李寧，聶鴻濤，黎強(qiáng)，霍忠明，閆喜武

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023)

貝類屬軟體變溫動物，其生理狀態(tài)易受外界環(huán)境特別是溫度的影響，而脂肪酸在貝類的免疫應(yīng)答過程、溫度適應(yīng)性、生長發(fā)育和繁殖等生理過程中均起著關(guān)鍵的作用[1-3]。在適宜溫度范圍內(nèi)，貝類可進(jìn)行正常的生理活動，但超出該范圍可能會發(fā)生生理紊亂甚至死亡[4-6]。應(yīng)對低溫脅迫的能力對于自然條件下水生生物的生存非常重要。低溫會引起貝類的冷應(yīng)激反應(yīng)，貝類可通過調(diào)節(jié)與低溫耐受、低溫脅迫的相關(guān)基因，翻譯合成抗寒相關(guān)蛋白，從而減少低溫對其造成的損傷。脂肪酸去飽和酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ADs)引入雙鍵，調(diào)節(jié)生物膜膜脂不飽和脂肪酸的水平，改變生物膜的流動性，從而響應(yīng)和適應(yīng)低溫。在脂肪酸合成代謝過程中，乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme a carboxylase，ACC)是脂肪酸合成中的限速酶，在脂肪酸合成和代謝中起著重要作用。

菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum是中國重要的海洋經(jīng)濟(jì)貝類，廣泛分布于中國、日本和韓國沿海。冬季低溫造成蛤仔存活率低的問題嚴(yán)重影響了北方蛤仔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，造成這種現(xiàn)象的原因之一就是南苗北養(yǎng)[7-9]。菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號”(以下簡寫為斑馬蛤2號)，是以遼寧省大連市石河菲律賓蛤仔野生群體為基礎(chǔ)群體，以殼色和生長速度為目標(biāo)性狀，采用群體選育技術(shù)，經(jīng)連續(xù)4代選育而成，由于斑馬蛤2號耐低溫，有望培育成適合在北方灘涂養(yǎng)殖的新品種[10]。本試驗(yàn)中，選取斑馬蛤2號群體、遼寧大連群體(以下簡稱為大連群體)和廣西北海群體(以下簡稱為北海群體)進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn)，比較3個不同群體菲律賓蛤仔急性低溫脅迫后的死亡率及其脂肪酸代謝相關(guān)基因(SCD、FAD和ACC)的表達(dá)變化，從mRNA水平初步揭示了脂肪酸代謝相關(guān)基因在菲律賓蛤仔應(yīng)對低溫脅迫過程中的重要作用，以期為深入研究斑馬蛤2號的耐低溫分子機(jī)制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用菲律賓蛤仔野生群體分別采自遼寧省大連市金州區(qū)、廣西壯族自治區(qū)北海市,斑馬蛤2號是遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心選育的蛤仔新品種，采自遼寧省盤錦市,不同群體蛤仔的采樣信息見表1。試驗(yàn)于2019年12月進(jìn)行，在正式試驗(yàn)前將所有蛤仔暫養(yǎng)3周，水溫為(12 ℃±1 ℃)，通過水循環(huán)系統(tǒng)設(shè)定溫度并保持穩(wěn)定。暫養(yǎng)期間，每天全量換水1次，每天投餌2次，持續(xù)充氧，試驗(yàn)正式開始前一天停止投餌。試驗(yàn)用海水取自大連市黑石礁海區(qū)，海水鹽度為 31±1，pH為8.1±0.2，經(jīng)沉淀、沙濾后貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同群體蛤仔采樣信息與規(guī)格Tab.1 Sampling information and size of Manila clam in different groups

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將試驗(yàn)蛤仔隨機(jī)分成2個試驗(yàn)組(-1、4 ℃)和1個對照組(12 ℃)，在每個溫度水槽中放置不同群體蛤仔各100枚，每個溫度下設(shè)置3個平行。其中，-1 ℃組水槽置于冰箱中，4 ℃組水槽置于水循環(huán)箱中，12 ℃組水槽置于室溫環(huán)境中，通過空調(diào)控溫保持溫度穩(wěn)定。試驗(yàn)期間不投喂，持續(xù)充氣，每兩天全量換水1次。為了評估急性低溫脅迫對基因的影響，分別在0、6、12、24、48、72 h時(shí)從每個群體中隨機(jī)選擇3枚蛤仔，取其鰓組織，放入液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取與引物設(shè)計(jì) 采用Trizol法提取不同溫度下3個群體蛤仔鰓組織的總RNA，并用20 μL DEPC水溶解。使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，使用NanoDrop紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度。

