吳玉臣, 康靜靜, 張雪銘, 高 豐

（1.吉林大學(xué), 吉林長春 130062； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院, 河南鄭州 450046； 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 廣東廣州 510642）

益生菌是一種定植于宿主腸道內(nèi)的活菌制劑, 適當(dāng)攝入可以改善宿主微生態(tài)平衡, 對宿主健康產(chǎn)生有益影響。益生菌主要通過調(diào)節(jié)環(huán)境pH、競爭繁殖、抑制代謝產(chǎn)物、免疫激活等機(jī)制抑制病原菌的生長, 提高宿主免疫功能, 從而對胃腸道疾病起到明顯的防治作用（杜志琳等, 2016）。近年來, 益生菌制劑在我國防治疾病方面顯示出了良好的應(yīng)用前景（孫雯娟等, 2015）, 但益生菌在動物機(jī)體中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

白細(xì)胞分化抗原（Cluster of Differentiation, CD）是細(xì)胞膜上的一類蛋白質(zhì)或糖蛋白, 來自不同譜系的白細(xì)胞在不同階段的分化成熟和活化過程中出現(xiàn)細(xì)胞表面標(biāo)記。CD編碼占據(jù)最多的是細(xì)胞因子和趨化性細(xì)胞因子及其受體、黏附分子和協(xié)同刺激分子、Toll樣受體（TLR）以及NK細(xì)胞受體（金伯泉等, 2005）。與T細(xì)胞識別、黏附、活化有關(guān)的CD分子有CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD58、CD80、CD86等（吳 敏, 2014）。CD分子在多種途徑起著重要作用, 通常參與免疫細(xì)胞整合素、受體、配體等各種蛋白分子的表達(dá), 以及免疫應(yīng)答反應(yīng)的識別、黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。

因此, 為了探討復(fù)合益生菌粉對正常小鼠免疫功能的影響, 本研究通過灌服益生菌后檢測Balb/C小鼠外周血中CD3、CD4和CD8的分子表達(dá)水平, 探討益生菌調(diào)節(jié)動物機(jī)體免疫功能的作用機(jī)理, 以期為其后續(xù)的功能評價(jià)和合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動物 6～8周齡Balb/c小鼠48只, 雌雄各半, 購自河南省鄭州大學(xué)試驗(yàn)動物中心（[SCXK（豫）2010-0002]）。所選小鼠飼養(yǎng)條件一致、健康狀況良好。

1.2 益生菌 主要菌種為枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳桿菌, 均購自中國微生物菌種保藏管理中心, 菌種編號如表1所示。益生菌制劑委托鄭州金百合生物工程有限公司制作, 活菌數(shù)為200億CFU/g。

表1 益生菌菌株保藏編號

1.3 主要儀器 全自動高壓滅菌鍋（SX-500）, 日本TOMY；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A）, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高速臺式離心機(jī)（TGL-16B）, 上海安亭科學(xué)儀器廠；全自動酶標(biāo)儀（Synergy HTX）美國伯騰儀器有限公司；全自動雪花制冰機(jī)（IMS-20）, 常熟市雪科電器有限公司；-20℃冰箱（BCD-197KA）, 河南新飛電器有限公司；小鼠CD3、CD4、CD8酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司, YB-CD3-Mu、YB-CD4-Mu、YB-CD8-Mu）。

2 方法

2.1 試驗(yàn)動物分組 試驗(yàn)將48只6～8周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分為4組, 分別為對照組（C組）、益生菌低、中、高劑量組（P-L、P-M、P-H組）, 每組12只。小鼠分組及具體實(shí)施方案如表2所示。

表2 分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2 試驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理和給藥 各組小鼠在室溫條件下分籠飼養(yǎng), 試驗(yàn)前對小鼠所處環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒, 自由采食、飲水；每天測量小鼠體重后, 試驗(yàn)組各組小鼠根據(jù)體重灌服益生菌, 對照組小鼠根據(jù)體重灌服生理鹽水。

