張文濤，周玲梅，黃宏海，鮑慧慧，毛德文，田慧#，劉舒凌（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，南寧 5000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 5000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科，南寧 500）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）亦稱膝關(guān)節(jié)退行性骨關(guān)節(jié)病，可引起關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、紅腫、功能障礙等[1]。隨著我國(guó)人口老齡化，KOA的發(fā)生率與日俱增，不僅給患者造成機(jī)體功能障礙及生理性疼痛，同時(shí)還導(dǎo)致其心理負(fù)擔(dān)與經(jīng)濟(jì)壓力。西醫(yī)對(duì)于KOA的治療以手術(shù)[2]和非甾體類抗炎藥[3]為主。中醫(yī)將KOA納入“骨痹”“膝痹”范疇，辨證分析其病因?yàn)楦文I虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)、風(fēng)寒濕邪乘虛內(nèi)侵[4]。中藥及其復(fù)方制劑在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，無論是外用還是內(nèi)服，對(duì)KOA的治療都有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。十一方藥酒（以下簡(jiǎn)稱“SYF”）作為廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院特色院內(nèi)制劑，由乳香、沒藥、紅花、自然銅（鍛）、續(xù)斷、龍血竭、三七等中藥組成，具有舒筋活絡(luò)、消腫散瘀、接骨止痛的功效，臨床上對(duì)于軟組織及骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病的治療均表現(xiàn)出顯著效果[5-8]。SYF的傳統(tǒng)制備方法主要為冷浸法，此法對(duì)藥材的提取時(shí)間及有效成分提取有一定的局限性。本課題組前期采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選滲漉工藝后制備獲得SYF[9]。為進(jìn)一步確定優(yōu)化工藝制備的SYF治療KOA的作用，本實(shí)驗(yàn)以木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的KOA兔為模型，觀察SYF對(duì)其保護(hù)作用，并揭示SYF作用機(jī)制與Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/細(xì)胞核因子（nuclear factor кB，NF-кB）信號(hào)通路的相關(guān)性，旨在為SYF臨床使用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有SQP型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，TGL-20M型高速低溫離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），PH-030A型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），Infinite M200pro型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），DMIRB型倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司），Shandon Histocentre 3型組織包埋機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），PowerPac型通用電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），UVP Chem Studio 815型多功能分子成像儀（德國(guó)Analytik Jena公司），Light-Cycler96型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR）儀（美國(guó)Roche公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

SFY（批號(hào)20200302，生藥量193 mg/mL）由本課題組經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選滲漉工藝制備[9]。木瓜蛋白酶（批號(hào)1014k025）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；L-半胱氨酸（批號(hào)BCCC0025）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；雙氯芬酸二乙胺乳膠劑[國(guó)藥準(zhǔn)字H19990291，批號(hào)4B5U，規(guī)格20 g∶0.2 g（以C14H10Cl2NNaO2計(jì)）]購(gòu)于北京諾華制藥有限公司；白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號(hào)均為202108）均購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、DNA上樣緩沖液、超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)分別為120320210705、121520210524、111919200716）均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)分別為10013030、20000216、20000217）均購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；兔抗TLR4多克隆抗體、兔抗MyD88單克隆抗體、兔抗NF-κB p65單克隆抗體、兔抗磷酸化NF-κB p65[anti-phospho NF-κB p65（S536），p-NF-κB p65]單克隆抗體（批號(hào)分別為GR3407535-1、GR3356289-13、GR325776-6、GR3381591-6）均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；RNA提取試劑盒（批號(hào)0000484334）購(gòu)于上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒（批號(hào)01127783）購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；PowerUP SYBR Green Master Mix試劑盒（批號(hào)01090300）購(gòu)于美國(guó) Applied Biosystems公司；β-actin、TLR4、MyD88、NF-κB p65基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)、合成；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為CV級(jí)新西蘭兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄兼用，購(gòu)自廣西廣得生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（桂）2017-0001。動(dòng)物購(gòu)入后先在廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核，符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定，審查證書編號(hào)為DW20191008-50。