采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3個基因(硬脂酰輔酶A去飽和酶基因SCD、脂肪酸去飽和酶基因FAD和乙酰輔酶A羧化酶基因ACC)。熒光定量引物見表2。

表2 熒光定量引物Tab.2 Fluorescent quantitative primers

1.2.3 熒光定量PCR 采用qRT-PCR法檢測不同溫度下蛤仔鰓組織中溫度適應(yīng)性相關(guān)基因的時(shí)序表達(dá)。PCR 反應(yīng)體系(共20 μL)：cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，TBGreen 10 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性5 min;94 ℃下變性 30 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。通過觀察每個反應(yīng)后的熔解曲線確認(rèn)PCR 產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，采用Tukey HSD法和Duncan法進(jìn)行兩組和多組間的多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對不同群體蛤仔存活率的影響

從表3可見：在-1 ℃脅迫下，第1天時(shí)北海群體和斑馬蛤2號開始出現(xiàn)死亡，第2天時(shí)大連群體開始出現(xiàn)死亡個體，第7天時(shí)3個群體蛤仔累計(jì)死亡率均在20%以上，死亡率最高為北海群體；4、12 ℃下，3個蛤仔死亡率均在10%以下。試驗(yàn)結(jié)束(第9天)時(shí)，在-1 ℃脅迫下，北海群體的死亡率最高(51.85%)，而斑馬蛤2號的死亡率最低(25.94%)；4 ℃下，3組的死亡率相差不大，均在10%以下；12 ℃下，斑馬蛤2號的死亡率為0。

表3 不同群體在低溫脅迫下的累計(jì)死亡率Tab.3 Cumulative mortality of different populations exposed to low temperature stress

2.2 低溫脅迫下3個群體蛤仔鰓組織中SCD基因的表達(dá)變化

為探究低溫脅迫對不同群體蛤仔鰓組織SCD、FAD、ACC基因表達(dá)的影響，本研究中檢測了-1 ℃低溫脅迫下，3個群體在不同時(shí)間點(diǎn)鰓組織中3個基因mRNA的表達(dá)變化，以及不同溫度下脅迫72 h時(shí)基因的表達(dá)水平。

從圖1(a)可見：在-1 ℃低溫脅迫下，不同時(shí)間點(diǎn)3個蛤仔群體鰓中SCD基因相對表達(dá)量較脅迫前(0 h)均顯著升高(P<0.05);在12～72 h內(nèi)，斑馬蛤2號的SCD表達(dá)量顯著高于其他2個群體(P<0.05)。從圖1(b)可見：在4、-1 ℃低溫脅迫下，3個蛤仔群體鰓組織中SCD表達(dá)水平較12 ℃時(shí)顯著上升(P<0.05)；4 ℃下，3個蛤仔群體的SCD表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)；-1 ℃下，斑馬蛤2號SCD表達(dá)水平顯著高于其他2個群體(P<0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示同一時(shí)間下不同群體基因表達(dá)量間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05); *表示同一群體不同時(shí)間點(diǎn)(或不同低溫點(diǎn))基因表達(dá)量與0 h(或12 ℃)相比有顯著性差異(P<0.05),下同。The means with different letters in same time are significantly different in different population gene expression levels at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences; * indicates the significant difference in the expression levels in the same group at different time(or different low temperature) compared with 0 h (or 12 ℃)(P<0.05),et sequentia.圖1 低溫脅迫下3個群體蛤仔鰓組織中SCD mRNA的表達(dá)變化Fig.1 Changes in expression level of SCD mRNA in the gill of Manila clam in three populations exposed to low temperature stress

