曹曉敏 劉 麗 邸建永 方 祺 徐鳳琴

天津市第一中心醫(yī)院(300192)

卵巢組織冷凍和移植是一種新興的女性生育力保護(hù)措施，與胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍相比，該技術(shù)具有無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。2004年世界第1例冷凍人卵巢組織經(jīng)自體移植后獲得妊娠、分娩[1]，卵巢移植后其功能僅能維持4～5年，因卵巢移植是非血管吻合的移植存在缺血性損傷、新生血管形成的延遲導(dǎo)致移植后卵泡大量丟失[2]。因此，只有縮短卵巢移植后新生血管形成的潛伏期，減少缺血對(duì)卵巢組織造成的損傷，才能延長(zhǎng)移植后卵巢存活時(shí)間。臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)是具有高度自我更新和多重分化潛能的成體多功能干細(xì)胞，有多種生物學(xué)特性，其來(lái)源廣泛、采集簡(jiǎn)便、擴(kuò)增迅速、遷移能力強(qiáng)，并能合成多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，UC-MSCs可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)改善損傷區(qū)域炎癥反應(yīng)；降低干擾素- a(INF-a)表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)程，從而促進(jìn)急性卵巢缺血再灌注損傷小鼠模型新生血管的形成[4]。UC-MSCs分泌的外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平促進(jìn)卵泡發(fā)育,減少卵巢內(nèi)細(xì)胞的凋亡，有效降低化療對(duì)卵巢的損傷,修復(fù)卵巢的功能[5]?；谏鲜隼碚摚狙芯恐荚谔接懧殉惨浦矔r(shí)添加UC-MSCs對(duì)移植后人類(lèi)卵巢皮質(zhì)新生血管生成和卵泡存活的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1卵巢、UC-MSCs及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卵巢組織來(lái)自中國(guó)公民逝世后捐贈(zèng)。UC-MSCs來(lái)源于足月產(chǎn)婦，經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得產(chǎn)婦的知情同意，經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成提取，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)UC-MSCs表面標(biāo)志、形態(tài)和定向分化的鑒定，UC-MSCs傳代3次達(dá)到足夠數(shù)量時(shí)用于移植時(shí)使用。5～6周雌性重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠20只，體重(200±20)g,由北京維通利華動(dòng)物公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，濕度50%～65%，光照周期12h:12h，獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2主要試劑L-DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；Anti-CD34 antibody購(gòu)于中國(guó)Abcam公司；胰蛋白酶K購(gòu)于德國(guó)Merck公司；抗人CD73,CD90,CD105,CD34,CD35單抗購(gòu)于上海弗元生物公司。

1.2 方法

1.2.1UC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.2人卵巢皮質(zhì)的異種移植SCID小鼠給予5%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射，20min后將麻醉小鼠四肢固定于手術(shù)操作板上，酒精棉簽消毒背部皮膚2次，于兩側(cè)髂骨連線中點(diǎn)處縱行切開(kāi)皮膚1cm，小心分離皮下筋膜，將復(fù)蘇的人卵巢組織塊塞入皮下，皮質(zhì)面貼于表皮下，髓面貼于皮下筋膜，每只小鼠隨機(jī)移植4塊組織(2mm×2mm),正方形排列，中間留有空隙?？p合皮膚，待小鼠清醒后放于籠中飼養(yǎng)。卵巢皮質(zhì)移植組(對(duì)照組)移植卵巢皮質(zhì)+10μl 基質(zhì)膠。卵巢皮質(zhì)和干細(xì)胞移植組(UC-MSCs組)：37℃培養(yǎng)箱中取出準(zhǔn)備好的干細(xì)胞，微量移液器吸取10μl內(nèi)含5×105間充質(zhì)干細(xì)胞的基底膜基質(zhì)膠，均勻的涂抹于皮質(zhì)片的表面。

1.2.3形態(tài)學(xué)分析(HE染色)卵巢移植后3，7，14d頸椎脫臼法處死小鼠，從背部原切口處取出移植卵巢組織，經(jīng)常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片，取間隔10張的組織切片行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察始基卵泡形態(tài)，計(jì)數(shù)卵母細(xì)胞核深染的卵泡。形態(tài)分析參照Gougeon提出的標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2.4凋亡測(cè)定(TUNEL法)卵巢移植后3，7，14d頸椎脫臼法處死小鼠，從原切口取出移植卵巢組織，經(jīng)常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5μm厚度連續(xù)切片，取間隔10張組織切片進(jìn)行TUNEL染色。按照Promega DeadEndTM凋亡熒光檢測(cè)系統(tǒng)(Fluorometric Tunel system)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5免疫組織化學(xué)分析組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理、切片，脫蠟至水，微波抗原修復(fù)， 3%(v/v)H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，一抗按1：100用抗體稀釋液稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明。已知陽(yáng)性的組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。微血管判定及MVD計(jì)數(shù)方法參照文獻(xiàn)[7]：每張切片先在低倍(100倍)視野鏡中選出血管最豐富的3個(gè)區(qū)域，再400倍視野下計(jì)數(shù)微血管3次取均值。凡被染成棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇的作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，管腔結(jié)構(gòu)形成不作為判定的必要條件。

