張麗霞，陸萍，王春語(yǔ)，叢玲，王平，陳冰嬬，陸曉春*

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高粱研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163002；3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物資源研究所，吉林 公主嶺 136100）

高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是世界5 億多人口的口糧，同時(shí)也是動(dòng)物飼料、釀酒和制造工業(yè)乙醇的重要來(lái)源［1-3］。單寧（tannins）是高粱重要的次生代謝物之一，通常也稱(chēng)為縮合單寧（condensed tannins，CT）或原花青素（proanthocyanidins，PAs），廣泛存在于植物界中，如蘋(píng)果、藍(lán)莓、草莓、葡萄、蔓越莓、桃子和李子等水果中以及高粱、龍爪稷、蠶豆和大麥等谷物籽粒中［4］，但是主要谷類(lèi)作物如水稻、小麥和玉米籽粒中并不存在單寧［5］。單寧具有多種生物學(xué)功能，如抑菌抗病毒、抗過(guò)敏、抗氧化、消炎、抗腫瘤，促進(jìn)免疫、紫外線保護(hù)以及免受昆蟲(chóng)、鳥(niǎo)類(lèi)對(duì)谷物籽粒的噬食［6］。此外，單寧可以提高酒的品質(zhì)［7-8］。在我國(guó)，約80%的高粱籽粒用于釀酒，如馳名中外的茅臺(tái)酒、汾酒、瀘州老窖及其他高檔酒均以高粱為原料釀成［9］。單寧含量的高低直接影響高粱的用途。鑒于單寧的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和對(duì)消化率的影響，食物和動(dòng)物飼料中含有少量的單寧對(duì)人體健康和動(dòng)物都是有益的，如幼畜和家禽的飼料中添加含有少量單寧的高粱可以抵御痢疾以及反芻動(dòng)物的氣脹病［10-11］。但是當(dāng)食物和動(dòng)物飼料中單寧含量較高時(shí)，會(huì)降低蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉、脂肪、維生素以及礦物質(zhì)的消化吸收，降低食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，甚至導(dǎo)致病變［12］。

不同高粱材料籽粒的單寧含量差異較大，這主要取決于調(diào)控高粱單寧含量的基因不同。在擬南芥中，單寧生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑已經(jīng)進(jìn)行了深入地研究，成功克隆了大量關(guān)鍵基因，包括DFR（dihydroflavonol-4-reductase）、ANS（anthocyanidin synthase）、ANR（anthocyanidin reductase）和LAR（leucoanthocyanidin reductase）等［13］。利用遺傳學(xué)方法通過(guò)分析種皮透明突變體（transparent testa，tt），獲得了3 種調(diào)控單寧合成的必需蛋白，即AtTT2/AtMYB123（R2R3-MYB）［14］，AtTT8/AtbHLH042（R/b-like basic helix-loop-helix）［15］和AtTTG1（transparent testa glabra，WD-40 domain protein）［16］。這3 種蛋白形成MBW 復(fù)合體調(diào)控單寧的合成［17］。單寧合成調(diào)控途徑在高粱中研究較少，2012 年調(diào)控高粱單寧含量Tannin1（Tan1）基因被成功克隆，是一個(gè)WD-40 domain轉(zhuǎn)錄因子，與AtTTG1高度同源［18］。截止目前，Tan1共有4 種等位基因型，即Tan1、tan1-a、tan1-b和tan1-c［19］。3 種 等 位 變 異 由 于 堿 基 的 插 入、缺失和突變?cè)斐傻鞍仔蛄懈淖兓蛘咛崆敖K止，使Tan1 蛋白功能喪失導(dǎo)致籽粒無(wú)單寧或低單寧。Tan1基因?qū)φ{(diào)控高粱籽粒單寧含量發(fā)揮著舉足輕重的作用。

本研究通過(guò)比較野生型Tan1和3 種不同等位變異的編碼區(qū)序列以及含有不同等位基因型的高粱籽粒單寧含量，開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記為培育無(wú)單寧或低單寧專(zhuān)用型高粱品種提供快速、有效的分子檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

