李苗，金瀟儀，姜碩，孫萌，田野*

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034； 2.大連海洋大學(xué) 設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(大連海洋大學(xué))，遼寧 大連 116023)

極性是一個(gè)復(fù)雜的物理參數(shù)，溶劑極性大小取決于除分子間氫鍵作用和能夠使溶質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化的溶劑作用之外，溶劑分子和溶質(zhì)間所有可能的分子間相互作用[1-2]。在化學(xué)、化工領(lǐng)域，溶劑極性是推動(dòng)化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程的關(guān)鍵參數(shù)[3-6]。在生命科學(xué)領(lǐng)域，細(xì)胞極性變化與生理和病理過(guò)程密切相關(guān)[7]，如溶酶體極性能夠影響溶酶體膜流動(dòng)性和溶酶體內(nèi)酶促反應(yīng)等[8]。基于上述特性，有研究人員通過(guò)監(jiān)控秀麗隱桿線蟲(chóng)蟲(chóng)體極性變化或比較處于不同糖尿病階段小鼠肝臟組織極性的大小，進(jìn)而分析秀麗隱桿線蟲(chóng)或小鼠生理、病理的發(fā)生和發(fā)展情況[9-10]。魚(yú)的病變也必然引起病變部位細(xì)胞極性的變化，通過(guò)監(jiān)測(cè)魚(yú)體極性變化對(duì)其病變部位進(jìn)行定位和診斷，相比于傳統(tǒng)解剖方法具有檢測(cè)手段更加快速、準(zhǔn)確且不會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生傷害的優(yōu)點(diǎn)。因此，對(duì)溶劑或生物微環(huán)境進(jìn)行準(zhǔn)確的極性檢測(cè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

熒光檢測(cè)法是通過(guò)分析熒光探針熒光強(qiáng)度、熒光壽命、比例熒光或其他熒光參數(shù)的變化，對(duì)離子[11-12]、小分子[13-14]、生物大分子濃度[15]及生物微環(huán)境參數(shù)[16-18]進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法具有靈敏度高、特異性好、響應(yīng)迅速和技術(shù)簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[19-28]。其中，極性響應(yīng)型熒光探針通常由分子內(nèi)電子給體(如氨基)、共軛連接區(qū)和電子受體組成，被光激發(fā)后可產(chǎn)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular charge transfer，ICT)，能更好地對(duì)微環(huán)境極性變化產(chǎn)生響應(yīng)[2,29]。當(dāng)周?chē)h(huán)境極性發(fā)生變化時(shí)，探針?lè)肿踊鶓B(tài)、激發(fā)態(tài)與溶劑間產(chǎn)生偶極-偶極相互作用，熒光發(fā)射強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生顯著變化，即分子基態(tài)、激發(fā)態(tài)間產(chǎn)生π→π*躍遷時(shí)，熒光發(fā)射峰強(qiáng)度隨溶劑極性的增強(qiáng)而降低，而當(dāng)產(chǎn)生n→π*躍遷時(shí)，熒光發(fā)射強(qiáng)度則隨溶劑極性的增強(qiáng)而升高[30]。可見(jiàn)，構(gòu)建光激發(fā)后同時(shí)具有π→π*與n→π*的雙分子躍遷熒光探針，即極性比例熒光探針，有利于對(duì)微環(huán)境極性變化進(jìn)行準(zhǔn)確的熒光檢測(cè)[31]。目前，極性比例熒光探針的構(gòu)建尚無(wú)明確的理論依據(jù)，本文首次提出了極性比例熒光探針的構(gòu)建方法，為熒光探針準(zhǔn)確檢測(cè)極性提供了有效途徑。