2 方法

2.1 分組與造模

本實(shí)驗(yàn)造模方法參考文獻(xiàn)[10]，取健康的新西蘭兔35只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分成空白組、模型組、陽(yáng)性組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑200 mg/kg）、SYF高劑量組（386 mg/kg）、SYF低劑量組（97 mg/kg），各組7只（均為雄性4只、雌性3只），陽(yáng)性組給藥劑量參考臨床使用劑量，SYF高劑量組、SYF低劑量組給藥劑量參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)前先將兔的右后肢膝關(guān)節(jié)部位毛發(fā)剔除。實(shí)驗(yàn)第1天，將兔仰臥位固定于兔臺(tái)上，右后肢膝關(guān)節(jié)微屈，露出皮膚并進(jìn)行消毒，用1 mL注射器由髕骨外側(cè)下方斜上刺入關(guān)節(jié)腔，以進(jìn)針順暢、出現(xiàn)落空感、推液無阻力為要點(diǎn)，注射木瓜蛋白酶混合液（含2%木瓜蛋白酶與0.03 mol/L L-半胱氨酸）0.5 mL，空白組兔注射等體積生理鹽水，注射完后伸屈膝關(guān)節(jié)20次，以便木瓜蛋白酶混合液更均勻分布于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并于第4、7天重復(fù)注射。每天驅(qū)趕兔自由活動(dòng)20 min，第14天后兔右后肢膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹，并有屈伸功能障礙，即KOA模型建立成功。

2.2 給藥與取材

第15天開始，在各組兔的右后肢膝關(guān)節(jié)處涂抹給藥，空白組用棉簽擦拭生理鹽水，模型組用棉簽擦拭空白基質(zhì)白酒，陽(yáng)性組按200 mg/kg給藥劑量用棉簽將雙氯芬酸二乙胺乳膠劑涂抹于兔右后肢膝關(guān)節(jié)處，SYF高、低劑量組分別按2.0、0.5 mL/kg給藥劑量吸取SYF并均勻涂抹于兔右后肢膝關(guān)節(jié)處，再用棉簽涂抹1～2 min，促進(jìn)藥物吸收。每天給藥2次，連續(xù)給藥20 d。實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組兔的精神狀態(tài)、進(jìn)食量、攝水量及右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹情況等變化。末次給藥后第2天上午向各組兔腹腔注射20%烏拉坦（注射量為4.5 mL/kg）進(jìn)行麻醉，剪開右后肢膝關(guān)節(jié)，剪取部分滑膜組織，置于-80℃冰箱低溫保存，用于炎癥因子水平、相關(guān)基因及蛋白的測(cè)定；另取部分滑膜組織用10%多聚甲醛溶液固定，制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片。

2.3 兔右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹情況及關(guān)節(jié)腔病理觀察

分別在實(shí)驗(yàn)第0、8、14、35天，用游標(biāo)卡尺測(cè)量兔左右后肢膝關(guān)節(jié)直徑，計(jì)算右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹度：腫脹度（cm）＝右后肢膝關(guān)節(jié)直徑-左后肢膝關(guān)節(jié)直徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，肉眼觀察右后肢膝關(guān)節(jié)腔的關(guān)節(jié)液、脂肪墊、關(guān)節(jié)軟骨、滑膜等組織的病理?yè)p傷情況。

2.4 滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2水平的檢測(cè)

采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。稱取“2.2”項(xiàng)下滑膜組織0.2 g，用剪刀剪碎，加入生理鹽水1.8 mL，用玻璃勻漿器在冰水浴中低溫勻漿，將制備好的勻漿液以3 000 r/min離心10 min，收集上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定IL-1β、TNF-α、PGE2水平。

2.5 滑膜組織病理學(xué)觀察

采用HE染色法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下10%多聚甲醛溶液固定好的滑膜組織，依次用50%、70%、80%、95%乙醇以及無水乙醇脫水，二甲苯透明后浸蠟數(shù)小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色后，用倒置顯微鏡對(duì)滑膜組織病理情況進(jìn)行觀察并拍照。

2.6 滑膜組織中TLR4、MyD88、NF- кB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Q-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。隨機(jī)稱取“2.2”項(xiàng)下各組中3只兔的滑膜組織0.02 g，加入RNA裂解液300 μL，在冰浴環(huán)境中充分勻漿裂解，所得裂解液按總RNA提取試劑盒說明書中操作方法進(jìn)一步提取RNA；測(cè)定RNA濃度后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，質(zhì)量濃度為10 ng/μL，按PowerUP SYBR Green Master Mix試劑盒說明書中操作方法制備反應(yīng)體系，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在Q-PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：50℃尿嘧啶-DNA糖基化酶激活2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min，40個(gè)循環(huán)。Q-PCR結(jié)果以2-ΔΔCt法計(jì)算各目標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。各基因引物信息見表1。