583 份自然群體材料和290 份栽培種來(lái)自印度、美國(guó)、中國(guó)和非洲國(guó)家，現(xiàn)由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所收集、保存。供試材料種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院沈陽(yáng)試驗(yàn)基地，待抽穗開(kāi)花后，取新鮮葉片用于基因組的提取。每份材料選取3～5 株套袋自交后，取均勻、飽滿(mǎn)的籽粒用于單寧含量測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取

取大約100 mg 新鮮葉片，利用天根公司“植物基因組DNA 提取試劑盒”（目錄號(hào)：DP305）提取總DNA，詳細(xì)操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，DNA于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Tan1等位基因型檢測(cè)

利用DNAMAN10.0 軟件設(shè)計(jì)引物Tan1-F（5’-TCTCTCGAGTCCCAGCAG-3’）和Tan1-R（5’-GGTAACACTGACCGAGTC-3’），PCR擴(kuò)增片段包括編碼區(qū)全長(zhǎng)及部分5’UTR、3’UTR序列，經(jīng)測(cè)序和比對(duì)后檢測(cè)Tan1基因在不同群體材料中的基因型變異。

1.2.3 單寧含量測(cè)定

（1）將4 g 高粱籽粒全部放入粉碎機(jī)中，充分粉碎，粉碎后的樣品全部通過(guò)1.0 mm 孔徑的篩子，第一次沒(méi)有通過(guò)篩子的樣品繼續(xù)粉碎，確保所有樣品全部過(guò)篩，然后充分混勻。

（2）稱(chēng)取樣品約0.1 g，精確至0.001 g，加入1 mL 滅菌的超純水，80 ℃水浴30 min。

（3）水浴后8000×g，4 ℃離心10 min 后將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，參考單寧含量測(cè)定試劑盒的步驟測(cè)定單寧含量（Cohesion Biosciences，CAK1060）。

1.2.4 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

依據(jù)Tan1不同等位基因型編碼區(qū)序列的堿基突變、插入缺失，根據(jù)PCR 產(chǎn)物大小、有無(wú)酶切位點(diǎn)等開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記。tan1-b由于10 bp（GCAGCGGCGG）的插入，利用引物Tan1-BZF1/Tan1-BZR1 擴(kuò) 增，Tan1擴(kuò) 增 片 段 大 小 為257 bp，tan1-b擴(kuò)增片段大小為267 bp。tan1-a由于編碼區(qū)580 位G 缺失產(chǎn)生EcoN I 新的酶切位點(diǎn)，利用引物Tan1-BZF2/ Tan1-BZR2 擴(kuò)增、酶切后，Tan1為723 bp，tan1-a為319 bp 和404 bp 兩 條帶。tan1-c由于編碼區(qū)1054 位A 突變?yōu)門(mén) 導(dǎo)致DdeI 酶 切 位 點(diǎn) 缺 失，Tan1-BZF3/ Tan1-BZR3 擴(kuò)增、酶切后，Tan1為109 bp 和56 bp 兩條帶，tan1-c為165 bp。引物序列及詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequences and uses

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳

玻璃板用酒精擦洗干凈，并用密封膠條、夾子和墊片將玻璃板固定好。將8 mL 30%丙烯酰胺預(yù)制膠（上海迪申生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：B1610156）、4 mL 5×TBE 溶液、27.5 mL 蒸餾水、450 μL 10% APS 和50 μL TEMED 充分混勻迅速灌入裝好的玻璃板中，插上梳子，室溫放置15 min以上，配置成6%聚丙烯酰胺凝膠。將制備好的膠板放置于已經(jīng)加入1×TBE 緩沖液的垂直電泳槽中，每個(gè)PCR 擴(kuò)增樣品（酶切樣品）上樣1.5 μL，130 V、電泳40～60 min 后關(guān)閉電源。取膠，放入硝酸銀染色液（0.5 g AgNO3充分溶于500 mL 蒸餾水）染色15 min，染色后的膠用蒸餾水沖洗3 次，然后放入顯影液（10 g NaOH、0.2 g NaHCO?充分溶于500 mL 蒸餾水中，再加入5 mL 甲醛混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配），輕搖至膠顯出清晰的條帶為止。照相，存儲(chǔ)，記錄、分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tan1 不同等位基因型序列分析