2.3 低溫脅迫下3個群體蛤仔鰓組織中FAD基因的表達(dá)變化

從圖2(a)可見：在-1 ℃低溫脅迫下，不同時(shí)間點(diǎn)3個蛤仔群體鰓中FAD基因相對表達(dá)量較0 h均顯著升高(P<0.05)；3個蛤仔群體FAD表達(dá)量總體上呈先升高后降低的趨勢;北海群體FAD表達(dá)量在 48 h時(shí)最高，是0 h的10.62倍，大連群體FAD表達(dá)量在12 h時(shí)最高，是0 h的14.22倍，斑馬蛤2號FAD表達(dá)量在24 h時(shí)最高，是0 h的16.18倍。從圖2(b)可見：在4、-1 ℃低溫脅迫下，3個蛤仔群體FAD表達(dá)水平較12 ℃時(shí)顯著上升(P<0.05);4 ℃下，北海群體FAD表達(dá)量顯著高于大連群體(P<0.05);-1 ℃下，斑馬蛤2號FAD表達(dá)量顯著高于其他群體(P<0.05)。

圖2 低溫脅迫下3個群體蛤仔鰓組織中FAD mRNA的表達(dá)變化Fig.2 Changes in expression level of FAD mRNA in the gill of Manila clam in three populations exposed to low temperature stress

2.4 低溫脅迫下3個群體蛤仔鰓組織中ACC基因的表達(dá)變化

從圖3(a)可見：3個蛤仔群體鰓中ACC基因表達(dá)量總體上呈先升高后降低的趨勢;在-1 ℃低溫脅迫下，與0 h相比，北海群體蛤仔ACC表達(dá)量在24、48 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)；大連群體蛤仔ACC表達(dá)量在12 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)；斑馬蛤2號ACC表達(dá)量在6～48 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)，且在6～24 h時(shí)顯著高于其他2個群體(P<0.05)。從圖3(b)可見：在-1 ℃低溫脅迫下，3個蛤仔群體ACC表達(dá)水平較12 ℃時(shí)無顯著性變化(P>0.05)，3個群體間ACC表達(dá)量也無顯著性差異(P>0.05);4 ℃下，北海群體和大連群體ACC表達(dá)水平較12 ℃時(shí)均顯著上升(P<0.05)，斑馬蛤2號的ACC表達(dá)水平則無明顯變化，且顯著低于其他2個群體(P<0.05)。

圖3 低溫脅迫下3個群體蛤仔鰓組織中ACC mRNA的表達(dá)變化Fig.3 Changes in expression level of ACC mRNA in the gill of Manila clam in three populations exposed to low temperature stress

3 討論

3.1 低溫對蛤仔脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

溫度能夠影響貝類生理代謝[11]、酶活性[12-13]和存活[14-17]。溫度不僅可以改變貝類體內(nèi)酶的活性，影響貝類代謝，還可以通過改變貝類能量收支從而影響貝類存活。當(dāng)溫度變化超出貝類生存范圍時(shí)，貝類生理代謝紊亂，細(xì)胞受到不可修復(fù)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致貝類死亡。超出其最適溫度范圍的溫度也會導(dǎo)致蛤仔死亡[18]。張永普等[19]和鄭懷平等[20]研究指出，貝類體內(nèi)的脂肪酸種類和含量受季節(jié)和水溫等變化的影響顯著，并且脂肪酸的種類和含量與貝類肉質(zhì)的肥滿度有著密切關(guān)系。

本研究表明，3個脂肪酸代謝相關(guān)基因在菲律賓蛤仔鰓組織中的表達(dá)與溫度顯著相關(guān)(P<0.05)，在12、4和-1 ℃下，隨著溫度的降低，SCD、FAD和ACC基因上調(diào)，表達(dá)量總體呈升高趨勢；在-1 ℃低溫脅迫下，斑馬蛤2號、大連群體和北海群體蛤仔鰓組織中SCD、FAD基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，斑馬蛤2號(6～48 h)、大連群體(12 h)和北海群體(24～48 h)蛤仔ACC基因分別在不同時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)，但3個群體蛤仔的3個脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)程度及時(shí)間點(diǎn)有所不同，其中，斑馬蛤2號的3個基因上調(diào)幅度最大，而低溫脅迫下的存活率試驗(yàn)表明，斑馬蛤2號的存活率和耐低溫能力明顯高于大連群體和北海群體，這表明，蛤仔的耐低溫能力可能與其SCD、FAD和ACC基因表達(dá)水平有關(guān)。楊東敏等[25]報(bào)道了越冬期后蛤仔不飽和脂肪酸含量顯著上升，初步證明蛤仔體內(nèi)脂肪酸組成及含量對其耐低溫有重要作用。由此推測，蛤仔脂肪酸代謝相關(guān)基因可能在其適應(yīng)低溫過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。

