曹雅芹，戚惠穎，徐大勇，趙雅潔，顧東萍，黃金飛，鄧道貴

(淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000)

溞屬種類是一類常見的淡水枝角類甲殼動(dòng)物，它們既濾食水體中的浮游藻類、有機(jī)碎屑和細(xì)菌；又因其具有繁殖率高、營養(yǎng)豐富、易培養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)緩慢等特點(diǎn)，又是魚類的天然餌料，它們是水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的重要組成部分。幾丁質(zhì)是自然界中十分豐富的合成聚合物，廣泛存在于昆蟲外骨骼、甲殼動(dòng)物的外殼(包括溞屬種類的殼刺)、真菌細(xì)胞壁等生物體中，主要對(duì)生物體起保護(hù)作用。目前，已有研究者對(duì)蝦蟹類的幾丁質(zhì)及幾丁質(zhì)衍生物的特性開展了研究。另有研究表明，從蝦、蟹和真菌中提取的幾丁質(zhì)具有抗菌活性。

葡萄球菌是一種革蘭氏陽性的球形細(xì)菌，廣泛分布于自然界、人與動(dòng)物的皮膚和黏膜上，通常排列成葡萄串狀。VON EIFF等認(rèn)為，葡萄球菌屬中的一些種類(包括沃氏葡萄球菌)是一類新的致病菌。沃氏葡萄球菌的毒性弱于金黃色葡萄球菌，通?？梢栽谌梭w表面、動(dòng)物和發(fā)酵食品中檢測(cè)到。葡萄球菌屬種類不僅廣泛分布在熱帶海水、沉積物、藻類和無脊椎動(dòng)物中，也被發(fā)現(xiàn)在亞熱帶海洋魚類和淡水魚類中。目前，有關(guān)沃氏葡萄球菌侵染魚類、引起致病的研究已有一些報(bào)道。

在自然水體中，溞屬種類殼刺斷裂的現(xiàn)象十分普遍，但其發(fā)生機(jī)理尚不清楚。本文利用平板分離技術(shù)，以16S rDNA基因作為分子標(biāo)記，對(duì)發(fā)病盔形溞進(jìn)行了病原分離與鑒定，旨在為溞屬種類殼刺斷裂的病原機(jī)理提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和培養(yǎng)基

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，Taq Plus DNA聚合酶，GeneRuler DNA Ladder Mix，幾丁質(zhì)等均購自生物工程(上海)股份有限公司。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 7.0；LB液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉。

膠體幾丁質(zhì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：0.03% KHPO，0.07% KHPO，0.002% FeSO，0.05% MgSO·7HO，0.001% ZnSO，1.5% 膠體幾丁質(zhì)，pH 7.0。

膠體幾丁質(zhì)固體篩選培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1.6%瓊脂。膠體幾丁質(zhì)的制備參考苗飛等的方法。

1.2 引物

16S rDNA引物為細(xì)菌性檢測(cè)通用引物27F和1492R，即27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 盔形溞的培養(yǎng)及鳙魚水的配制

盔形溞()來自巢湖休眠卵的孵化。孵出的盔形溞幼溞投喂斜生四鏈藻()，在溫度(25±1)℃、光暗比為12 h∶12 h、光照度為2 500 lx的條件下培養(yǎng)，成熟后產(chǎn)出的第三代幼溞(出生<6 h)用于實(shí)驗(yàn)。

鳙魚水配制：從魚塘中購買新鮮的鳙魚(約1 kg)放養(yǎng)在水缸中，注入15 L的曝氣48 h以上的自來水，2 d后收集鳙魚水，用0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 發(fā)病盔形溞的來源

發(fā)病盔形溞來自本實(shí)驗(yàn)室，盔形溞()在鳙魚水培養(yǎng)下出現(xiàn)殼刺斷裂的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將第三代盔形溞幼溞(出生<6 h)分成試驗(yàn)組與對(duì)照組，每組15只。試驗(yàn)組每只分別放入50 mL的燒杯中，加入40 mL的培養(yǎng)液(含有20%鳙魚水和80%曝氣自來水)，對(duì)照組分別加入40 mL 100%曝氣自來水。實(shí)驗(yàn)期間，在Olympus CX21顯微鏡下觀察盔形溞的殼刺形態(tài)變化。

1.5 發(fā)病盔形溞的細(xì)菌菌株分離及形態(tài)觀察

收集實(shí)驗(yàn)期間出現(xiàn)殼刺斷裂現(xiàn)象的盔形溞(圖1)，先用無菌解剖刀切取殼刺，使用無菌水沖洗幾遍，再用無菌槍頭搗碎后接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下震蕩培養(yǎng)4～5 h。取少許菌液，采用涂布法均勻涂布到LB平板。挑選單菌落，并進(jìn)行純化，經(jīng)純化后的細(xì)菌再接種到膠體幾丁質(zhì)固體培養(yǎng)基上觀察是否有菌落產(chǎn)生。