不同等位基因型的成功鑒定是分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的前提。根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，歸納總結(jié)出調(diào)控高粱單寧含量Tan1基因的4 種等位基因型編碼區(qū)序列和蛋白序列變異情況（表2、圖1、圖2）。野生型Tan1編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1062 bp，蛋白序列全長(zhǎng)353 aa。tan1-a與Tan1相比共有2 處發(fā)生變化，即編碼區(qū)580 位G 缺失、798 位G 突變?yōu)門(mén)，造成蛋白序列移碼和提前終止，蛋白序列全長(zhǎng)僅有298 aa。tan1-b編碼區(qū)925 位和926 位之間插入10 bp（GCAGCGGCGG），由于片段的插入導(dǎo)致蛋白序列提前終止，蛋白全長(zhǎng)為318 aa。tan1-c共發(fā)生3處變異，即1054 位A 突變?yōu)門(mén)、1057 位G 缺失 和1059 位C 突變?yōu)門(mén)，由于1054 位堿基突變導(dǎo)致三聯(lián)密碼子AGG 突變?yōu)門(mén)GG、1057 位單堿基缺失發(fā)生移碼導(dǎo)致終止密碼子TGA 丟失，使得蛋白序列延長(zhǎng)至388 aa。由此可見(jiàn)，3 種等位變異均造成Tan1 蛋白C 端序列發(fā)生了較大變化。

表2 Tan1 不同等位基因型編碼區(qū)變異位點(diǎn)Table 2 Variant sites in coding region of different Tan1 alleles

圖1 Tan1 不同等位基因型編碼區(qū)序列分析Fig.1 Analysis of coding sequences of different Tan1 alleles

圖2 Tan1 不同等位基因型蛋白序列分析Fig.2 Analysis of protein sequences of different Tan1 alleles

2.2 Tan1 不同等位基因型單寧含量

tan1-a、tan1-b和tan1-c3 種 等 位 變 異 均 對(duì)Tan1 蛋白C 端序列產(chǎn)生了或大或小的影響，是否影響Tan1 蛋白功能正常發(fā)揮而導(dǎo)致單寧含量發(fā)生變化？對(duì)來(lái)自世界各地的583 份自然群體材料進(jìn)行Tan1等位基因型鑒定和單寧含量測(cè)定。首先，利用引物Tan1-F/Tan1-R 對(duì)自然群體材料Tan1基因編碼區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、比對(duì)發(fā)現(xiàn)分別含有488 份Tan1、54 份tan1-a、27 份tan1-b和14份tan1-c（圖3A）。其次，利用“單寧含量測(cè)定試劑盒”測(cè)定了583 份材料籽粒的單寧含量，其中95 份含有3 種不同等位變異基因型的籽粒單寧含量均低于0.5%，而488 份含有Tan1野生型的材料籽粒單寧含量從低到高都有分布（圖3B）。由此可見(jiàn)，與AtTTG1一樣，C 端蛋白序列對(duì)Tan1 蛋白功能發(fā)揮非常重要，C 端蛋白序列變異導(dǎo)致單寧含量顯著降低或者無(wú)單寧。

圖3 583 份自然群體材料Tan1 等位基因型和單寧含量分析Fig.3 Analysis of Tan1 alleles and tannin contents in 583 germplasms

2.3 栽培種Tan1 不同等位基因型和單寧含量

為了初步探究4 種Tan1等位基因型在育種中的應(yīng)用情況，我們對(duì)290 份來(lái)自世界各地栽培種的Tan1等位基因型和單寧含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中190 份含有Tan1野生型的高粱籽粒單寧含量仍然從低到高都有分布，而100 份含有tan1-a、tan1-b和tan1-c突變基因型的高粱籽粒單寧含量較 低 或 者 無(wú) 單 寧，含 有Tan1、tan1-a、tan1-b和tan1-c基因型高粱材料的比例分別為65.52%、7.59%、26.21% 和0.69%，由此可見(jiàn)，tan1-a和tan1-b廣泛應(yīng)用于低單寧或者無(wú)單寧品種培育中，tan1-c應(yīng)用相對(duì)較少（圖4）。