3.2 菲律賓蛤仔斑馬蛤2號新品種的耐寒機(jī)制

脂肪酸合成酶系是由Wakil等[26]在1957年提出的。貝類屬變溫動物，低溫會影響貝類各種生命活動，而脂肪酸在貝類的免疫應(yīng)答過程、溫度的適應(yīng)性、生長發(fā)育和繁殖等生理過程中均起著關(guān)鍵的作用，所以研究貝類在低溫脅迫下脂肪酸相關(guān)基因表達(dá)的變化，對于了解貝類的抗寒機(jī)制有重要的意義[27-29]。研究表明，扁玉螺Neveritadidyma與泥蚶Tegillarcagranosa軟體部脂肪酸種類和含量受水溫和季節(jié)影響[19-20]。Su等[30]研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入冬季時(shí)隨溫度降低，鮑n-3脂肪含量升高，飽和脂肪酸(SFA)含量下降，說明n-3脂肪酸對于維持細(xì)胞膜的流動性具有重要作用。楊東敏等[25]報(bào)道了蛤仔越冬期前后脂肪酸含量發(fā)生顯著變化，在蛤仔體內(nèi)共檢測出18種脂肪酸，其中，C18∶0、C20∶4n-6、C22∶5n-6、C22∶5n-3在越冬期后含量均顯著降低，C20∶5n-3(EPA)在越冬后期顯著高于越冬前。本研究中，通過對低溫下3個群體蛤仔鰓組織中FAD、ACC和SCDmRNA表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在 -1 ℃脅迫下，斑馬蛤2號的FAD(24、72 h)、SCD(12～72 h)和ACC(6～24 h)基因表達(dá)水平分別在不同時(shí)間點(diǎn)顯著高于其他2個群體。而在 -1 ℃低溫脅迫后，斑馬蛤2號的死亡率明顯低于大連群體和北海群體。由此推測，在低溫脅迫下，菲律賓蛤仔斑馬蛤2號可能通過提高FAD、SCD和ACC基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸及不飽和脂肪酸合成，改變細(xì)胞膜UFA與SFA比值，維持細(xì)胞膜正常流動，從而具有更強(qiáng)的低溫適應(yīng)能力[31-32]。斑馬蛤2號耐低溫能力強(qiáng)的原因可能與抗逆、免疫及代謝等多方面因素有關(guān)，脂肪酸合成與代謝可能是原因之一[1，33-34]。作者推測，脂肪酸合成代謝過程相關(guān)基因的表達(dá)水平可能影響生物體的脂肪酸組合及含量的變化，從而影響斑馬蛤2號的耐低溫能力，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本試驗(yàn)條件下，菲律賓蛤仔斑馬蛤2號存活率明顯高于大連群體和北海群體，脂肪酸代謝相關(guān)基因在菲律賓蛤仔應(yīng)對低溫脅迫過程中起重要作用。

4 結(jié)論

1)菲律賓蛤仔斑馬蛤2號對低溫的耐受能力強(qiáng)于大連群體和北海群體，說明斑馬蛤2號具有較強(qiáng)的耐寒能力，這在北方蛤仔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中具有較大的生產(chǎn)潛力和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

2)脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)是菲律賓蛤仔應(yīng)對低溫環(huán)境的重要生存策略。脂肪酸代謝相關(guān)基因在斑馬蛤2號中的高表達(dá)可能是斑馬蛤具有出色耐寒能力的原因之一，這也證明脂肪酸在貝類對溫度的適應(yīng)過程中起著重要作用。本試驗(yàn)中對3個菲律賓蛤仔群體低溫耐受能力的差異和分子機(jī)制的研究結(jié)果，對菲律賓蛤仔健康養(yǎng)殖和對貝類抗逆性相關(guān)研究具有參考意義。