本文中，以萘環(huán)為熒光團(tuán)，首先構(gòu)建具有電子推拉體系的熒光探針I(yè)A，再引入乙醇胺縮合形成含氮原子雜環(huán)，合成極性比例熒光探針I(yè)AN，通過(guò)測(cè)定熒光探針I(yè)A和IAN的吸收、熒光發(fā)射光譜，分析探針對(duì)溶劑極性的響應(yīng)性能，并將制備的探針I(yè)AN應(yīng)用于生物活體檢測(cè)，以期為準(zhǔn)確檢測(cè)生物微環(huán)境極性變化的比例熒光探針構(gòu)建提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：試驗(yàn)用雌性BALB/c小鼠(4～6周)購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(體質(zhì)量為16.0 g±2.0 g，6只)；珍珠龍膽石斑魚(yú)Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂購(gòu)于萊州明波水產(chǎn)有限公司(體質(zhì)量為120.0 g±5.0 g，10尾)，健康珍珠龍膽石斑魚(yú)5尾，患肝膽綜合癥珍珠龍膽石斑魚(yú)5尾。

動(dòng)物試驗(yàn)嚴(yán)格遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院出版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》(2011年)。動(dòng)物試驗(yàn)方案獲得了動(dòng)物倫理委員會(huì)大連理工大學(xué)研究倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)為2018-043)。

試劑：化學(xué)試劑乙酸銨、丙二腈、苊酮、胍基乙酸、乙醇胺等高純度試劑均購(gòu)于上海薩恩化學(xué)有限公司；分析純?cè)噭┘妆?、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯?,4-二氧六環(huán)等均購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。以上試劑未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步處理，直接應(yīng)用于反應(yīng)和測(cè)試。

儀器設(shè)備：核磁共振波譜儀(Bruker Avance II，瑞士布魯克公司)；LC/Q-TOF-MS質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；熒光分光光度計(jì)(Aglient Technologies Eclipse，美國(guó)安捷倫公司)；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Aglient Technologies Cary 60，美國(guó)安捷倫公司)；穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀(LP920，英國(guó)愛(ài)丁堡公司)；絕對(duì)光致發(fā)光量子產(chǎn)率儀(C11347，日本濱松公司)；單光子共聚焦激光掃描顯微鏡(FVl000，日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 熒光探針I(yè)A、IAN的制備路線 首先用乙酸銨和乙酸，在回流甲苯中催化丙二腈和原料苊酮I-1發(fā)生縮合反應(yīng)，生成中間體化合物I-2；通過(guò)滴加胍基乙酸催化中間體化合物I-2與N, N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛繼續(xù)產(chǎn)生縮合反應(yīng)，生成探針I(yè)A；攪拌狀態(tài)下，向含有IA的無(wú)水二氯甲烷溶液中滴加乙醇胺，反應(yīng)溶液逐漸變?yōu)榱脸壬⑽龀龀恋?，純化后獲得探針I(yè)AN。熒光探針I(yè)A和IAN的合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 熒光探針I(yè)A和IAN的合成路線Fig.1 Synthesis pathway of fluorescent probes IA and IAN

1.2.2 熒光探針I(yè)A、IAN吸收光譜及熒光發(fā)射光譜的測(cè)定 首先通過(guò)空白溶劑對(duì)紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀進(jìn)行校正；再將相同體積的探針母液(濃度為20 mmol/L)稀釋并置于含不同極性測(cè)試溶劑的石英皿中(3 mL)，混合均勻后制得測(cè)試樣本，并將含有測(cè)試樣本的石英皿置于紫外-可見(jiàn)光譜儀測(cè)試倉(cāng)中進(jìn)行探針吸收光譜掃描；最后通過(guò)熒光光譜儀對(duì)上述測(cè)試樣本進(jìn)行激發(fā)，獲得探針的熒光發(fā)射光譜，用熒光強(qiáng)度(I)表示。

Δf=(ε-1)/(2ε+1)-(n2-1)/(2n2+1),

(1)

εmix=faεa+fbεb，

(2)

(3)

其中：εa、na和fa分別為溶劑a的介電常數(shù)、折射率和在混合溶劑中的體積比；εb、nb和fb分別為溶劑b的介電常數(shù)、折射率和在混合溶劑中的體積比。

