施永恒，劉澤兵，劉 強(qiáng)

胰腺癌是一種惡性度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，因其癥狀不具有特異性，早期診斷困難[1]。常見(jiàn)病理類型為導(dǎo)管腺癌[2]，其增長(zhǎng)快、易出現(xiàn)周?chē)馨徒Y(jié)及臟器轉(zhuǎn)移，早期不易發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已錯(cuò)失行手術(shù)根除腫瘤的最佳時(shí)機(jī)[3]，并且胰腺癌對(duì)放、化療及綜合治療方案不敏感，患者預(yù)后極差[4]。多發(fā)性骨髓瘤1(MUM1)/干擾調(diào)節(jié)因子4(IRF4)即多發(fā)性骨髓瘤致癌基因，是干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)家族成員之一，具有抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[5]。與其他癌基因一樣，MUM1在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因[6]。現(xiàn)階段關(guān)于MUM1的研究主要在免疫細(xì)胞領(lǐng)域[7-8]，而在胰腺癌中的研究相對(duì)較少。本文采用免疫組化法檢測(cè)胰腺癌組織中MUM1的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理特征及生存期的關(guān)系，為胰腺癌患者預(yù)后的早期評(píng)估提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2008年1月～2018年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院存檔的胰腺癌樣本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織145例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查明確診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析從https://genome-cancer.ucsc.edu/下載胰腺癌相關(guān)的TCGA數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中基因與胰腺癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，獲得包括MUM1表達(dá)和臨床信息的數(shù)據(jù)。

1.3 方法

1.3.1組織芯片制作 將上述石蠟樣本4 μm厚切片，行HE染色，鏡下觀察標(biāo)記典型的腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織的位置，并在對(duì)應(yīng)的石蠟樣本上進(jìn)行標(biāo)記，用內(nèi)徑0.6 mm的不銹鋼針進(jìn)行穿刺取樣，深度2～3 mm，將其固定于模具蠟塊的小孔內(nèi)；將蠟塊4 ℃預(yù)冷4 h，修正蠟塊，將模具蠟塊4 μm厚切片，敷貼于載玻片上，進(jìn)行封蠟保存。

1.3.2免疫組化 將收集的145例胰腺癌石蠟組織芯片標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，所有白片均經(jīng)APES防脫片預(yù)處理，50 ℃烘片2 h，用于免疫組化染色。免疫組化染色采用MaxVision法，切片脫蠟及脫水處理后，滴加一抗(MUM1)4 ℃過(guò)夜，PBS清洗后，滴加二抗試劑，室溫孵育1 h，PBS再次清洗后DAB顯色。結(jié)果判定：蛋白染色呈棕黃色顆粒狀，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果判斷：參照Kohlberger等[9]采用的半定量積分法判斷結(jié)果，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野(200×)，計(jì)數(shù)100個(gè)胰腺癌細(xì)胞并統(tǒng)計(jì)分?jǐn)?shù)。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(2)按染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘作為最終判斷：>4分為高表達(dá)，≤4為低表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果由本院兩位病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判定，如結(jié)果不一致，則由第三位病理醫(yī)師復(fù)閱判定。

1.3.3熒光定量PCR法檢測(cè)MUM1 mRNA表達(dá)水平 用Trizol法提取胰腺癌及癌旁組織中總RNA，在紫外分光光度計(jì)上對(duì)RNA純度及濃度進(jìn)行定量。

1.4 隨訪對(duì)胰腺癌患者的生存狀況進(jìn)行定期電話隨訪，術(shù)后總生存期為從胰腺癌患者術(shù)后到死亡日期或隨訪終止日期(2018年12月31日)。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌預(yù)后相關(guān)基因通過(guò)單因素Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中17 220個(gè)基因與178例胰腺癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5個(gè)基因與胰腺癌患者的總生存期相關(guān)(P均<0.001)，其中MUM1的相關(guān)性最強(qiáng)(圖1A)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，MUM1 mRNA高表達(dá)患者總生存期優(yōu)于MUM1 mRNA低表達(dá)患者(P=0.004，HR=0.55)(圖1B)。此外，MUM1 mRNA高表達(dá)的患者無(wú)瘤生存期也優(yōu)于MUM1 mRNA低表達(dá)患者(P=0.001，HR=0.48)(圖1C)。

圖1 全基因組范圍內(nèi)與胰腺癌預(yù)后相關(guān)的基因篩查：A.TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)單因素Cox回歸分析全基因組內(nèi)與胰腺癌預(yù)后的相關(guān)分子；B.MUM1 mRNA表達(dá)量與胰腺癌患者總生存期的相關(guān)性；C.MUM1 mRNA表達(dá)量與胰腺癌患者無(wú)瘤生存期的相關(guān)性

2.2 胰腺癌及癌旁組織中MUM1的表達(dá)基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)比較了179例胰腺癌組織及4例正常胰腺組織中MUM1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)正常胰腺組織中MUM1 mRNA的表達(dá)量是胰腺癌組織的1.38倍(t=1.93，P<0.05，圖2A)。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR法檢測(cè)30對(duì)胰腺癌及癌旁組織中MUM1 mRNA的表達(dá)量，同樣發(fā)現(xiàn)正常胰腺組織中MUM1 mRNA表達(dá)量是胰腺癌組織的1.49倍(t=4.45，P<0.05,圖2B)。免疫組化結(jié)果顯示，MUM1蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織組織中均有表達(dá)，呈棕黃色，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖2C)。MUM1蛋白在癌旁組織中的表達(dá)(MUM1高表達(dá)率為66.9%)高于胰腺癌(MUM1高表達(dá)率為48.3%)(χ2=10.29，P<0.05)。

