楊文淵,謝紅江,陶 煉,宦云敏,陳善波,林立金,廖明安

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,成都 611130;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,成都 610066;3.農(nóng)業(yè)部西南區(qū)域園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,成都 610066;4.四川省林業(yè)科學(xué)研究院,成都 610081)

蘋果(Malus domesticaBorkh.)是中國主要水果之一,因其營養(yǎng)豐富和良好的口感,深受廣大消費者喜愛。蘋果果實糖的種類、含量及比例影響果實風(fēng)味和營養(yǎng)成分,是決定果實品質(zhì)和商品價值的重要因素[1-4]。研究發(fā)現(xiàn),蘋果中可溶性糖主要含果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇,通常果糖含量最高,占40%以上[5-8],而‘金冠’蘋果的果糖含量更高,占60%以上[9]。果實中的糖積累、種類與糖代謝酶的活性變化密切相關(guān)[10-12],起主要調(diào)控作用的有蔗糖合成酶(SS)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)、中性轉(zhuǎn)化酶(NI)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、山梨醇脫氫酶(SDH)[13-15]。作為蘋果碳水化合物主要運輸形式的山梨醇,經(jīng)韌皮部卸載,在果實中被山梨醇脫氫酶(SDH)和山梨醇氧化酶(SOX)迅速轉(zhuǎn)化成果糖和葡萄糖,參與果實的生長發(fā)育和品質(zhì)形成[2,16-17]。而蔗糖是蘋果果實中糖卸載的另一種重要形式,并在品質(zhì)形成有關(guān)的代謝中起著重要作用[1,2,16]。但對西南冷涼高原蘋果果實生長發(fā)育期間糖積累及代謝相關(guān)酶活性的變化規(guī)律,尤其與代謝有關(guān)酶的關(guān)系尚缺乏研究。

多年田間觀測發(fā)現(xiàn),西南冷涼高原產(chǎn)區(qū)‘金冠’蘋果變異優(yōu)系(SGP-1)果實口感純甜,風(fēng)味極佳,為進(jìn)一步探討‘SGP-1’果實糖代謝機(jī)理,以‘金冠’蘋果及其優(yōu)系(SGP-1)為材料,通過測定果實生長發(fā)育期間糖組分、含量及糖代謝相關(guān)酶活性,分析主要糖含量變化規(guī)律及其與糖代謝相關(guān)酶活性的關(guān)系,明確可溶性糖積累的關(guān)鍵時期和關(guān)鍵酶,探討‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實生長發(fā)育期間可溶性糖積累的生理差異,為深入研究其果實糖代謝的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為蘋果果實增糖降酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為四川省阿壩州蘋果園‘金冠’蘋果及優(yōu)系(SGP-1)的果實。選取生長勢基本一致的3株蘋果樹進(jìn)行樣品采集,樹齡8 a,株行距3 m×4 m,栽培管理水平中等。在花后7 d開始采集樣品,每20 d取1 次樣品,直至果實達(dá)到生理成熟(花后160 d左右),共取9次樣品。幼果期至成熟期果實大小差異較大,因此每次取果量應(yīng)根據(jù)果實大小而定。樣品前處理:果實帶皮去心切碎,迅速用液氮冷凍(-196 ℃)后混勻,分2 份置于超低溫冰箱(-80 ℃),備用,一份用于檢測糖組分及含量,另一份用于分析酶活性。

1.2 方法

1.2.1 果實中糖組分提取與測定 果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇含量均采用高效液相色譜法(HPLC)測定,果實中糖組分提取和測定參照陳美霞[18]和張麗麗等[19]的方法并略加改進(jìn)。稱取液氮研磨成粉的果實1 g左右(計重),加入4 m L超純水,搖勻,在80 ℃水浴提取15 min,8 500 r·min-1離心10 min,殘渣中再加入4 m L 超純水再次提取,合并上清液并定容到10 m L,經(jīng)0.45μm 濾膜過濾,待測。

色譜條件:色譜柱為Thermo(4.6 mm×250 mm)NH2柱,檢測器:RID,以乙腈∶水=80∶20為流動相,流速為0.8 m L·min-1,柱溫35℃,進(jìn)樣量10μL?？扇苄蕴呛繛楦魈墙M分相加之和。