2.3 收集血清 初次灌服益生菌當(dāng)天為第1天, 分別于第7、14、21、28天隨機(jī)選取C、P-L、P-M、P-H組小鼠各3只, 眼球采血收集于1.5 mL EP管中, 3000 r/min離心15 min, 收集上層血清, 置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 雙抗體夾心ELISA方法 嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測血清中T細(xì)胞因子CD3、CD4、CD8的表達(dá)水平。

2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表處理, 試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示, 對各項(xiàng)樣本均數(shù)兩兩比較, P＜0.05表示組間差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 益生菌對Balb/C小鼠血清CD3分子表達(dá)量的影響 由表3和圖1可知, 正式試驗(yàn)進(jìn)行7 d后, 與對照組相比, P-L和P-H組小鼠血清CD3分子表達(dá)量分別顯著上升54.78%（P＜0.05）、98.52%（P＜0.05）；14 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD3分子表達(dá)量分別上升39.09%、26.17%和53.35%, 但差異不顯著（P＞0.05）；21 d后, P-H組小鼠血清CD3分子表達(dá)量與對照組相比顯著升高83.51%（P＜0.05）；28 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD3分子表達(dá)量分別上升27.10%、15.25%和32.64%, 但各組差異不顯著（P＞0.05）。P-M組小鼠血清CD3分子表達(dá)量隨飼喂益生菌時間的延長呈現(xiàn)出日益增長的趨勢, 并于21 d后達(dá)到最大值, 說明該益生菌以中劑量給藥作用較為穩(wěn)定；P-H組小鼠血清CD3分子表達(dá)量最高, 但隨著時間變化并未處于穩(wěn)定升高狀態(tài), 因此, 高劑量飼喂益生菌時需注意用藥方式。

表3 益生菌對小鼠血清CD3分子表達(dá)量的影響 IU/mL

圖1 益生菌對小鼠血清CD3分子表達(dá)量的影響

3.2 益生菌對Balb/C小鼠血清CD4分子表達(dá)量的影響 由表4和圖2可知, 試驗(yàn)進(jìn)行7 d后, 與對照組相比, P-M和P-H組小鼠血清CD4分子表達(dá)量分別上升11.89%、7.61%, 但無顯著差異（P＞0.05）；14 d后, 與對照組相比, P-L和P-M組小鼠血清CD4分子表達(dá)量分別上升10.89%、5.72%, 但差異不顯著（P＞0.05）；28 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD4分子表達(dá)量分別上升36.68%、17.63%和44.14%, 各組差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 益生菌對小鼠血清CD4分子表達(dá)量的影響

表4 益生菌對小鼠血清CD4分子表達(dá)量的影響 U/mL

3.3 益生菌對Balb/C小鼠血清CD8分子表達(dá)量的影響 由表5和圖3可知, 試驗(yàn)進(jìn)行7、14、21和28 d時, 飼喂益生菌組小鼠的血清CD8分子表達(dá)量分別不同程度高于對照組, 并于7和14 d時顯著高于對照組（P＜0.05）。7 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD8分子表達(dá)量分別顯著上升44.94%（P＜0.05）、46.73%（P＜0.05）和43.78%（P＜0.05）；14 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD8分子表達(dá)量分別顯著上升39.27%（P＜0.05）、40.05%（P＜0.05）和36.02%（P＜0.05）；21 d后, 與對照組相比, P-M組小鼠血清CD8分子表達(dá)量顯著上升50.46%（P＜0.05）, P-L和P-H組小鼠血清CD8分子表達(dá)量與對照組相比分別上升17.78%、42.40%, 但差異不顯著（P＞ 0.05）；28 d后, 與對照組相比, P-L、P-M和P-H組小鼠血清CD8分子表達(dá)量分別上升2.75%、6.36%和35.40%, 但無顯著差異（P＞0.05）。血清CD8分子表達(dá)量最高值出現(xiàn)在試驗(yàn)7 d后, 7 d后有所回落, 但表達(dá)量仍高于同時間的對照組。說明益生菌對小鼠血清CD8分子表達(dá)水平作用效果快, 但效果不夠持續(xù), 可用于短期增強(qiáng)免疫功能。