圖1 魚水培養(yǎng)引發(fā)的盔形溞殼刺斷裂現(xiàn)象Fig.1 Broken tail spine of D.galeata under fish-water culture圖A、B是魚水培養(yǎng)下引發(fā)的盔形溞殼刺斷裂的現(xiàn)象，圖C是正?？螠械臍ご?/p>

用接種環(huán)隨機(jī)挑取9個(gè)單菌落并分離純化，對(duì)純化后的菌株進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，在Olympus CX21 顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.6 分離菌株的16S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

按照潘曉磊等的方法，以分離菌株的DNA作為模板，采用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物27F和1492R，對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer、dNTP(each 10 mmol/L)、Taq Plus DNA Polymerase(5 U/μL)、50 mmol/L MgSO共計(jì)12.5 μL，上、下游引物各1 μL，Template(DNA) 1 μL，ddHO 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，由生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序。

將9個(gè)分離菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果拼接后，通過NCBI/BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，使用MEGA 7.0軟件，用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其屬種。

然后，將純化的菌株在液體LB培養(yǎng)基37 ℃下震蕩培養(yǎng)10～12 h，使用稀釋涂布平板法計(jì)算菌液濃度，用于分離菌株的致病性試驗(yàn)。菌種和50%甘油按照1∶1的比例保存于-80 ℃。

1.7 分離菌株致病性試驗(yàn)

將沒有受到鳙魚水侵染的第三代盔形溞幼溞(出生<6 h)設(shè)置試驗(yàn)組與對(duì)照組。試驗(yàn)組與對(duì)照組分別設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行5個(gè)盔形溞，每個(gè)平行的盔形溞均放入含100 mL無菌蒸餾水的150 mL錐形瓶中。每個(gè)平行盔形溞的錐形瓶中接種菌液濃度為9.2×10CFU/mL，在25 ℃下智能光照震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為40 r/min 。在Olympus CX21顯微鏡下觀察分離菌株對(duì)盔形溞的致病性。

當(dāng)分離菌株侵染正常盔形溞致病后，取病灶(盔形溞斷裂的殼刺)進(jìn)行分離純化細(xì)菌，16S rDNA分子標(biāo)記測(cè)序，檢驗(yàn)此菌株與原分離菌株是否一致。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的形態(tài)特征

純化后的分離菌株在膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均出現(xiàn)濕潤、表面光滑、隆起的乳白色圓形小菌落(圖 2A)。挑取單個(gè)菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果均顯示革蘭氏染色陽性，顯微鏡下可見菌體呈藍(lán)紫色，單個(gè)、成對(duì)、短鏈狀或者不規(guī)則排列聚集呈葡萄串狀分布的革蘭氏陽性球菌(圖 2B)。

圖2 分離菌在膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板(A)和顯微鏡(B)下的形態(tài)Fig.2 Morphology of isolated bacteria on colloidal chitin medium plate(A) and under oil microscope(B)

2.2 分離菌株遺傳距離分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

9個(gè)分離菌株16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序所得的核苷酸序列，與NCBI上登錄的不同來源8株沃氏葡萄球菌的遺傳距離最小，范圍在0～0.001(圖3)。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建Neighbour-Joining進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，1～9株分離菌株與8株沃氏葡萄球菌的親緣關(guān)系最近，位于同一個(gè)小分支上(圖4)。因此，9株分離菌均應(yīng)為沃氏葡萄球菌。

圖3 分離菌株遺傳距離分析結(jié)果Fig.3 Results of genetic distance analysis on isolated bacteria1～9是本研究的分離菌株，其它12株是NCBI上登錄的不同來源的葡萄球菌

圖4 分離菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建Fig.4 Construction of phylogenetic tree of isolated bacteria

2.3 分離菌株致病性試驗(yàn)結(jié)果

在致病性試驗(yàn)過程中，試驗(yàn)組盔形溞幼溞接種分離菌株菌液4 d后，3個(gè)平行試驗(yàn)組分別有80%、80%、60%的盔形溞出現(xiàn)殼刺斷裂的癥狀(圖5)。用膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板對(duì)試驗(yàn)組斷裂殼刺進(jìn)行細(xì)菌菌株分離，結(jié)果也分離培養(yǎng)出濕潤、表面光滑、隆起的乳白色圓形小菌落，呈革蘭氏染色陽性球菌，在顯微油鏡下菌體特征與鳙魚水培養(yǎng)引起的盔形溞斷裂殼刺中分離到的菌株一致。對(duì)照組盔形溞，未能從其殼刺中分離到該細(xì)菌。