糖組分標(biāo)曲的制作:糖標(biāo)樣均購自Sigma 公司。分別稱取果糖50 mg、葡萄糖50 mg、蔗糖20 mg、山梨醇20 mg溶解于5 m L 超純水,制成混標(biāo)原液。 各糖質(zhì)量濃度分別為果糖10 mg·m L-1,葡萄糖10 mg·m L-1,山梨醇4 mg·m L-1,蔗糖4 mg·m L-1。將混標(biāo)分別稀釋10、8、4、2、1倍,各管質(zhì)量濃度如下(表1)。

表1 標(biāo)樣配制質(zhì)量濃度Table 1 Concentration of standard sample preparation

1.2.2 果實中糖代謝相關(guān)酶活性的測定 所有酶液制備參考Keller等[20]的方法。稱取冷凍果實樣品,液氮研磨,加由50 mmol·L-1HEPESNaOH (p H7.5)、10 mmol· L-1MgCl2、1 mmol·L-1EDTA、2.5 mmol·L-1DTT、0.05%(V/V)Tritonx-100 和0.1%(m/V)BSA組成的提取緩沖液,勻漿,用冷卻的脫脂紗布過濾,低溫離心,收集上清液,2 ℃下透析24 h后的酶液用于酶活性測定。按照酶試劑盒說明書分別測定:蔗糖合成酶(SS-S和SS-C)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、山梨醇脫氫酶(SDH)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)、中性轉(zhuǎn)化酶(NI)、山梨醇氧化酶(SOX)酶活性,3 次重復(fù),平行3 次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖,應(yīng)用SPSS 20進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan’s新復(fù)極差法,0.05 水平上測試)和相關(guān)性分析(pearson法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘金冠’蘋果及其優(yōu)系(SGP-1)果實發(fā)育期間糖積累變化

如圖1-A 所示,發(fā)育前期(7～87 d)‘金冠’及‘SGP-1’果實中可溶性糖以山梨醇為主,果糖、蔗糖和葡萄糖含量極少;發(fā)育后期(107～167 d),兩種材料果實中的可溶性糖以果糖為主,蔗糖、葡萄糖次之,而山梨醇含量極低。隨著果實的發(fā)育,兩材料果實的可溶性糖及各糖組分(果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇)變化規(guī)律總體一致(圖1-A～1-E),可溶性糖含量總體呈上升趨勢,果糖、蔗糖含量的變化趨勢與可溶性糖相似,而山梨醇呈下降趨勢,葡萄糖則呈現(xiàn)升降升動態(tài)變化。如圖1-B～1-D所示,‘金冠’及其優(yōu)系(SGP-1)果糖的快速增長期在果實發(fā)育前期,蔗糖的快速增長期在果實發(fā)育后期,山梨醇在果實發(fā)育初期積累高而后快速下降,而葡萄糖的快速積累期在果實發(fā)育后期(花后127～167 d)。

圖1 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實可溶性糖及各組分含量變化Fig.1 Changes of soluble sugar and each sugar component content in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

‘SGP-1’可溶性糖總體積累速度慢于‘金冠’,至成熟時‘SGP-1’可溶性糖含量較‘金冠’顯著(P＜0.05,下同)降低4.05%,‘金冠’為112.26 mg·g-1,‘SGP-1’為107.71 mg·g-1。在各糖組分上,‘SGP-1’的蔗糖總體積累速度慢于‘金冠’,而果糖和葡萄糖總體積累速度快于‘金冠’,至成熟時,‘SGP-1’果實中的蔗糖含量較‘金冠’顯著降低34.13%,而果糖、葡萄糖含量分別較‘金冠’顯著提高8.66%、17.65%;‘SGP-1’發(fā)育前期果實中的山梨醇含量顯著高于‘金冠’,但下降速度快,到成熟期時降低74.95%,且顯著低于‘金冠’。

2.2 ‘金冠’蘋果及其優(yōu)系(SGP-1)果實發(fā)育中糖代謝酶活性變化

2.2.1 蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性變化 如圖2

圖2 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實蔗糖磷酸合成酶活性變化Fig.2 Change of SPS activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