1.2.3 熒光探針I(yè)AN熒光量子產(chǎn)率及熒光壽命測(cè)定 首先在測(cè)試石英皿中加入空白溶劑，并用儀器自動(dòng)校正。再將探針加入測(cè)試樣品池中(終濃度為0.1 mmol/L)，通過(guò)量子產(chǎn)率儀測(cè)量樣品的透射光子數(shù)和熒光發(fā)射光子數(shù)。探針的熒光量子產(chǎn)率(Φf)計(jì)算公式為

Φf=Np,em/Np,abs=Np,em/(Np,all-Np,trans)。

(4)

其中：Np,all為用于激發(fā)探針?lè)肿拥娜抗庾訑?shù)；Np,em、Np,abs和Np,trans分別為探針?lè)肿拥陌l(fā)射、吸收和透射光子數(shù)。采用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測(cè)定探針熒光壽命(τ)。

1.2.4 Stokes’位移的計(jì)算及其與溶劑極性的關(guān)系

探針溶劑化變色效應(yīng)和溶劑化熒光變色效應(yīng)通過(guò)Lippert-Mataga公式計(jì)算得到[4]，即

(5)

其中：h為普朗克常數(shù)；c為真空中的光速；a為onsager腔半徑；Δf為溶劑極性；μe和μg分別為探針?lè)肿拥幕鶓B(tài)偶極和激發(fā)態(tài)偶極；ε0為真空介電常數(shù)。當(dāng)Δν和Δf可以被線性擬合時(shí)，表明探針與溶劑之間的相互作用為一般溶劑化效應(yīng)；而當(dāng)Δν和Δf線性擬合的斜率不同時(shí)，表明探針基態(tài)、激發(fā)態(tài)偶極矩差值(μe-μg)發(fā)生變化。

探針?lè)肿釉谔囟ㄈ軇┲械腟tokes’位移(Δν，cm-1)計(jì)算公式為

Δν=νabs-νem=(1/λabs-1/λem)×2π。

(6)

其中：λabs和λem分別為探針?lè)肿拥奈辗搴桶l(fā)射峰波長(zhǎng)。

1.2.5 熒光探針I(yè)AN對(duì)活體生物的檢測(cè) 將6只BALB/c雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。在小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1傳代時(shí)，將培養(yǎng)瓶中的4T1細(xì)胞消化、收集、離心后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，以1×108cells/mL的密度將細(xì)胞重新懸浮于PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)中。構(gòu)建腫瘤模型時(shí)，在每只BALB/c雌鼠左端側(cè)翼區(qū)皮下注射含上述4T1細(xì)胞的PBS懸浮液100 μL。腫瘤小鼠模型構(gòu)建成功后，將雌性BALB/c小鼠的心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺和腫瘤組織取出，在體積分?jǐn)?shù)為10%的中性緩沖福爾馬林中固定24 h后，包埋在石蠟中，通過(guò)冷凍切片機(jī)切成厚度為5 μm的切片。脫蠟后，用IAN(10 μmol/L,孵育1.5 h)對(duì)不同組織樣本進(jìn)行染色，使用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。

將健康和患肝膽綜合癥的珍珠龍膽石斑魚(yú)解剖取出肝臟，固定在體積分?jǐn)?shù)為10%的中性緩沖福爾馬林溶液中，選出具有代表性的肝臟組織，切下相同位置和大小的組織，用石蠟包埋并切成厚度為5 μm的切片。脫蠟后，用IAN(10 μmol/L，孵育1.5 h)對(duì)不同組織樣品進(jìn)行染色，使用共焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行熒光觀察,肝臟組織切片的平均熒光強(qiáng)度比值(I474 nm/I552 nm)可選取多處ROI的熒光比例同時(shí)進(jìn)行定量分析獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光探針I(yè)A和IAN的合成

