌7-1Y的內(nèi)生性驗(yàn)證

真菌YZU172013 和細(xì)菌7-1Y 用ER10/ER11 引物、AHL基因特異性引物擴(kuò)增，結(jié)果表明兩菌株均能擴(kuò)出目的條帶（圖6），大小與預(yù)期一致，測(cè)序后結(jié)果準(zhǔn)確可靠，證實(shí)了本文從真菌YZU172013菌絲內(nèi)分離到細(xì)菌7-1Y。

圖6 7-1Y基于兩對(duì)引物的內(nèi)生驗(yàn)證Fig.6 Endogenous detection of 7-1Y based on two pairs of primers

2.4 菌株7-1Y的功能探索

2.4.1 生理生化特征 如表2 及圖7 所示，菌株7-1Y 能在淀粉及纖維素培養(yǎng)基上可產(chǎn)生透明圈而在蛋白培養(yǎng)基及幾丁質(zhì)檢測(cè)培養(yǎng)基，說明可產(chǎn)生淀粉水解酶、纖維素酶，但不產(chǎn)生胞外蛋白酶及幾丁質(zhì)酶；同時(shí)該菌有解磷能力，不能發(fā)生硝酸鹽還原反應(yīng)及甘露醇降解反應(yīng)，無解鉀能力；另外其對(duì)紅霉素、氯霉素及慶大霉素均抗性不高，但對(duì)氨芐青霉素的抗性較高，在前3 個(gè)藥劑的單獨(dú)使用下（藥劑質(zhì)量濃度分別為30，30，50μg/mL），7-1Y 幾乎不能生長(zhǎng)，而當(dāng)氨芐青霉素使用濃度為100μg/mL 時(shí)，7-1Y 長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)未受到抑制。

圖7 7-1Y的生理生化特征Fig.7 Physiological and biochemical characteristics of 7-1Y solubilization

表2 7-1Y的各項(xiàng)生理生化測(cè)定Tab.2 Physiological and biochemical determination of 7-1Y

2.4.2 菌株7-1Y殺蟲活性的檢測(cè) 在喂飼試驗(yàn)中，在喂食過帶有菌懸液的桑葉后，處理組家蠶較對(duì)照組家蠶活力稍微下降，糞便稀軟，其它生長(zhǎng)狀況基本一致，72 h 及之后未出現(xiàn)致死情況，說明內(nèi)生細(xì)菌7-1Y沒有喂飼致死活性。而由圖8可知，與8 g/L NaCl溶液對(duì)照相比，家蠶在接種菌懸液12 h之后，未死亡家蠶幼蟲活性顯著下降，進(jìn)食量減少，而死蟲則胸部及傷口發(fā)黑，癥狀嚴(yán)重的全身變黑，且死蟲數(shù)占總蟲數(shù)的2/3；在接種菌懸液24 h 之后，處理組家蠶全部死亡，全身變黑發(fā)軟，與董歆報(bào)道結(jié)果相似[18]，表明7-1Y具有一定的注射殺蟲活性。

圖8 7-1Y的注射殺蟲活性Fig.8 Insecticidal activity of 7-1Y by injection

3 討論與結(jié)論

蘭科植物種類繁多，分布廣泛，具有很高的藥用和觀賞價(jià)值[20]，但蘭科植物在自然界中很難獨(dú)立存活，其生長(zhǎng)發(fā)育與其菌根真菌密切相關(guān)[20-21]。蘭科菌根真菌能協(xié)助萌發(fā)[22]，抵御病原真菌及害蟲的侵染[23]，并協(xié)助宿主植物應(yīng)對(duì)干旱及重金屬污染等逆境脅迫[24-25]，具有多樣的生態(tài)功能及很強(qiáng)的生防潛力[14]。而真菌內(nèi)生細(xì)菌（endohyphal bacteria，EHB）在真菌體內(nèi)，能夠協(xié)助宿主真菌生存[11,13,26]，在真菌體外，即自由狀態(tài)下，也能表現(xiàn)一定的生物學(xué)功能[27-28]，說明EHB 同樣也是潛在的生物資源，值得進(jìn)一步探索開發(fā)。

真菌內(nèi)生芽孢桿菌的報(bào)道并不少見[8,29]，但蠟樣芽孢桿菌類群中僅有蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）、炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）及蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides）[30]被報(bào)道為EHB。本文從盤龍參菌根真菌成功分離到一株內(nèi)生細(xì)菌，并將該菌為鑒定蠟樣芽孢桿菌(B.cereus），首次報(bào)道了真菌內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌，豐富了EHB的多樣性。蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于自然界，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)[31]，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性[32]，進(jìn)行生物降解[33]，抵御病蟲害[34]等。本文初步探究了7-1Y的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)7-1Y具有水解淀粉及纖維素、解磷、硝酸鹽還原等功能，具有很好的生防潛能和應(yīng)用前景。另外本文還探索了7-1Y的殺蟲活性，發(fā)現(xiàn)7-1Y不能通過喂飼方式直接殺蟲，可能是由于7-1Y的代謝物在中腸沒有作用靶標(biāo)，不能造成中腸穿孔，菌體及其它代謝物無法進(jìn)入到體液中發(fā)揮殺蟲作用，但有可能作用于腸道微生物菌群，影響腸道代謝，引起家蠶代謝紊亂；而將7-1Y 注射至家蠶血淋巴中，短時(shí)間內(nèi)能導(dǎo)致家蠶食欲減退，活力下降，能引起昆蟲免疫應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致血細(xì)胞破裂從而引起昆蟲死亡且蟲體發(fā)黑變軟，說明7-1Y具有注射殺蟲活性，有望應(yīng)用于害蟲防治。

雖然本文已經(jīng)分離到了一株YZU172013 體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌，但仍有許多問題未解決。例如，作為盤龍參菌根真菌YZU172013 內(nèi)生蠟樣芽孢桿菌，7-1Y 是否影響真菌的生物學(xué)功能，影響YZU172013 與宿主植物之間的共生聯(lián)系等。此外，不同真菌所含內(nèi)生細(xì)菌的種類及數(shù)量各不相同，這可能是由于微量元素等營(yíng)養(yǎng)因子及物理屏障引起的自我保護(hù)機(jī)制[4]，也有人提出是由真菌自身通過產(chǎn)生活性成分如抗生素或活性氧等免疫防御而導(dǎo)致的[35]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，內(nèi)生細(xì)菌與宿主真菌相互適應(yīng)有一定的共生雙向選擇性，真菌是如何容納細(xì)菌而細(xì)菌又是怎樣進(jìn)入真菌的具體機(jī)制尚不清楚，有待深入研究[36]。筆者將探索內(nèi)生細(xì)菌7-1Y 其在宿主真菌YZU172013 體內(nèi)的分布狀況與定殖機(jī)制，并研究7-1Y的代謝產(chǎn)物活性，為解析內(nèi)生細(xì)菌7-1Y 與宿主真菌YZU172013 的共生關(guān)系做鋪墊，為研究?jī)烧咴诠δ苌系穆?lián)系打下基礎(chǔ)。