1.2.6移植卵巢在體局部的血液灌注量檢測(cè)激光微循環(huán)血流成像儀(PeriCamPSI 瑞典)監(jiān)測(cè)整個(gè)微循環(huán)系統(tǒng)的血液灌注量。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度(25±0.5)℃，恒濕度(50±10)%下進(jìn)行。檢測(cè)卵巢皮質(zhì)移植后3,7,14d局部血流灌注量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UC-MSCs的鑒定

倒置顯微鏡下UC-MSCs細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，且形態(tài)均一，呈旋渦狀或平行貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞排列整齊有序，見(jiàn)圖1(1210頁(yè))。流式細(xì)胞儀儀檢測(cè)UC-MSCs細(xì)胞表面分子標(biāo)志物CD73、CD90、CD105陽(yáng)性細(xì)胞比例>95%，CD34、CD45陽(yáng)性細(xì)胞比例<2%視為高純度間充質(zhì)干細(xì)胞，見(jiàn)圖2(1210頁(yè))。

2.2 移植后卵巢組織形態(tài)學(xué)分析

卵巢移植后3d dUC-MSCs組與對(duì)照組卵巢組織中形態(tài)正常卵泡數(shù)目無(wú)差別(61.5%、62.4%)(χ2=0.02,P>0.05)，移植后7，14d UC-MSCs組均高于對(duì)照組(50.2%、38.5%)(χ2=5.55，P<0.05)；(5.4%、34.0%)(χ2=7.43，P<0.05)。見(jiàn)圖3(1210頁(yè))。

2.3 移植后卵巢組織內(nèi)細(xì)胞凋亡

移植后第3天 UC-MSCs組與對(duì)照組卵巢組織中發(fā)生凋亡的卵泡比率無(wú)差別(12.3%、13.5%)(χ2=0.06，P>0.05)，移植后7，14d UC-MSCs組低于對(duì)照組(19.0%、27.2%)(χ2=3.79，P<0.05)； (31.5%、46.3%)(χ2=46.1，P<0.05)。見(jiàn)圖4(1211頁(yè))。

2.4 在體移植物局部血管生成的免疫組化分析

卵巢皮質(zhì)移植后3，7，14d UC-MSCs組卵巢微血管密度高于對(duì)照組[(3.7±0.9)% 、(1.8±0.4)%,(t=19.29,P<0.05)；(6.6±0.9)%、(3.1±1.1)%，(t=24.63,P<0.05)；(8.9±1.5 )%、(4.2±1.7)%,(t=20.73,P<0.05)]。見(jiàn)圖5(1211頁(yè))。

2.5 在體局部移植物血液灌注量

移植卵巢在體局部血液灌注量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6(1211頁(yè))。卵巢皮質(zhì)移植后3d ，UC-MSCs組和對(duì)照組移植物局部血流灌流量無(wú)差別[(46.4±13.5)PU、(47.4±15.1)PU](t=0.14,P>0.05)，移植后7d UC-MSCs組高于對(duì)照組[(106.4±12.2)PU、(87.8±11.9)PU](t=2.44,P<0.05)，移植后14d UC-MSCs組移植物局部的灌流高于對(duì)照組[(124.5±18.4)PU、(99.3±16.6)PU](t=2.27,P<0.05)。兩組微循環(huán)灌流量均隨移植時(shí)間長(zhǎng)而增加。