2.1.1 中間體化合物I-2的合成 在無(wú)水甲苯中，通過(guò)滴加乙酸銨(0.55 g，濃度為7.1 mmol/L)和乙酸(2.25 mL，39.2 mmol/L)，催化丙二腈(2.36 g，35.7 mmol/L)和苊酮I-1(6.00 g，35.7 mmol/L)在加熱回流狀態(tài)下進(jìn)行縮合反應(yīng)。反應(yīng)2 h后，將反應(yīng)溶液冷卻并伴有固體析出，再將析出的固體產(chǎn)物過(guò)濾收集后，用乙醇、水和正己烷等溶劑先后進(jìn)行潤(rùn)洗，真空干燥得到橙黃色固體，即中間體化合物I-2(產(chǎn)量7.96 g，產(chǎn)率77%)。

化合物核磁氫譜數(shù)據(jù)：1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ為8.54 (d,J=7.4 Hz,1H)、8.12 (d,J=8.1 Hz, 1H)、7.83 (d,J=8.3 Hz,1H)、7.76 (t,J=7.8 Hz, 1H)、7.67～7.62(m, 1H)、7.51 (d,J=6.9 Hz,1H)、4.43 (s,2H)。

2.1.2 熒光探針I(yè)A的合成 通過(guò)滴加胍基乙酸(0.029 g，0.25 mmol/L)，催化中間體化合物I-2(0.540 g，2.5 mmol/L)與N, N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛(DMF-DMA，0.357 g，3.0 mmol/L)的縮合反應(yīng)。反應(yīng)溶液在100 ℃條件下，持續(xù)攪拌0.5 h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶劑蒸干，并將剩余物通過(guò)柱層析方法進(jìn)行分離，提純目標(biāo)化合物。硅膠柱層析分離提純化合物IA所用洗脫液為二氯甲烷。純化后的目標(biāo)化合物經(jīng)真空干燥后為深栗色固體，即產(chǎn)物IA(產(chǎn)量0.676 g，產(chǎn)率接近100%)。

化合物核磁氫譜數(shù)據(jù)：1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ為8.65 (d,J=7.4 Hz,1H)、8.57 (s, 1H)、7.96(d,J=8.1 Hz,1H)、7.67～7.59(m,2H)、7.52～7.47(m, 1H)、7.28(s,1H)、3.46(s,6H)。

2.1.3 熒光探針I(yè)AN的合成 向含有化合物IA(0.267 g，0.98 mmol/L)的無(wú)水二氯甲烷(5 mL)溶液中，逐滴加入乙醇胺(1.795 g，29.48 mmol/L，滴加時(shí)間為10 min)。在30 ℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)溶液4 h，反應(yīng)溶液由淺紅色逐漸變?yōu)榱脸壬?，并伴有橙黃色固體沉淀析出。抽濾后，用乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷等溶劑先后對(duì)所得濾餅進(jìn)行潤(rùn)洗，真空干燥后得到橙黃色固體化合物，即終產(chǎn)物IAN(產(chǎn)量0.197 g，產(chǎn)率70%)。

化合物核磁氫譜數(shù)據(jù)：1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)，δ為8.36 (s，1H)、8.19 (d，J=7.1 Hz，1H)、8.12 (d，J=8.2 Hz，1H)、7.79 (d，J=15.7，8.1 Hz，2H)、7.72 (d，J=6.9 Hz，1H)、7.67～7.60 (m，1H)、4.10 (t，J=5.1 Hz，2H)、3.78 (t，J=5.1 Hz，2H)。

13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)，δ為151.08、138.75、135.17、134.18、132.75、131.20、130.55、130.05、128.85、128.30、124.06、123.33、117.50、116.05、113.64、92.09、57.45、54.07。

HRMS(ESI，m/z)，化合物IAN的[M+H]+(C18H14N3O+)，測(cè)定值為288.113 1(理論值為288.113 1)。

2.2 溶液中熒光探針I(yè)A光譜的極性響應(yīng)性能

通過(guò)混合不同體積分?jǐn)?shù)的水和1,4-二氧六環(huán)，構(gòu)建極性Δf=0.124～0.301的測(cè)試體系,在此體系中，探針I(yè)A的吸收峰位于540 nm，并在610 nm處出現(xiàn)了相應(yīng)的熒光發(fā)射峰(圖2)。結(jié)合探針I(yè)A的熒光強(qiáng)度I610 nm與測(cè)試溶液極性Δf之間的Boltzmann擬合關(guān)系發(fā)現(xiàn)，探針I(yè)A的吸收峰位置和吸光度不隨極性變化而變化，但其在λ=610 nm處，熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度隨著極性的增強(qiáng)而升高(圖3)。