圖2 胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織中MUM1的表達(dá)：A.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)比較胰腺癌組織及正常胰腺組織中MUM1 mRNA的表達(dá)量；B.熒光定量PCR分析胰腺癌組織及癌旁組織中MUM1 mRNA的表達(dá)量；C.免疫組化分析胰腺癌組織及癌旁組織中MUM1蛋白的表達(dá)，MaxVision法

2.3 MUM1蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MUM1表達(dá)與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=7.03，P=0.008)，與患者性別、年齡、腫瘤部位、病理分級(jí)、腫瘤最大徑、神經(jīng)侵犯、血管侵犯、脈管癌栓、T分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期無(wú)關(guān)(P均>0.05，表1)。

表1 MUM1蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.4 MUM1蛋白表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，MUM1高表達(dá)患者的總生存期明顯高于MUM1低表達(dá)患者，Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，MUM1高表達(dá)與患者良好預(yù)后相關(guān)(P=0.002，HR=0.40，圖3)。單因素Cox回歸分析顯示，腫瘤最大徑、血管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期和MUM1表達(dá)均是胰腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)(P均<0.05，表2)。此外，多因素Cox回歸分析顯示，MUM1表達(dá)降低是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這提示MUM1表達(dá)可作為胰腺癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

表2 Cox回歸分析胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)因素

圖3 MUM1蛋白表達(dá)與胰腺癌患者總生存期的相關(guān)性

3 討論

胰腺癌作為我國(guó)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[10]，手術(shù)結(jié)合放、化療及綜合治療方案雖然改善了患者預(yù)后，但其生存率仍極低，1年生存率<20%，5年生存率<10%[11]。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及高轉(zhuǎn)移侵襲特性導(dǎo)致患者預(yù)后差[12]。

MUM1/IRF4基因最先在多發(fā)性骨髓瘤中被識(shí)別，患者t(6；14)(p25；q32)易位導(dǎo)致MUM1/IRF4蛋白過(guò)表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤形成[13]。其基因產(chǎn)物屬于干擾素調(diào)控因子家族成員，特異性表達(dá)于淋巴細(xì)胞，是B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的重要調(diào)控因子[14]。既往文獻(xiàn)報(bào)道MUM1/IRF4在彌漫大B細(xì)胞中的陽(yáng)性率高達(dá)50%～70%[15]，提示MUMI表達(dá)很可能與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的組織學(xué)變異有關(guān)[16]，MUM1/IRF4陽(yáng)性患者的無(wú)瘤生存率顯著低于陰性患者。然而，亦有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)MUMl/IRF4表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)關(guān)[17]。部分學(xué)者認(rèn)為MUM1/IRF4蛋白表達(dá)是B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞性白血病預(yù)后良好的指標(biāo)之一[18]。

目前針對(duì)MUM1/IRF4蛋白與腫瘤預(yù)后的關(guān)系尚無(wú)明確定論，MUM1蛋白在實(shí)體腫瘤中的表達(dá)及意義的相關(guān)性研究較少，并且在胰腺腫瘤中尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)分析TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)，篩查與患者預(yù)后顯著相關(guān)的基因MUM1，并進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR證實(shí)該基因在胰腺癌組織中表達(dá)顯著降低。同時(shí)采用免疫組化法首次檢測(cè)了MUM1蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)MUM1蛋白在胰腺癌組織中呈低表達(dá)，并且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。生存分析提示，MUM1蛋白高表達(dá)患者的總生存期優(yōu)于MUM1蛋白低表達(dá)患者，此外，Cox回歸分析顯示，MUM1高表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。Sundram等[19]研究發(fā)現(xiàn)MUM1在黑色素細(xì)胞中呈陽(yáng)性，是黑色素細(xì)胞病變的一種敏感和特異的免疫組化標(biāo)志物。國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道MUM1蛋白表達(dá)與黑色素瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，是黑色素瘤預(yù)后的不良因素[20-21]。現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，MUM1在實(shí)體腫瘤中的表達(dá)與功能不盡相同。Mittrucker等[22]發(fā)現(xiàn)在MUM1基因缺失小鼠中，B細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過(guò)程中均功能失調(diào)，提示MUM1表達(dá)對(duì)于成熟B細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。因此，作者推測(cè)MUM1在胰腺癌組織中表達(dá)降低促進(jìn)了胰腺癌的進(jìn)展，可能與其引起的免疫功能失調(diào)相關(guān)，然結(jié)果仍需積累大樣本進(jìn)行深入探究。

綜上所述，胰腺癌組織中MUM1呈低表達(dá)，MUM1表達(dá)降低與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和生存期縮短顯著相關(guān)。Cox生存分析提示，MUM1表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。以上結(jié)果提示通過(guò)免疫組化法檢測(cè)胰腺癌中MUM1的表達(dá)水平可用于臨床及病理診斷，為胰腺癌的診治提供新思路和研究方向，為評(píng)估胰腺癌的預(yù)后提供可靠的依據(jù)，以期達(dá)到改善胰腺癌患者的預(yù)后及生存質(zhì)量。