3 討論

卵巢組織復(fù)蘇自體移植后的成活情況是決定生育力能否恢復(fù)的關(guān)鍵，目前移植后存活的卵巢組織功能維持時(shí)間并不理想，因?yàn)槁殉财べ|(zhì)塊在移植后幾天內(nèi)一直處于局部無(wú)血管的缺血缺氧狀態(tài)，這種狀態(tài)持續(xù)3～5d，可導(dǎo)致移植后卵泡大量的丟失，丟失率高達(dá)60%～80%[8]。UC-MSCs是一類(lèi)具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群體,有體內(nèi)外擴(kuò)增培養(yǎng)和多向分化的潛能。近年來(lái)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的大量應(yīng)用并取得了許多成果，國(guó)內(nèi)研究報(bào)道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅可以分化為心肌細(xì)胞和血管細(xì)胞，還可以分泌大量的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，并以旁分泌的方式誘導(dǎo)新生血管形成、抗炎癥、抗凋亡等，減小急性心肌梗死面積，減少瘢痕形成，改善心功能[9]。在急性卵巢缺血再灌注損傷動(dòng)物模型上UC-MSCs可促進(jìn)受損卵巢組織恢復(fù)功能和血，減少卵泡受損[10]。研究證實(shí)，移植人工卵巢模型中可顯示宿主內(nèi)皮細(xì)胞的血管化[11-12]。基于此，本研究試圖通過(guò)選用UC-MSCs促進(jìn)小鼠血管再生重建，降低卵巢皮質(zhì)移植后因缺血導(dǎo)致的卵泡大量丟失。本研究選擇3個(gè)具有代表性的時(shí)間點(diǎn)，分別為移植后的第3，7和14d，分析UC-MSCs對(duì)移植后早期、中期和晚期血管生成的影響。通過(guò)免疫標(biāo)記小鼠來(lái)源的CD34抗原，評(píng)價(jià)移植皮片局部的血管化。移植后7，14d UC-MSCs組卵巢微血管密度顯著高于對(duì)照組，提示UC-MSCs使移植皮質(zhì)的血管化提前。其機(jī)制可能是臍帶來(lái)源的UC-MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞和各種血管生成因子促進(jìn)新生血管的形成。也可能是MSCs通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF2)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGFB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和血管生成素等，促進(jìn)血管形成。本研究下一步工作是設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述假設(shè)。

考慮到形態(tài)學(xué)分析在評(píng)估血管生成的局限性，本研究通過(guò)測(cè)量移植物局部的血流量這一反應(yīng)血管生成的可靠指標(biāo)進(jìn)行深入探討，并首次引入了激光微循環(huán)血流成像儀檢測(cè)移植物局部的微循環(huán)血流量的變化，此方法無(wú)創(chuàng)、分辨率高、超快采樣易于捕捉血流實(shí)時(shí)變化。由于環(huán)境溫度、濕度可能影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此本實(shí)驗(yàn)在恒溫恒濕的屏障系統(tǒng)內(nèi)完成避免了環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。既往的研究報(bào)道UC-MSCs在第3天對(duì)血管生成有顯著的誘導(dǎo)作用[13]，本研究在這一時(shí)間點(diǎn)兩組移植局部的血液灌注量沒(méi)有明顯差別，UC-MSCs組的初始血流灌注增加發(fā)生在移植后第7天。這種延遲血液灌注現(xiàn)象可能是新的微血管網(wǎng)絡(luò)在早期沒(méi)有獲得血液供應(yīng)的功能，而是到成熟一定時(shí)期后，新生的血管才可以產(chǎn)生血液灌注。另一方面，移植后第3天形態(tài)正常的原始卵泡比例兩組之間無(wú)差別，在第7天后，UC-MSCs組形態(tài)正常的原始卵泡比例較對(duì)照組明顯增加，因此，推測(cè)UC-MSCs增加的移植物微血管化、改善卵泡存活，只有在移植物已經(jīng)恢復(fù)血供后才能發(fā)揮作用，與組織學(xué)血管生成無(wú)關(guān)。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道移植后卵泡平均存活率僅25%[14-15]。本研究UC-MSCs組移植14d形態(tài)正常的卵泡比例達(dá)到46%，證實(shí)了UC-MSCs通過(guò)改善移植物局部微循環(huán)，減少卵泡損失的假設(shè)。本研究中移植后兩組的細(xì)胞凋亡率均有所增加，但移植后第7天和第14天UC-MSCs組比對(duì)照組卵泡凋亡率明顯降低?？赡芘cUC-MSCs加速移植物微循環(huán)重建、較早恢復(fù)局部氧供，降低了低氧對(duì)移植物的損傷，從而使得卵泡閉鎖率減少所致。

總之卵巢組織移植時(shí)使用UC-MSCs動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是令人鼓舞的，UC-MSCs可以使卵巢組織的血管化提前，細(xì)胞凋亡減少。未來(lái)的工作將側(cè)重于闡明UC-MSCs在卵巢移植后微循環(huán)重建過(guò)程中發(fā)揮作用的各種機(jī)制研究。