圖2 探針I(yè)A在不同體積比的水和1,4-二氧六環(huán)混合溶劑中的吸收光譜及熒光發(fā)射光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra and fluorescence emission spectra of fluorescent probe IA in the mixtures of H2O and 1,4-dioxane with different volume ratios

圖3 探針I(yè)A的I610 nm與溶劑Δf的Boltzmann擬合關(guān)系Fig.3 Boltzmann fit of I610 nm versus Δf for fluorescent probe IA

2.3 溶液中熒光探針I(yè)AN光譜的極性響應(yīng)性能

在不同極性測(cè)試體系中，對(duì)探針I(yè)AN進(jìn)行光譜測(cè)試發(fā)現(xiàn)，IAN的吸光度不隨極性的變化而變化。但與探針I(yè)A不同的是，隨著極性的增大，探針I(yè)AN吸收峰從480 nm明顯藍(lán)移到420 nm(圖4)。與此同時(shí)，IAN的熒光發(fā)射峰也從552 nm明顯藍(lán)移到474 nm(圖5(a))。通過(guò)計(jì)算不同極性條件下探針在λ=474 nm和λ=552 nm處熒光強(qiáng)度的比值(I474 nm/I552 nm)可知，在Δf=0.124～0.316時(shí),探針I(yè)474 nm/I552 nm值隨著測(cè)試溶液極性的升高而增加(圖5(b))。

圖4 探針I(yè)AN在不同體積比的水和1, 4-二氧六環(huán)混合溶劑中的吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of fluorescent probe IAN in the mixtures of H2O and 1,4-dioxane with different volume ratios

圖5 探針I(yè)AN在不同體積比的水和1,4-二氧六環(huán)混合溶劑中的熒光發(fā)射光譜及I474 nm/I552 nm與Δf的Boltzmann擬合Fig.5 Fluorescence emission spectra and Boltzmann fit of I474 nm/I552 nm versus Δf of fluorescent probe IAN in the mixtures of H2O and 1,4-dioxane with different volume ratios

2.4 不同極性溶劑對(duì)探針I(yè)AN光物理參數(shù)的影響

為分析探針I(yè)AN產(chǎn)生雙吸收和雙熒光發(fā)射峰的原因，對(duì)熒光探針I(yè)AN光物理參數(shù)隨極性變化的規(guī)律進(jìn)行測(cè)定。在單一溶劑中，隨著測(cè)試溶劑極性的增強(qiáng)，探針I(yè)AN的吸收峰位于480 nm左右；當(dāng)溶劑極性繼續(xù)增加，即Δf>0.260時(shí)，探針I(yè)AN的吸收峰波長(zhǎng)藍(lán)移到420 nm附近，同時(shí)熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)也從550 nm附近藍(lán)移到480 nm附近(表1)。

表1 探針I(yè)AN在單一極性溶劑中的吸收和熒光發(fā)射波長(zhǎng)Tab.1 Absorption and fluorescence emission wavelengths of fluorescent probe IAN in single solvents

將探針I(yè)AN溶解在水和1，4-二氧六環(huán)兩相溶劑的混合體系中，當(dāng)溶劑極性較低(Δf<0.260)時(shí)，探針I(yè)AN的吸收峰、熒光發(fā)射峰分別位于480、552 nm；隨著兩相混合溶劑中水含量的增加，溶劑極性不斷增強(qiáng)，探針位于552 nm發(fā)射峰的熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命不斷降低；當(dāng)溶劑極性較高(Δf≥0.260)時(shí)，探針I(yè)AN的吸收峰、熒光發(fā)射峰分別藍(lán)移到420、474 nm；隨著溶劑極性的上升，探針的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，同時(shí)伴有探針熒光量子產(chǎn)率Φf和熒光壽命τ的增加(表2)。

