国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx

芍藥苷對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用及機(jī)制

2022-09-29 07:33:22榮華孫曉雪李曉明徐天嬌李旭郭科東
中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志 2022年7期
關(guān)鍵詞:爬桿吉蘭黑質(zhì)

榮華 孫曉雪 李曉明 徐天嬌 李旭 郭科東

帕金森病(Parkinson's disease,PD)作為一種神經(jīng)退行性疾病,多發(fā)生于60 歲以上的老年人群,常伴有靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)緩慢以及步態(tài)異常等臨床癥狀,中腦黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元的丟失以及路易小體的形成是該疾病的典型病理特征[1,2]。α-突觸核蛋白(α-syn)為路易小體主要成分,與PD 的發(fā)生與發(fā)展存在密切聯(lián)系,其含量過度升高會(huì)引發(fā)神經(jīng)元死亡,因此,抑制α-syn的表達(dá)將成為治療PD 的研究方向[3,4]。

目前西醫(yī)尚無根治PD 的有效方法,循證醫(yī)學(xué)推薦的左旋多巴、多巴胺受體激動(dòng)劑和單胺氧化酶B(Monoamine oxidase B,MAO-B)抑制劑長期使用會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)且會(huì)出現(xiàn)療效衰退的現(xiàn)象。中藥類制劑可明顯改善PD 患者運(yùn)動(dòng)癥狀,并緩解其他非運(yùn)動(dòng)癥狀,因此中藥及其活性單體成分受到廣泛關(guān)注。研究證實(shí)芍藥苷可以透過血腦屏障,具有神經(jīng)保護(hù)的作用,且發(fā)現(xiàn)芍藥苷的作用機(jī)制可能與促進(jìn)神經(jīng)生長、抗神經(jīng)細(xì)胞氧化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)[5]。因此,本研究采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)作為誘導(dǎo)劑致使模型小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生損傷,觀察芍藥苷對神經(jīng)元的保護(hù)作用,并對相應(yīng)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級C57BL/6 小鼠,雄性3月齡,購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,動(dòng)物許可證號:SCXK(遼)2020-0001,體質(zhì)量20~25g。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號:QMUAECC-2021-127。

1.2 藥品與試劑 藥品包括芍藥苷(瑞芬思生物科技有限公司)、MPTP(美國Sigma 公司),試劑包括α-syn 抗體(英國abcam 公司)、TH 抗體(博士德生物有限公司),TRIzol Reagent(美國Gibcobrl 公司)、SYBR Green I master mix(美國ABI 公司),引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 儀器 Stratagene 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Agilent公司,型號:Mx2005P),全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek 公司,型號:S1000),Iamge Analysis System(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司,型號:Smart Chemi)。YABO 電腦自動(dòng)脫水機(jī)及YABO0400 組織包埋機(jī)[常州雅博電子設(shè)備有限公司、RM2233Leica 切片機(jī)德國(3B)]、PURELAB PLUS 超純水機(jī)(美國波爾公司)、Thermo超低溫冰箱88000(Thermo 公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 小鼠在25℃,濕度40%環(huán)境下自由攝食飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。隨機(jī)將受試小鼠分為對照組、模型組、司來吉蘭組、芍藥苷低劑量組、芍藥苷高劑量組,每組10 只小鼠。除對照組外其余各組均給予MPTP(25mg/kg)腹腔注射7d,同時(shí)在注射給藥1h 后給予藥物灌胃治療,司來吉蘭組小鼠采用10mg/kg 司來吉蘭灌胃治療,芍藥苷低劑量組小鼠以7.5mg/kg 芍藥苷灌胃,芍藥苷高劑量組小鼠以30mg/kg 芍藥苷灌胃,治療14d。灌胃給藥結(jié)束后進(jìn)行爬桿與轉(zhuǎn)棒試驗(yàn),對小鼠行為學(xué)進(jìn)行檢測后,小鼠取腦,冰上快速剝離黑質(zhì)備用。