表1 TLR4等基因引物信息

2.7 滑膜組織中 TLR4、MyD88、NF- кB p65、p-NF- кB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。隨機(jī)稱取“2.2”項(xiàng)下各組中3只兔的滑膜組織0.02 g，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液0.5 mL，用玻璃勻漿器在冰水浴中充分勻漿裂解；裂解液用離心機(jī)在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，上清液用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度；調(diào)整濃度后與蛋白上樣緩沖液（5×）混勻，使蛋白終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，加熱使蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，每孔蛋白上樣體積為20 μL，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為110 V；電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電壓為100 V，持續(xù)1 h；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜用封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液）室溫封閉2 h，TBST緩沖液清洗3次，每次5 min。將 PVDF 膜分別加入 GAPDH、TLR4、MyD88、NF-кB p65、p-NF-кBp65一抗（稀釋比例分別為1∶20000、1∶1000、1∶1 000、1∶3 000、1∶1 000），4 ℃孵育過夜；取出PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次后，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶6 000），室溫孵育1 h后，取出PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次。加入超敏化學(xué)發(fā)光試劑，用多功能分子成像儀掃描成像，利用Image J v1.8.0軟件對(duì)圖片條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值之比作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊）或Dunnett’st檢驗(yàn)（方差不齊）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 一般行為學(xué)觀察結(jié)果

空白組兔在飼養(yǎng)過程中，精神狀態(tài)良好，進(jìn)食及飲水量正常，行動(dòng)自如，無異常狀態(tài)；模型組兔在造模后，精神漸顯萎靡，進(jìn)食及飲水量均減少，不喜活動(dòng)，活動(dòng)量明顯減少；陽(yáng)性組和SYF高、低劑量組兔較模型組兔的精神狀態(tài)、進(jìn)食及飲水量均有改善。

3.2 兔右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹情況及關(guān)節(jié)腔病理觀察結(jié)果

除空白組外，其余各組兔在造模1周后，關(guān)節(jié)腫脹明顯，伴有屈伸功能障礙，在行走過程中有意識(shí)避免患肢用力支撐，可見跛行。第8天和第14天，與空白組比較，模型組、陽(yáng)性組和SYF高、低劑量組兔右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著升高（P＜0.05）。第35天，與模型組比較，陽(yáng)性組和SYF高、低劑量組兔右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著降低（P＜0.05），屈伸及行走等活動(dòng)狀態(tài)得到改善。兔右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 各組兔右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹度的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝7）

由右后肢膝關(guān)節(jié)腔解剖圖（圖2）可見，空白組兔右后肢膝關(guān)節(jié)液透明，滑膜正常，無水腫及糜爛，關(guān)節(jié)軟骨光滑無損傷，脂肪墊完整無損傷。模型組兔關(guān)節(jié)液增多且黃濁，部分脂肪墊糜爛伴黃色膿狀，滑膜前段水腫充血帶有炎性損傷，軟骨表面光澤暗淡，有潰瘍面裂隙，出現(xiàn)磨損與降解。陽(yáng)性組和SYF高、低劑量組兔右后肢膝關(guān)節(jié)的相應(yīng)部位較模型組均有不同程度改善。

圖2 各組兔右后肢膝關(guān)節(jié)腔解剖圖

3.3 滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2水平的檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性組和SYF高、低劑量組兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝7）

表2 各組兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝7）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組陽(yáng)性組SYF高劑量組SYF低劑量組PGE2/（pg/mL）149.49±20.87 193.04±25.83a 156.39±30.03b 157.85±29.25b 164.74±21.74b IL-1β/（pg/mL）16.60±3.67 24.33±3.13a 18.15±2.85b 19.14±2.11b 19.33±2.74b TNF-α/（pg/mL）62.13±9.53 82.46±10.35a 68.12±9.10b 70.32±9.26b 71.02±9.09b

3.4 滑膜組織病理學(xué)觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，空白組兔滑膜細(xì)胞呈單層鱗狀分布，排列有序，無組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與空白組比較，模型組兔滑膜細(xì)胞排列紊亂，組織明顯增厚，全層均有大量炎癥細(xì)胞分布，且有血腫與血管生成；與模型組比較，陽(yáng)性組和SYF高、低劑量組兔滑膜細(xì)胞排列較為疏松，組織增生程度減輕，炎癥細(xì)胞減少。結(jié)果見圖3。

圖3 各組兔滑膜組織HE染色圖（×200）

3.5 滑膜組織中TLR4、MyD88、NF- кB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組兔滑膜組織中TLR4、MyD88、NF-кB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性組和SYF高、低劑量組兔滑膜組織中TLR4、MyD88、NF-кB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 各組兔滑膜組織中 TLR4、MyD88、NF- кB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