圖4 290 份栽培種Tan1 等位基因型和單寧含量分析Fig.4 Analysis of Tan1 alleles and tannin contents in 290 cultivars

2.4 Tan1 不同等位基因型分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

為了快速鑒定Tan1不同等位變異類(lèi)型，根據(jù)編碼區(qū)序列開(kāi)發(fā)實(shí)用的分子標(biāo)記。tan1-b與野生型Tan1相 比，在925～926 位 之 間 插 入10 bp（GCAGCGGCGG）（圖1A）。利用插入片段設(shè)計(jì)Tan1-BZF1/R1 引物，當(dāng)檢測(cè)片段大小為267 bp時(shí)，該材料基因型為tan1-b，含有其他等位基因型的材料擴(kuò)增片段大小為257 bp（表1，圖5A）。tan1-a與野生型Tan1相比，由于編碼區(qū)580 位G缺失產(chǎn)生EcoN I 新酶切位點(diǎn)，經(jīng)Tan1-BZF2/R2引物擴(kuò)增和EcoN I 酶切后，Tan1片段大小為723 bp，tan1-a則產(chǎn)生319 bp 和404 bp 兩條帶（表1，圖5B）。tan1-c與野生型Tan1相比，由于編碼區(qū)1054 位A 突變?yōu)門(mén) 使酶切位點(diǎn)DdeI 缺失，Tan1-BZF3/R3 引 物PCR 擴(kuò)增和DdeI 酶切 后，tan1-c片段大小為165 bp，Tan1則有109 bp 和56 bp 兩條帶（表1，圖5C）。

圖5 Tan1 不同等位基因型分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)Fig.5 Developing molecular markers for Tan1 different alleles

3 討論

Tan1基因在不同物種中都存在高度同源的基因，但是生物學(xué)功能差異較大。與Tan1基因高度同源的AtTTG1基因在擬南芥中共獲得了78 個(gè)不同的等位變異突變體（ttg1），通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子、3'UTR、5'UTR、內(nèi)含子和外顯子區(qū)T-DNA 插入、SNP 突變以及大片段置換改變基因序列（https：//www. arabidopsis. org）。通過(guò)鑒定和應(yīng)用這些突變體對(duì)AtTTG1基因功能和參與的信號(hào)途徑進(jìn)行了深入研究，如ttg1-1突變體由于單堿基突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止，造成蛋白功能缺失。ttg1-1影響表皮細(xì)胞的分化、花青素和單寧的積累、植物晝夜節(jié)律變化、種皮粘液合成分泌和種皮分化等［20-22］。第一外顯子由于T-DNA 插入缺失造成編碼區(qū)序列改變的突變體ttg1-23以及AtTTG1基因的完全缺失突變體ttg1-24，兩者均表現(xiàn)出種皮透明、種子呈現(xiàn)黃色、無(wú)毛狀體分化以及不能合成花青素和單寧［23］。Wu 等［18］也利用擬南芥中7 個(gè)ttg1突變體證明了WD-40 domain 和C 端對(duì)AtTTG1 蛋白功能正常發(fā)揮的重要作用。ttg1-1突變體相比其他突變體蛋白缺失最少且只發(fā)生在C 末端，但是仍然導(dǎo)致AtTTG1 蛋白功能缺失。利用35S-SbTan1轉(zhuǎn)化擬南芥ttg1-1突變體，大部分恢復(fù)了ttg1突變表型［18］。