1.4.2 行為學(xué)檢測

1.4.2.1 爬桿實(shí)驗(yàn) 將長度為50cm,直徑為1cm 的金屬桿頂部固定直徑為2.5cm 的圓球,為防止打滑,使用紗布包繞桿部,將小鼠置于球上,以小鼠雙前肢接觸桿底平臺認(rèn)定為爬完全程,記錄小鼠爬桿時(shí)間,每30min 進(jìn)行1 次測量,共3 次,取平均值。

1.4.2.2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 在正式測試前先對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練,以轉(zhuǎn)速15r/min,訓(xùn)練時(shí)間為120s,連續(xù)3d。檢測時(shí)轉(zhuǎn)棒儀起始轉(zhuǎn)速為4r/min,最大為40r/min,加速度為20r/min,測試時(shí)間5min,記錄小鼠從轉(zhuǎn)棒開始到掉下轉(zhuǎn)棒的時(shí)間(運(yùn)動(dòng)潛伏時(shí)間)。進(jìn)行3 次測試,每次間隔30min,取平均值。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測 采用AnnexinV-FITC 雙染法測定細(xì)胞凋亡率。取小鼠黑質(zhì)區(qū)組織,加入4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液PBS 制備細(xì)胞懸液,將細(xì)胞濃度調(diào)至約1×106個(gè)/ml。反應(yīng)管中加400μlPBS,流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4.4 caspase-3 活性檢測 制備腦組織勻漿液,按照試劑盒操作方法檢測各組小鼠腦組織裂解液中caspase-3 活性。

1.4.5 透射電子顯微鏡下觀察小鼠神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)改變 冰上迅速取小鼠黑質(zhì)組織約1mm3,置于2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜,酒精丙酮梯度脫水,環(huán)氧丙酮+環(huán)氧樹脂(1:1)浸透,環(huán)氧樹脂包埋、固化,制備半薄切片和超薄切片,進(jìn)行雙重染色(醋酸鈾-檸檬酸鉛),電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.6 免疫組織化學(xué)法檢測TH 陽性神經(jīng)元平均光密度 4%多聚甲醛固定腦組織,4℃保存72h 后,脫水浸蠟后進(jìn)行包埋。中腦黑質(zhì)區(qū)域冠狀切片,65℃烘片6h,進(jìn)行脫蠟、水化處理后,開始TH 免疫組織化學(xué)染色。

1.4.7 免疫印跡檢測α-syn 蛋白的表達(dá) 快速取腦,加入200μl 包含蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑的裂解液,10 000r/min,4℃離心10min,微孔板法進(jìn)行蛋白濃度的測定,酶標(biāo)儀上562nm 波長處檢測吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品的蛋白濃度。SDS 凝膠電泳分離蛋白,電泳,轉(zhuǎn)至PVDF 膜,4℃封閉過夜。加入一抗α-syn(1:1000),加入二抗室溫孵育2h,TBST 溶液洗膜3 次,每次10min。暗室進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),顯影及定影。AlphaEaseFC 圖像分析軟件進(jìn)行分析,以GAPDH 條帶作為內(nèi)參,計(jì)算公式:相應(yīng)蛋白表達(dá)量=相應(yīng)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4.8 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測α-syn mRNA 表達(dá) 取60mg 腦組織,加入600μl Trizol 溶液,使用電動(dòng)組織研磨器將腦組織在冰上進(jìn)行勻漿處理提取黑質(zhì)總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增PCR。α-syn 引物序列:F 5'-TGGCTTTGTCAAGAAGGACC AGATG-3',R 5'-CCACAGGCATGTCTTCCAGGATTC-3'。擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后,使用2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)比較采用SNK 檢驗(yàn),P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對PD 小鼠行為學(xué)的影響 與對照組比較,模型組小鼠爬桿時(shí)間顯著延長,在棒停留時(shí)間明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,各給藥組爬桿時(shí)間均縮短(P<0.05),且高劑量組小鼠爬桿時(shí)間較低劑量組更短,在棒時(shí)間增多,與司來吉蘭組比較,芍藥苷各劑量組爬桿時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠爬桿時(shí)間和在棒停留時(shí)間的比較(±s,s)

表1 各組小鼠爬桿時(shí)間和在棒停留時(shí)間的比較(±s,s)