3.6 滑膜組織中 TLR4、MyD88、NF- кB p65、p-NF- кB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組兔滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-кB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性組和SYF高劑量組兔滑膜組織中TLR4、MyD88、p-NF-кB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平及SYF低劑量組兔滑膜組織中TLR4、p-NF-кB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 各組兔滑膜組織中TLR4、MyD88、NF- кB p65、p-NF- кB p65蛋白表達(dá)電泳圖

圖6 各組兔滑膜組織中 TLR4、MyD88、NF- кB p65、p-NF- кB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

4 討論

KOA動(dòng)物模型的常用造模方法有手術(shù)法[11]、關(guān)節(jié)制動(dòng)法[12-13]、關(guān)節(jié)腔藥物注射法[14-15]等。本實(shí)驗(yàn)通過多次向兔右后肢膝關(guān)節(jié)腔注射0.5 mL木瓜蛋白酶混合液（含2%木瓜蛋白酶與0.03 mol/L L-半胱氨酸）復(fù)制KOA模型。木瓜蛋白酶是一類蛋白水解酶，可分解軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨缺乏彈性和抗壓性；關(guān)節(jié)軟骨在缺乏基質(zhì)的保護(hù)后，易退變降解，降解后產(chǎn)生的軟骨碎屑刺激滑膜而發(fā)生炎癥反應(yīng)[16]。此方法造模時(shí)間較快，劑量容易控制，不易損傷關(guān)節(jié)腔內(nèi)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，操作簡(jiǎn)便且不易感染，能夠較好模擬膝關(guān)節(jié)部位局部炎癥、滑膜組織破壞等一系列的病理變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兔右后肢膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶混合液后，模型組兔右后肢膝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)紅腫，伴有關(guān)節(jié)活動(dòng)功能障礙，右后肢膝關(guān)節(jié)脂肪墊糜爛，關(guān)節(jié)液黃濁，滑膜前段水腫充血帶有炎性損傷；病理切片結(jié)果顯示，滑膜細(xì)胞排列紊亂，組織明顯增厚，全層均有大量炎癥細(xì)胞分布，而陽(yáng)性組和SYF高、低劑量組中相應(yīng)癥狀均有顯著緩解。

KOA是關(guān)節(jié)軟骨組織發(fā)生退行性病變，繼而導(dǎo)致軟骨下骨硬化，關(guān)節(jié)周緣骨質(zhì)增生、骨贅形成[17]。膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥與KOA的發(fā)生發(fā)展密不可分——KOA發(fā)展過程中，關(guān)節(jié)軟骨降解物質(zhì)可隨關(guān)節(jié)液進(jìn)入滑膜部位，刺激滑膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，滑膜組織中巨噬樣滑膜細(xì)胞會(huì)分泌TNF-α、IL-1β等多種炎癥因子，其中IL-1β可介導(dǎo)前列腺素生成，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶合成，促進(jìn)軟骨凋亡[18]；TNF-α同樣可促進(jìn)前列腺素生成，并可通過抑制糖蛋白聚糖合成、產(chǎn)生膠原酶以及刺激成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞作用等方式破壞軟骨組織生成[19]。因此，滑膜炎癥反應(yīng)的程度可以作為膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)功能改變和病變預(yù)后的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2水平均顯著升高；與模型組比較，SYF高、低劑量組兔上述炎癥因子水平均顯著降低。

TLR4/MyD88/NF-кB信號(hào)通路是研究KOA機(jī)制的通路之一[21]。TLR是一類天然免疫受體，類似的同源性受體在哺乳動(dòng)物體內(nèi)也被發(fā)現(xiàn)，所以人們把它們統(tǒng)一歸類為TLR家族。在單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表面，TLR4受體被廣泛發(fā)現(xiàn)，它可以對(duì)相關(guān)的病原進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而釋放炎癥介質(zhì)，在天然免疫防御中起到重要作用[22]。MyD88作為TLR4的下行信號(hào)因子，不僅可以調(diào)控下行的炎癥因子（如IL-6），還可以產(chǎn)生α型干擾素和β型干擾素[23-25]，當(dāng)炎癥因子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，TLR4介導(dǎo)MyD88下行表達(dá)，進(jìn)而磷酸化NF-кB因子，進(jìn)一步激活炎癥因子的釋放，參與炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，SYF高、低劑量組兔滑膜組織中TLR4、MyD88、NF-кB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，TLR4、MyD88（SYF低劑量組除外）、p-NF-кB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低。

綜上所述，SYF對(duì)木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔KOA有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低炎癥因子IL-1β、TNF-α、PGE2水平及下調(diào)TLR4/MyD88/NF-кB信號(hào)通路有關(guān)。