圖5 沃氏葡萄球菌侵染盔形溞后殼刺的變化Fig.5 Changes of the tail spine of D.galeata infected by S.warneriA是分離菌株引發(fā)的盔形溞殼刺斷裂現(xiàn)象，B是A的放大圖

2.3 致病性試驗(yàn)后盔形溞斷裂殼刺中分離菌的鑒定

將致病性試驗(yàn)后盔形溞斷裂殼刺中得到的10～13株分離菌16S rDNA測(cè)序結(jié)果，在NCBI里進(jìn)行BLAST，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建Neighbour-Joining進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，10～13株分離菌株與1～9株分離菌和沃氏葡萄球菌的親緣關(guān)系最近，位于同一個(gè)小分支上(圖6)。因此，10～13株分離菌也均為沃氏葡萄球菌。

圖6 致病試驗(yàn)后盔形溞斷裂殼刺中分離菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建Fig.6 Phylogenetic tree construction of isolated bacteria from broken tail spines of D.galeata after pathogenic test10～13株是致病性試驗(yàn)后斷裂殼刺中的分離菌

3 討論

本研究結(jié)果表明，鳙魚培養(yǎng)水引起盔形溞殼刺斷裂的主要原因是由沃氏葡萄球菌致病造成的。該菌也曾在羅非魚()、虹鱒()和黃帶擬鲹()等多種魚類中被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是魚類病害的潛在病原。本研究從盔形溞斷裂殼刺中分離鑒定出沃氏葡萄球菌，該菌是否與鳙魚生活環(huán)境或者鳙魚自身的生理需求有關(guān)，目前尚不清楚。此外，沃氏葡萄球菌侵染盔形溞的致病部位是否只位于殼刺，還有待于進(jìn)一步研究。

幾丁質(zhì)普遍存在于陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)中，是一種十分豐富的有機(jī)大分子多聚物。幾丁質(zhì)的降解過程需要有幾丁質(zhì)酶的參與。目前，變形菌門中的粘質(zhì)沙雷氏菌()、假交替單胞菌(sp)和纖維弧菌()，放線菌門中的鏈霉菌(sp)等多種幾丁質(zhì)降解菌已相繼被發(fā)現(xiàn)。此外，在厚壁菌門的蠟樣芽胞桿菌()、枯草芽胞桿菌()、蘇云金芽胞桿菌()、類芽胞桿菌()和沃氏葡萄球菌()等種類中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶的存在。ITOH等認(rèn)為，產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌一般能夠參與幾丁質(zhì)的降解。在甲殼動(dòng)物的外殼中，幾丁質(zhì)是廣泛存在的，且在這些動(dòng)物的生長過程中須完成新舊外骨骼的更替。在全基因組測(cè)序結(jié)果中，SAMRITI等發(fā)現(xiàn)了沃氏葡萄球菌中幾丁質(zhì)酶的存在。先前的研究已經(jīng)表明，利用膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基能夠篩選出產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的菌株。本研究中，沃氏葡萄球菌在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板上長出了乳白色菌落，這暗示沃氏葡萄球菌能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、且產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶水解了培養(yǎng)基中的幾丁質(zhì)。當(dāng)沃氏葡萄球菌再次侵染健康的盔形溞后，會(huì)產(chǎn)生和鳙魚培養(yǎng)水引起盔形溞殼刺斷裂的相同性狀。因此，我們認(rèn)為這可能是沃氏葡萄球菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對(duì)盔形溞殼刺中的幾丁質(zhì)有水解作用。由于盔形溞殼刺部位含有較多的幾丁質(zhì)，這可能是盔形溞殼刺部位易受到沃氏葡萄球菌侵染致病的原因。

根據(jù)科赫法則，沃氏葡萄球菌是造成本研究中盔形溞殼刺斷裂的重要原因，但也不能排除盔形溞個(gè)體遇到潛在威脅時(shí)通過調(diào)節(jié)外部形態(tài)特征和內(nèi)部生理功能等來適應(yīng)異質(zhì)生境而產(chǎn)生形態(tài)上的變化。因此，我們認(rèn)為有必要深入開展沃氏葡萄球菌侵染盔形溞的機(jī)制及可能產(chǎn)生的病害等方面的研究，以提高人們對(duì)沃氏葡萄球菌侵染水生甲殼類動(dòng)物表層幾丁質(zhì)的認(rèn)識(shí)。