注:與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

組別 n 爬桿時(shí)間 在棒時(shí)間對照組 10 7.11±0.16 234.07±17.54模型組 10 17.17±1.67a 109.80±9.91a司來吉蘭組 10 12.30±0.17b 172.41±11.58b芍藥苷低劑量組 10 13.52±0.55b 123.64±9.96b芍藥苷高劑量組 10 12.85±0.54b 165.00±6.59b

2.2 芍藥苷對PD 小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡及caspase-3活性的影響 與對照組比較,模型組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率及caspase-3 活性水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,各給藥組細(xì)胞凋亡率及caspase-3 活性水平均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且芍藥苷高劑量組的效果最為明顯,與司來吉蘭組效果相似。見表2。

表2 各組小鼠細(xì)胞凋亡率及caspase-3 活性表達(dá)的比較(x—±s)

2.3 芍藥苷對PD 小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響 對照組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞器清晰,核膜完整,細(xì)胞質(zhì)豐富,線粒體嵴清晰。與對照組比較,模型組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞核固縮,異染色質(zhì)邊集,核周隙增寬,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,線粒體變性,有明顯脂褐素沉著;與模型組比較,司來吉蘭組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)較完好,偶見脂褐素沉著;芍藥苷低、高劑量組小鼠神經(jīng)元核固縮減輕,脂褐素減少,且芍藥苷高劑量組效果更為明顯,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。見圖1。

圖1 各組小鼠細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)(TEM,×13000)

2.4 芍藥苷對PD 小鼠TH 免疫組化結(jié)果的影響與對照組比較,模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)域TH 平均光密度值降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,各給藥組均可不同程度的增加TH 的表達(dá),芍藥苷高劑量組效果更為顯著,與司來吉蘭組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠黑質(zhì)TH 平均光密度值比較(±s)

表3 各組小鼠黑質(zhì)TH 平均光密度值比較(±s)

注:與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

組別 n TH(MOD)對照組 10 0.61±0.04模型組 10 0.19±0.01a司來吉蘭組 10 0.48±0.02b芍藥苷低劑量組 10 0.26±0.06芍藥苷高劑量組 10 0.44±0.02b

2.5 芍藥苷對PD 小鼠α-syn 蛋白及mRNA 表達(dá)的影響 與對照組比較,模型組小鼠腦組織α-syn 蛋白及mRNA 水平明顯升高;與模型組比較,司來吉蘭組、芍藥苷高劑量組均能下調(diào)其表達(dá)水平(P<0.05),芍藥苷低劑量組作用不明顯,芍藥苷高劑量組效果較好,與司來吉蘭相比無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠α-syn 蛋白及mRNA 水平比較(±s)

表4 各組小鼠α-syn 蛋白及mRNA 水平比較(±s)

注:與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

組別 n α-syn 蛋白(%) α-syn mRNA對照組 10 100.00±0.00 1.01±0.12模型組 10 166.32±15.68a 1.49±0.17a司來吉蘭組 10 130.25±13.16b 1.20±0.06b芍藥苷低劑量組 10 155.64±20.14 1.38±0.20芍藥苷高劑量組 10 128.16±19.27b 1.22±0.11b

3 討論

據(jù)流行病學(xué)顯示,PD 已成為繼阿爾茨海默病后影響老年人群身心健康的第二大神經(jīng)退行性疾病,且人口老齡化是當(dāng)今世界發(fā)展的必然趨勢[6]。DA 能神經(jīng)元的顯著缺失以及細(xì)胞中路易小體的形成,是疾病的主要病理特征[7,8]。在臨床中DA 類藥物的替代治療是常用的手段,并且從神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究PD 的發(fā)病原因越來越受到重視[9,10]。MPTP是廣泛用于小鼠PD 誘導(dǎo)模型的金標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)毒素,它通過凋亡通路選擇性地引起黑質(zhì)和紋狀體DA 能神經(jīng)元的死亡[11],能夠成功在小鼠身上再現(xiàn)PD 患者的軀體癥狀,是理想的動(dòng)物模型[12,13]。