蠶豆籽粒富含蛋白質(zhì)（247～372 g·kg-1DM）和能量（15.6 MJ·kg-1DM），是一種高營(yíng)養(yǎng)的豆類(lèi)作物，傳統(tǒng)上用于動(dòng)物飼養(yǎng)和人類(lèi)食用。盡管在農(nóng)藝、營(yíng)養(yǎng)和潛在的健康方面都有益處，但是由于種皮中富含單寧限制了蠶豆在飼料中的應(yīng)用潛力。蠶豆籽粒無(wú)單寧表型受zt-1和zt-2兩個(gè)互補(bǔ)隱性基因的控制，ZT-1（VfTTG1）基因編碼位于2號(hào)染色體上的WD-40 domain 轉(zhuǎn)錄因子，與擬南芥中AtTTG1高度同源，參與單寧的合成調(diào)控途徑。鑒定獲得2 個(gè)VfTTG1基因的等位變異類(lèi)型ttg1-a和ttg1-b。ttg1-a突變位點(diǎn)發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)，影響基因的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性；ttg1-b蛋白序列N 端缺失。ttg1-a和ttg1-b蛋白功能喪失導(dǎo)致籽粒無(wú)單寧。設(shè)計(jì)了一套特異等位基因診斷標(biāo)記，可以將zt-1與野生型和zt-2基因型區(qū)分開(kāi)來(lái)，并將其應(yīng)用于培育無(wú)單寧蠶豆的育種中［24］。玉米中與AtTTG1高度同源的基因ZmPAC1已被成功克隆，且發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)不同的等位變異類(lèi)型，分別為pac1-ref，pac1-2和pac1-3。ZmPAC1基因在花青素合成途徑中發(fā)揮重要作用，過(guò)表達(dá)ZmPAC1基因轉(zhuǎn)化擬南芥ttg1突變體可以部分恢復(fù)突變表型。ZmPAC1基因突變后影響幼苗根中花青素的積累，但是對(duì)根和毛狀體的發(fā)育、分化沒(méi)有影響，這與擬南芥ttg1突變體的表型差異很大［25］。高粱與玉米是親緣關(guān)系最近的兩個(gè)物種，且ZmPAC1與Tan1高度同源，但是生物學(xué)功能相差很大，Tan1是調(diào)控高粱單寧合成的必須基因，而玉米籽粒中無(wú)單寧，ZmPAC1不參與調(diào)控單寧的合成而參與花青素的積累。

本研究分析自然群體中單寧含量調(diào)控基因Tan1的不同等位基因型以及單寧含量發(fā)現(xiàn)，含有tan1-a、tan1-b和tan1-c突變等位基因型的高粱材料籽粒單寧含量均低于0.5%，但是含有野生型Tan1的高粱籽粒單寧含量從低到高都有分布。研究報(bào)道表明，調(diào)控高粱籽粒單寧含量的基因共有2個(gè)，即Tan1和Tan2，兩個(gè)基因分別含有3 種等位變異基因型，其中任何一個(gè)基因發(fā)生變異都會(huì)導(dǎo)致高粱籽粒無(wú)單寧或者低單寧［19］。本研究中含有Tan1野生型且籽粒無(wú)單寧或者低單寧的高粱材料是否由于Tan2基因發(fā)生了變異還是存在其他的調(diào)控基因還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

調(diào)控高粱籽粒單寧含量的基因可能遠(yuǎn)不止Tan1和Tan2，培育高單寧含量的品種時(shí)，需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)單寧調(diào)控基因的基因型。然而對(duì)于培育低單寧含量的品種時(shí)，一是建議選擇雙親都含有任意Tan1和Tan2突變等位基因型的材料進(jìn)行雜交組配，后代個(gè)體均為低單寧或無(wú)單寧表型。二是當(dāng)兩親本雜交時(shí)其中一個(gè)親本含有Tan1和Tan2任何一種突變等位基因型時(shí)，在后代材料中選擇含有突變等位基因型的個(gè)體。

4 結(jié)論

調(diào)控高粱籽粒單寧含量的Tan1基因共有4 種等位基因型，即Tan1、tan1-a、tan1-b和tan1-c，由于編碼區(qū)序列的插入、缺失和突變使蛋白C 端序列發(fā)生改變，導(dǎo)致Tan1 蛋白功能喪失造成含有Tan1突變基因型的高粱籽粒無(wú)單寧或低單寧，而含有Tan1基因型的高粱材料單寧含量從低到高都有分布。通過(guò)對(duì)290 份栽培種高粱材料Tan1基因型和單寧含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在低單寧或無(wú)單寧品種培育中tan1-a和tan1-b應(yīng)用廣泛，而tan1-c應(yīng)用較少。依據(jù)Tan1不同等位基因型的編碼區(qū)序列差異，開(kāi)發(fā)了一套實(shí)用的分子標(biāo)記，為無(wú)單寧或低單寧雜交種培育提供快捷的分子檢測(cè)手段。