所示,‘金冠’果實中的SPS活性在花后7～127 d處于較低水平(5.22～8.78μmol·g-1·h-1),有所波動,到花后147～167 d 活性逐漸升高(9.65～12.77μmol·g-1·h-1);‘SGP-1’的SPS 活性除在花27 d 出現(xiàn)明顯峰值(10.25 μmol·g-1·h-1),在花后7～127 d同‘金冠’一致處于較低值,到花后147～167 d 有所回升(8.52～9.61μmol·g-1·h-1)。除花后27 d‘SGP-1’的SPS活性顯著高于‘金冠’,107 d和167 d顯著低于‘金冠’,其余時段二者差異不顯著。

2.2.2 山梨醇脫氫酶(SDH)活性變化 如圖3所示,‘金冠’和‘SGP-1’果實中的SDH 活性變化趨勢總體一致,先上升后下降?！鸸凇腟DH活性峰值出現(xiàn)在花后127 d,為3.12μmol·g-1·h-1,‘SGP-1’的峰值出現(xiàn)在花后47 d,為3.63 μmol·g-1·h-1?；ê?7～47 d‘SGP-1’的SDH 活性顯著高于‘金冠’,到花后107～147 d則顯著低于‘金冠’,成熟時兩者無顯著差異。

圖3 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實山梨醇脫氫酶活性變化Fig.3 Change of SDH activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

2.2.5 轉(zhuǎn)化酶活性變化 如圖6-A 所示,‘金冠’及‘SGP-1’果實中酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)活性變化趨勢前期不同,后期基本一致?！鸸凇腁I活性在整個果實發(fā)育期間波動不大(7.09～14.40 μmol·g-1·h-1),而‘SGP-1’的活性在花后7～27 d快速上升達(dá)到峰值(40.32μmol·g-1·h-1),隨后急下降到最大值的三分之一,保持到中后期波 動較小(5.98～12.21μmol·g-1·h-1)。

2.2.3 山梨醇氧化酶(SOX)活性變化 如圖4所示,隨著果實生長發(fā)育,‘金冠’及‘SGP-1’果實中SOX 活性在花后7～87 d變化趨勢相反,‘金冠’為先降后升,‘SGP-1’為先升后降,到花后107～167 d,兩材料SOX 活性變化趨勢相同,為先降后升。除花后67～87 d,‘SGP-1’的SOX 活性顯著低于‘金冠’外,其余時段均顯著高于‘金冠’。

圖4 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實山梨醇氧化酶活性變化Fig.4 Change of SOX activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

2.2.4 蔗糖合成酶(SS)活性變化 如圖5-A 所示,‘金冠’及‘SGP-1’果實中蔗糖合成酶合成方向(SS-S)活性變化趨勢前期不同,后期一致?；ê?～127 d,‘金冠’SS-S活性總體呈先升后降趨勢,在花后67 d達(dá)到峰值(13.96μmol·g-1·h-1),而‘SGP-1’的SS-S活性在花后27 d升至峰值(14.20μmol·g-1·h-1),之后降低并維持在一個較穩(wěn)定的值,到花后127 d進(jìn)一步降低。花后127～167 d,‘金冠’及‘SGP-1’果實中SS-S活性均呈上升趨勢?！甋GP-1’的SS-S活性在果實發(fā)育早期高于‘金冠’,在果實發(fā)育中后期低于‘金冠’。

如圖5-B所示,‘金冠’及‘SGP-1’果實中蔗糖合成酶分解方向(SS-C)活性前期波動較大,后期緩慢上升?；ê?～67 d兩種材料SS-C 活性較高(4.10～10.54μmol·g-1·h-1),花后87～147 d活性降低(3.77～4.99μmol·g-1·h-1),到花后167 d 活性升至較高值(8.34～8.86 μmol·g-1·h-1)?；ê? d、47 d‘SGP-1’的SSC活性顯著低于‘金冠’,而花后27 d‘SGP-1’的活性則顯著高于‘金冠’,其余時段二者無顯著差異?；ê?～47 d和87 d‘SGP-1’果實AI活性顯著高于‘金冠’,其余時段顯著低于‘金冠’。

圖5 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實蔗糖合成酶活性變化Fig.5 Change of SS activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