芍藥苷是中藥白芍中分離得到的一種單萜苷,在神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的藥理作用,被用于治療腦缺血[14]及神經(jīng)退行性疾病,如阿爾茨海默病[15]和帕金森病[16]。芍藥苷具有改善學(xué)習(xí)記憶、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗氧化等作用[17,18]。已有研究表明芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)作用是通過激活腺苷A1 受體、改善膽堿能神經(jīng)功能、調(diào)節(jié)離子通道穩(wěn)態(tài)、延緩神經(jīng)元氧化應(yīng)激和凋亡、促進(jìn)神經(jīng)生長、提供神經(jīng)保護(hù)等途徑實(shí)現(xiàn)的[19~22]。但芍藥苷對神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制尚不十分明確。以往的試驗(yàn)研究是進(jìn)行預(yù)防性給予藥物治療后再進(jìn)行造模誘導(dǎo),為了更貼近于臨床實(shí)際情況,在此次研究中我們采用MPTP 腹腔注射給藥受試小鼠,同時(shí)進(jìn)行芍藥苷治療性給藥,發(fā)現(xiàn)芍藥苷低、高劑量組小鼠的黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象有所改善,提示芍藥苷通過抑制MPTP 誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡發(fā)揮治療作用。

TH 作為檢測DA 能神經(jīng)元的金標(biāo)準(zhǔn)[23],它可以反映出神經(jīng)元的位置和數(shù)量,用來判斷MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型的嚴(yán)重程度[24]。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者和凋亡級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵要素。有學(xué)者提出PD 患者死亡后腦內(nèi)的caspase-3 陽性神經(jīng)元數(shù)量呈增加的趨勢,說明其是人類及動(dòng)物患PD 時(shí)神經(jīng)元凋亡的易感因子和最終效應(yīng)器[25]。α-syn作為路易小體的主要成分之一,其表達(dá)水平能夠反映出PD 病理機(jī)制的關(guān)鍵[26]。本次研究結(jié)果顯示芍藥苷可以減輕MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠的異常行為,提高運(yùn)動(dòng)能力,改善腦部細(xì)胞器結(jié)構(gòu),減輕黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷,抑制caspase-3 的活化水平,降低PD小鼠腦組織α-syn 高表達(dá)。由此初步推測芍藥苷具有神經(jīng)保護(hù)作用,提示芍藥苷可能通過調(diào)節(jié)控制α-syn 分子水平來發(fā)揮效應(yīng)。

猜你喜歡
爬桿吉蘭黑質(zhì)
簡論現(xiàn)代雜技中爬桿的技巧與藝術(shù)化演繹
一種用于電力維修的爬桿機(jī)器人設(shè)計(jì)
帕金森病模型大鼠黑質(zhì)磁共振ESWAN序列R2*值與酪氨酸羥化酶表達(dá)相關(guān)性的研究
爬桿機(jī)器人設(shè)計(jì)
電子制作(2018年17期)2018-09-28 01:56:40
帕金森病患者黑質(zhì)的磁共振成像研究進(jìn)展
單胺氧化酶-B抑制藥雷沙吉蘭的臨床藥理學(xué)特征解析
1H-MRS檢測早期帕金森病紋狀體、黑質(zhì)的功能代謝
磁共振成像(2015年7期)2015-12-23 08:53:04
壞壞惹人愛凱倫·吉蘭
電影故事(2015年43期)2015-11-16 05:51:18
補(bǔ)腎活血顆粒對帕金森病模型大鼠黑質(zhì)紋狀體bcl-2、bax表達(dá)的影響
脊髓炎型吉蘭巴雷綜合征1例報(bào)道并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
屯门区| 博客| 霍山县| 临城县| 蒙城县| 华阴市| 麟游县| 靖西县| 通道| 利川市| 屯留县| 泌阳县| 都匀市| 微博| 芜湖市| 东乡县| 巴青县| 静海县| 同江市| 兖州市| 五台县| 水富县| 谷城县| 秦皇岛市| 曲水县| 巴塘县| 明溪县| 定边县| 乌兰察布市| 买车| 开平市| 西吉县| 龙江县| 沾益县| 乌兰察布市| 白玉县| 台湾省| 沙河市| 油尖旺区| 湄潭县| 双牌县|