表2 熒光探針I(yè)AN在不同極性混合溶劑中的光物理數(shù)據(jù)Tab.2 Photophysical data of fluorescent probe IAN in mixed solvents with different polarity

2.5 探針I(yè)AN溶劑極性特異響應(yīng)特性的判定

從圖6可見(jiàn)：當(dāng)單相溶劑(或兩相混合溶劑)極性Δf為0.000～0.250時(shí)，探針I(yè)AN的Stokes’位移與測(cè)試體系極性間的關(guān)系可通過(guò)線性函數(shù)Linear fit 1進(jìn)行擬合；當(dāng)單相溶劑(或兩相混合溶劑)極性Δf為0.250～0.350時(shí)，探針I(yè)AN的Stokes’位移與測(cè)試體系極性間的關(guān)系可通過(guò)線性函數(shù)Linear fit 2進(jìn)行擬合?？梢?jiàn),探針I(yè)AN的Stokes’位移在測(cè)試體系極性Δf處于0.260左右時(shí)產(chǎn)生明顯的變化，此結(jié)果與探針I(yè)AN吸收峰、熒光發(fā)射峰在Δf處于0.260附近時(shí)產(chǎn)生明顯移動(dòng)的結(jié)果一致。

圖6 探針I(yè)AN在不同極性溶劑中的Stokes’位移與溶劑極性的線性擬合Fig.6 Linear fit of Stokes’ shift versus the solution polarity for fluorescent probe IAN

探針I(yè)AN的Δf和Δν數(shù)據(jù)點(diǎn)可以被線性擬合，表明溶劑與溶質(zhì)之間的相互作用為一般溶劑化效應(yīng)，不存在如分子間氫鍵作用等特殊溶劑化效應(yīng)。

而由Linear fit 1與Linear fit 2的斜率不同,可以推測(cè)出：當(dāng)測(cè)試體系極性Δf在0.260附近時(shí)，探針I(yè)AN分子基態(tài)、激發(fā)態(tài)偶極矩差值(μe-μg)發(fā)生改變，再次證明了探針?lè)肿覫AN隨著溶劑極性的變化存在兩種分子躍遷路徑。

2.6 探針I(yè)AN對(duì)小鼠和珍珠龍膽石斑魚(yú)組織檢測(cè)的應(yīng)用

應(yīng)用共聚焦顯微鏡對(duì)小鼠各組織染色切片進(jìn)行3D熒光成像(λem=460～500 nm)，結(jié)果顯示，小鼠的心臟和腎臟組織切片熒光最強(qiáng)，肝臟組織切片熒光強(qiáng)度次之，脾臟和肺部組織切片熒光強(qiáng)度稍弱，而腫瘤切片熒光強(qiáng)度最弱(圖7)。

圖7 熒光探針I(yè)AN在小鼠不同組織中的3D熒光成像圖Fig.7 3D fluorescence images of fluorescent probe IAN in different tissues of mice

利用探針I(yè)AN對(duì)健康和患有肝膽綜合癥的珍珠龍膽石斑魚(yú)肝組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，病變肝組織的熒光強(qiáng)度比值極顯著低于健康肝組織(P<0.01)(圖8)，這表明IAN可有效地識(shí)別健康和病變組織，在魚(yú)病的診斷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

**表示有極顯著性差異(P<0.01)。 ** means very significant difference(P<0.01).圖8 熒光探針I(yè)AN對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)肝組織的檢測(cè)Fig.8 Detection of hybrid grouper liver with fluorescent probe IAN