如圖6-B所示,‘金冠’及‘SGP-1’果實中性轉(zhuǎn)化酶(NI)活性波動較大,呈多峰曲線?！鸸凇麑峃I活性呈現(xiàn)“降-升-降-升”趨勢,在花后7 d、107 d和167 d出現(xiàn)3個小高峰,最大值出現(xiàn)在花后107 d(23.09μmol·g-1·h-1);而‘SGP-1’的活性在花后7～27 d快速上升達(dá)到最大值(43.88μmol·g-1·h-1),隨后急下降,到花后87 d小幅回升后持續(xù)下降。在整個發(fā)育期,兩材料NI活性差異均達(dá)到顯著水平,花后7～47 d‘SGP-1’果實AI活性顯著高于‘金冠’,花后67 d和107～167 d則顯著低于‘金冠’。

圖6 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實轉(zhuǎn)化酶活性變化Fig.6 Change of invertase activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

2.3 ‘金冠’蘋果及其優(yōu)系(SGP-1)果實糖積累與其代謝酶活性變化的相關(guān)性

根據(jù)上述糖及代謝酶動態(tài)變化規(guī)律,把整個果實發(fā)育期分為前期(花后7～87 d)和后期(花后107～167 d),進(jìn)行‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實糖含量與其代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析,結(jié)果如表2所示。SPS和SS-S是蘋果果實蔗糖合成相關(guān)酶,前期‘SGP-1’果糖含量SDH 呈正相關(guān),與SS-S活性呈極顯著負(fù)相關(guān),而‘金冠’各糖組分與SS-S活性均未達(dá)到顯著水平;后期‘SGP-1’果糖及兩材料葡萄糖和蔗糖均與SPS活性呈顯著或極顯著正相關(guān),兩材料山梨醇與SPS活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。

SS-C、AI和NI是蘋果果實蔗糖分解相關(guān)酶,催化蔗糖分解為葡萄糖和果糖。如表2所示,‘SGP-1’果實的蔗糖含量與此3種蔗糖分解酶相關(guān)性未達(dá)到顯著水平;在前期,果糖含量與AI呈極顯著負(fù)相關(guān),葡萄糖含量與SS-C 活性呈極顯著正相關(guān);在后期,果糖含量與SS-C 活性呈極顯著正相關(guān),與NI活性呈極顯著負(fù)相關(guān),葡萄糖與AI和NI活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。而‘金冠’果實前期蔗糖和果糖含量與SS-C 活性呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān),與NI活性呈極顯著正相關(guān);在后期,蔗糖和葡萄糖含量與SS-C 活性呈顯著正相關(guān),果糖含量與AI和NI活性呈極顯著正相關(guān)。

SDH 和SOX 是蘋果果實山梨醇分解相關(guān)酶,催化山梨醇分解為葡萄糖或果糖。如表2所示,‘SGP-1’和‘金冠’果實中的山梨醇含量在發(fā)育前期均與SDH 呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān),在發(fā)育后期呈極顯著正相關(guān)?！甋GP-1’果實的果糖和葡萄糖含量在發(fā)育后期與SDH 活性呈極顯著負(fù)相關(guān);而‘金冠’果實的果糖含量在發(fā)育前期與SDH 活性呈極顯著正相關(guān),而葡萄糖和蔗糖含量在發(fā)育后期與SDH 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。除‘SGP-1’果實后期葡萄糖含量與SOX 呈極顯著負(fù)相關(guān)外,兩材料各糖組分與SOX 活性相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平。

表2 ‘金冠’蘋果及‘SGP-1’果實糖含量與其代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between fruit sugar content and metabolic related enzyme activities of‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’

3 討論

通過對‘SGP-1’和‘金冠’果實生長發(fā)育期間可溶性糖及各組分含量變化的分析,結(jié)果表明,兩材料果實可溶性糖均以果糖為主,這與李婭楠等[9]、王迪等[21]研究結(jié)果一致。各糖組分變化規(guī)律總體一致,果糖、蔗糖呈上升趨勢,山梨醇呈下降趨勢,葡萄糖升降升,但積累速度不同。在果實發(fā)育前期,‘SGP-1’果實中果糖、葡萄糖和山梨醇含量整體高于‘金冠’,使得可溶性糖快速積累,蔗糖含量與‘金冠’差異不顯著;到果實發(fā)育后期,雖葡萄糖含量仍顯著高于‘金冠’,但蔗糖含量顯著低于‘金冠’,導(dǎo)致可溶性糖總體積累速度顯著低于‘金冠’。兩材料糖分積累變化規(guī)律存在明顯差異,與酶活性和糖代謝相關(guān)基因的差異有關(guān)[22],也受庫細(xì)胞中韌皮部運輸效率、糖的跨膜運輸能力的影響[23],需要進(jìn)一步研究。