表5 益生菌對小鼠血清CD8分子表達(dá)量的影響 U/mL

圖3 益生菌對小鼠血清CD8分子表達(dá)量的影響

4 討論

CD3分子能表達(dá)于全部T細(xì)胞上, 是成熟T淋巴細(xì)胞共有的表面標(biāo)志, 代表著整個機(jī)體的細(xì)胞免疫功能（張蕊等, 2012）。CD4分子分布于部分T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞表面, 也發(fā)現(xiàn)于某些B細(xì)胞、EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞和腦細(xì)胞（吳敏和徐龍, 2014）。CD4 T細(xì)胞識別靶細(xì)胞表面的MHC-II抗原肽, 在免疫反應(yīng)中可以調(diào)控和輔助其他淋巴細(xì)胞發(fā)揮功能。腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致炎癥性腸?。↖BD）免疫系統(tǒng)功能障礙和慢性炎癥, 腸道微生物可以引發(fā)不同的信號并誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化（Zhang等, 2019）。CD8分子分布在部分T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞, 在特異性免疫反應(yīng)過程中起到識別和呈遞抗原的重要作用。CD8蛋白是殺傷性T細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物, CD8通過表面的MHCⅠ分子與CD4等其他免疫細(xì)胞的MHC Ⅱ分子結(jié)合, 從而識別其他免疫細(xì)胞表面結(jié)合的抗原物質(zhì), 對病毒感染細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的靶細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用, 是免疫功能的重要組成部分（李朝政等, 2015）。

本試驗(yàn)結(jié)果可以看出, 中劑量添加該益生菌對小鼠血清CD3、CD4和CD8的表達(dá)水平的影響最為穩(wěn)定, 呈現(xiàn)出穩(wěn)定升高或穩(wěn)定下降的趨勢。高劑量添加該益生菌對升高小鼠血清CD3分子的表達(dá)水平作用最顯著, 且短期使用就有比較明顯的效果, 但需注意高劑量添加益生菌時動物的生理表現(xiàn), 根據(jù)實(shí)際情況隨時調(diào)整用藥劑量。長期飼喂益生菌對血清內(nèi)CD8分子的表達(dá)量有升高作用, 但升高趨勢隨時間的加長效果逐漸降低, 因此需注意益生菌的用藥時長。由此可以推斷, 該益生菌對Balb/C小鼠的免疫性能有不同程度的改善作用。

益生菌在IBD中發(fā)揮的有益作用是眾所周知的, 已有研究已經(jīng)可以證明益生菌對宿主的健康狀況具有保護(hù)和改善作用（杜志琳等, 2016）。有研究表明, 單一或復(fù)合益生菌均能有效提高免疫器官指數(shù), 改善血液生化指標(biāo), 對小鼠免疫機(jī)能具有促進(jìn)作用, 且復(fù)合益生菌治療效果更顯著（黎雨晴等, 2022）。黃蕊蕊等（2021）研究表明, 復(fù)合益生菌粉能增強(qiáng)體液免疫、單核-吞噬細(xì)胞活性和NK細(xì)胞的活性, 具有一定的免疫增強(qiáng)功能。蘇碩楠和侯林中（2022）研究表明, 3種益生菌與低聚果糖復(fù)合粉可通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能、體液免疫及NK細(xì)胞活性來增強(qiáng)小鼠的免疫功能。在動物生產(chǎn)方面, 劉佳（2015）研究表明, 添加復(fù)合益生菌制劑對豬只采食量和料重比無明顯變化, 但豬只日增重卻有明顯的提高, 說明豬只體內(nèi)營養(yǎng)吸收更加充分, 與復(fù)合益生素的降解作用有直接關(guān)系。這與本試驗(yàn)的結(jié)論一致。

本研究結(jié)果揭示, 服用益生菌可以增強(qiáng)Balb/C小鼠細(xì)胞免疫功能, 但對體液免疫的影響作用尚未進(jìn)行, 仍需進(jìn)一步分析益生菌對血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）含量的影響。