3 討論

3.1 極性響應(yīng)型熒光探針的構(gòu)建方法

細(xì)胞極性是很多細(xì)胞重要活動(dòng)的基礎(chǔ)，也是復(fù)雜生物組織、器官形成和功能的基礎(chǔ)[32]。雖然在化學(xué)、化工領(lǐng)域，針對(duì)極性的研究已經(jīng)十分透徹，但由于生物微環(huán)境精細(xì)且復(fù)雜，活細(xì)胞中極性的直接測(cè)定較為困難，而極性響應(yīng)型熒光探針的出現(xiàn)，恰好解決了這一難題。通常來(lái)說(shuō)，極性響應(yīng)型熒光探針一般由共軛連接體和位于兩端的推電子和拉電子基團(tuán)共同組成，有利于電子推拉體系形成。Xiao等[9]在2016年報(bào)道了第一例位于近紅外區(qū)(NIR)的超靈敏極性熒光探針MCY-BF2，該探針由具有親脂性側(cè)鏈的花菁和雙氟硼酸酯組成，其中叔胺和二氟硼酸酯基團(tuán)分別作為給電子基團(tuán)和吸電子基團(tuán)，形成強(qiáng)烈的電子推-拉體系，能夠產(chǎn)生響應(yīng)極性變化的單熒光發(fā)射峰。2017年，Jiang等[33]開(kāi)發(fā)了雙光子溶酶體極性探針Lyso-OC，通過(guò)檢測(cè)自噬過(guò)程中Lyso-OC熒光強(qiáng)度的變化，可對(duì)自噬小體形成后溶酶體的極性變化進(jìn)行監(jiān)控。然而，由于細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)熒光探針濃度、流體光學(xué)特性和實(shí)驗(yàn)儀器等參數(shù)波動(dòng)的影響，單發(fā)射熒光探針雖然可監(jiān)控極性變化，但無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算生物微環(huán)境極性的確切數(shù)值。因此，亟待開(kāi)展極性響應(yīng)型比例熒光探針的設(shè)計(jì)、合成和構(gòu)建方法的探索。

本研究中，根據(jù)探針I(yè)A熒光強(qiáng)度隨極性增強(qiáng)而升高的變化規(guī)律可知，探針I(yè)A被光激發(fā)后主要產(chǎn)生n→π*躍遷。不同于探針I(yè)A只產(chǎn)生n→π*躍遷，探針I(yè)AN分子將氨基縮合成環(huán)后，增強(qiáng)了氮原子上的孤對(duì)電子與π體系的共軛能力，激活的探針I(yè)AN產(chǎn)生雙吸收峰(420 nm和480 nm)和雙熒光發(fā)射峰(474 nm和552 nm)。由于π→π*分子躍遷產(chǎn)生熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度隨極性升高而降低，n→π*分子躍遷熒光發(fā)射強(qiáng)度隨極性升高而增強(qiáng)，探針I(yè)AN能夠同時(shí)產(chǎn)生n→π*和π→π*分子躍遷，故IAN可作為比例熒光探針，對(duì)極性進(jìn)行靈敏且準(zhǔn)確地檢測(cè)。此外，應(yīng)用本研究中提出的引入氮原子進(jìn)行雜環(huán)縮合進(jìn)而構(gòu)建極性響應(yīng)型比例熒光探針的方法，可靈活引入嗎啉、三苯基膦等細(xì)胞器定位基團(tuán)。根據(jù)上述方法，不僅可以構(gòu)建避免探針濃度、檢測(cè)環(huán)境及底物和光漂白等因素影響的極性響應(yīng)型比例熒光探針，還可以對(duì)特定細(xì)胞器部位進(jìn)行精準(zhǔn)定位，簡(jiǎn)便、高效且準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞器極性進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 熒光探針I(yè)AN對(duì)細(xì)胞及生物組織極性的檢測(cè)