蘋果的同化產(chǎn)物主要以山梨醇和蔗糖形式運輸?shù)焦麑嵵?其中山梨醇占80%[24],而糖卸載到果實中的過程在很大程度上取決于果實的庫強(qiáng),衡量庫強(qiáng)大小的一個重要生化指標(biāo)是糖代謝相關(guān)酶活性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)‘SGP-1’果實中主要影響糖代謝的SPS、SDH、SOX、SS-S、SS-C、AI、NI的活性總體表現(xiàn)為在前期顯著高于‘金冠’;后期除SOX 活性高于‘金冠’和SS-C 活性持平于‘金冠’,其余酶活性顯著低于‘金冠’。前期較高的SDH、SOX、AI、NI活性有利于卸載入‘SGP-1’果實中的山梨醇和蔗糖被分解為葡萄糖和果糖,使前期‘SGP-1’中可溶性糖含量顯著高于‘金冠’。在發(fā)育后期,蘋果中淀粉的快速降解以及SPS、SS-S作用使果實進(jìn)入蔗糖快速積累期[25],‘金冠’成熟期較高的SPS和SS-S活性使果實中蔗糖含量顯著高于‘SGP-1’,進(jìn)而可溶性糖含量也顯著高于‘SGP-1’,相關(guān)性分析結(jié)果表明,SPS在兩材料果實發(fā)育后期的蔗糖快速積累階段起主要調(diào)控作用。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),在果實發(fā)育前期調(diào)控兩材料山梨醇分解的關(guān)鍵酶是SDH,Hideaki等[26]也認(rèn)為與SOX 相比,果實發(fā)育前期山梨醇主要受SDH 影響,研究結(jié)果與前人一致;而果實發(fā)育后期蔗糖快速積累主要受SPS影響,這與郭燕[27]和溫志靜等[28]研究認(rèn)為SS-S在蘋果果實蔗糖積累中起主要作用的結(jié)論不一致,這可能與品種、發(fā)育階段不同有關(guān)。另外本研究中還發(fā)現(xiàn)‘SGP-1’果實中的果糖、葡萄糖含量與SPS、SS-C和SDH 活性存在顯著或極顯著正相關(guān),而‘金冠’果實中的果糖、葡萄糖含量除與上述3個酶活性有密切正相關(guān)外,還與SS-S、AI和NI呈正相關(guān)?？梢?蘋果果實的糖代謝存在復(fù)雜性,品種差異以及發(fā)育階段不一致均有可能導(dǎo)致相關(guān)性改變,可溶性糖含量與代謝酶活性的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

‘金冠’與‘SGP-1’果實中可溶性糖及各糖組分變化規(guī)律總體一致,但積累速度不同,至成熟時‘SGP-1’果實的果糖、葡萄糖含量顯著高于‘金冠’,而山梨醇、蔗糖含量顯著低于‘金冠’,更高的果糖含量提升了‘SGP-1’果實風(fēng)味。兩材料果實的糖代謝酶在前期變化趨勢不同,后期基本一致,‘SGP-1’糖代謝相關(guān)酶活性總體表現(xiàn)為前期顯著高于‘金冠’,后期除SOX 活性高于‘金冠’、SS-C活性持平于‘金冠’外,其余酶活性顯著低于‘金冠’。果實發(fā)育前期‘SGP-1’果實各糖組分含量主要受SDH 和SS-S 調(diào)控,而‘金冠’則主要受SDH 和NI調(diào)控;果實發(fā)育后期‘SGP-1’果實各糖組分含量主要受SPS、NI調(diào)控,而‘金冠’則主要受SPS、SS-C和AI調(diào)控?？梢?‘SGP-1’果實可溶性糖積累的關(guān)鍵期為發(fā)育前期,而‘金冠’可溶性糖則在發(fā)育后期快速積累,且對兩材料糖積累起主要調(diào)控作用的酶活性和種類存在差異。