近幾年，大量熒光探針被應(yīng)用于生物微環(huán)境內(nèi)極性的檢測(cè)，無(wú)論探針性能還是其生物應(yīng)用，都取得了重大進(jìn)展。目前，許多極性熒光探針檢測(cè)范圍較窄，只實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞器層級(jí)的極性檢測(cè)，難以對(duì)復(fù)雜生理、病理過(guò)程中極性的變化進(jìn)行研究。2015年，Jiang等[34]開(kāi)發(fā)了一例比例型熒光傳感器BOB，用于線粒體極性的檢測(cè)。該探針通過(guò)對(duì)正常細(xì)胞與癌細(xì)胞進(jìn)行比例熒光成像，揭示了癌細(xì)胞的線粒體極性比正常細(xì)胞低這一病理現(xiàn)象。此外，Li等[35]也報(bào)道了一種羥基部花菁熒光探針HXPI-P，用于檢測(cè)線粒體極性變化，通過(guò)進(jìn)行HXPI-P比例熒光成像，可以監(jiān)測(cè)到饑餓或雷帕霉素誘導(dǎo)線粒體自噬產(chǎn)生時(shí)線粒體極性減小的現(xiàn)象。本研究中，IA作為熒光探針，在Δf=0.124～0.301范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度對(duì)極性變化產(chǎn)生響應(yīng)；而隨著極性的增大，探針I(yè)AN吸收峰從480 nm(Δf=0.124～0.253)藍(lán)移到420 nm(Δf=0.263～0.316)，其熒光發(fā)射峰也從552 nm明顯藍(lán)移到474 nm。通過(guò)對(duì)探針I(yè)AN熒光強(qiáng)度比值I474 nm/I552 nm與溶液極性Δf進(jìn)行Boltzmann擬合發(fā)現(xiàn)，在Δf=0.124～0.316范圍內(nèi)，I474 nm/I552 nm值隨著極性的升高而增加。因此，探針I(yè)AN能夠作為比例熒光探針，對(duì)極性變化進(jìn)行靈敏且范圍廣的檢測(cè)。鑒于上述特性，應(yīng)用IAN可以對(duì)復(fù)雜生理、病理過(guò)程中極性的變化進(jìn)行監(jiān)控。本研究中，根據(jù)對(duì)小鼠組織的3D熒光成像結(jié)果和探針I(yè)AN在λem=480 nm處熒光強(qiáng)度隨極性變化規(guī)律可知，小鼠心臟和腎臟組織極性最強(qiáng)，肝臟、脾臟和肺部組織極性較弱，小鼠腫瘤組織極性最低。考慮到水是極性物質(zhì)，因此，推測(cè)上述結(jié)果的產(chǎn)生是由于各器官組織含水量不同所引起的。同時(shí)，結(jié)合探針I(yè)AN熒光強(qiáng)度比值I474 nm/I552 nm與溶液極性大小之間的Boltzmann函數(shù)關(guān)系，對(duì)比健康和肝膽綜合癥病變的珍珠龍膽石斑魚(yú)肝組織I474 nm/I552 nm的比例熒光成像結(jié)果可知，石斑魚(yú)病變肝組織的比例熒光強(qiáng)度極顯著低于正常肝組織。這表明，IAN可有效地識(shí)別健康和病變組織，在魚(yú)病的診斷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

綜上，本研究中合成的探針I(yè)AN，不僅可以靈敏響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)極性環(huán)境的變化，進(jìn)行準(zhǔn)確便捷地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，還可以探究生理、病理過(guò)程中生物組織極性的變化，期望可為日后動(dòng)物疾病的診斷與治療提供有效指導(dǎo)。

4 結(jié)論

1)本研究中，設(shè)計(jì)合成了以萘環(huán)為主體的極性熒光探針I(yè)A和IAN。其中，探針I(yè)A產(chǎn)生單一吸收峰，并具有單熒光發(fā)射峰，且探針I(yè)A熒光強(qiáng)度隨著溶液極性升高而增強(qiáng)，而探針I(yè)AN不但產(chǎn)生雙吸收、雙熒光發(fā)射峰，且可以對(duì)溶液極性變化產(chǎn)生靈敏的比例熒光響應(yīng)。

2)本研究中，引入氮原子進(jìn)行雜環(huán)縮合進(jìn)而構(gòu)建極性響應(yīng)型比例熒光探針的方法，不但可以構(gòu)建避免探針濃度、檢測(cè)環(huán)境、底物和光漂白等因素影響的極性響應(yīng)型比例熒光探針，還可以對(duì)特定細(xì)胞器部位進(jìn)行精準(zhǔn)定位，簡(jiǎn)便、高效且準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞器極性進(jìn)行檢測(cè)。