仵紅嬌，劉春玲，金 葉，李 昂，吳鳳君，謝俞寧，張 志，張雪梅

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌死亡人數(shù)約180萬例，占惡性腫瘤死亡的18%[2]。我國每年肺癌新發(fā)病例約78.7萬人，因肺癌死亡人數(shù)約63.1萬人[3]。肺癌分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)兩種組織學(xué)類型，其中NSCLC以肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鱗狀細胞癌(lung squamous carcinoma,LUSC)為主。與SCLC相比，NSCLC細胞生長分裂較慢，擴散轉(zhuǎn)移相對較晚。近年，肺癌的治療雖然取得了一定進展，但其預(yù)后仍不樂觀[4]。WASF1可影響腫瘤細胞的侵襲和遷移，在前列腺癌[5]、黑色素瘤[6]和血癌細胞[7]等多種腫瘤細胞中高表達。目前，WASF1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其潛在的分子機制尚不清楚。本文通過生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實驗相結(jié)合，分析WASF1在NSCLC中的表達及其對NSCLC患者預(yù)后的影響，并探討其可能存在的分子機制，為NSCLC的診治及預(yù)后判斷提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015～2016年華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院存檔的NSCLC組織和癌旁正常組織30對，用于qRT-PCR實驗。收集2018～2019年華北理工大學(xué)附屬唐山市人民醫(yī)院存檔的NSCLC組織和癌旁正常組織30對，用于免疫組化實驗。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)庫分析NSCLC組織中WASF1 mRNA表達與預(yù)后的關(guān)系 通過R語言limma軟件對TCGA數(shù)據(jù)庫NSCLC(LUAD和LUSC)中WASF1 mRNA表達進行差異分析。使用TIMER數(shù)據(jù)庫[8-10]中Diff Exp模塊，評估NSCLC癌組織和癌旁正常組織中WASF1 mRNA表達水平的差異。使用OncoLnc在線數(shù)據(jù)庫[11]分析WASF1 mRNA表達水平對NSCLC患者總生存期(overall survival,OS)的影響。

1.2.2腫瘤免疫細胞浸潤分析 TIMER是利用immunedeconv[12]R軟件集成了包括TIMER、x Cell、MCP、CIBERSORT、EPIC和quan TIseq等算法，綜合使用以上算法對TCGARNA-Seq表達譜數(shù)據(jù)檢測腫瘤組織中免疫細胞的浸潤情況[13-14]。本實驗使用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫中的Gene模塊分析NSCLC中WASF1 mRNA表達與免疫細胞類型以及腫瘤純度的相關(guān)性；使用SCNA模塊探討WASF1拷貝數(shù)與腫瘤免疫細胞浸潤的關(guān)系[15]；使用Survival模塊分析臨床結(jié)局和免疫細胞浸潤或WASF1 mRNA表達之間的關(guān)系。

1.2.3GSEA富集分析 使用GSEA軟件進行基因富集分析[16]，分析WASF1基因可能參與的信號通路。將置換檢驗中的隨機抽取次數(shù)設(shè)定為1 000，其它參數(shù)均設(shè)為默認值。將|NES|>1.0、NOM p-val<0.05、FDR q-val<0.25的基因集，作為顯著富集基因集。

1.2.4RNA提取和qRT-PCR檢測 采用Trizol法(Thermo Fisher Scientific,NY,USA)從細胞中提取總RNA，使用RevertAid First Strand cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific,NY,USA)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用7900HT Fast Real-time PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR反應(yīng)。WASF1引物序列：上游5′-AAACAAGACCTCAGACATACGTG-3′；下游5′-CTCAGCTCTAGTCAGAAGCTCA-3′。內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5′-ACAACTTTGGTATCGTG GAAGG-3′；下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。PCR反應(yīng)體系為8 μL，包括4 μL PowerUp SYBR Green Master Mix，10 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，cDNA 0.5 μL(約100 ng)，加去離子水補足至8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸30 s，合計42個循環(huán)。

1.2.5免疫組化 采用免疫組化SP兩步法進行染色，組織切片60 ℃烤片2 h，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，將組織切片浸泡在預(yù)熱的修復(fù)液中15 min。PBS沖洗，加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min。PBS沖洗，1% BSA封閉，加入兔抗人WASF1多克隆抗體(北京博奧森生物公司)，于37 ℃孵育60 min。加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，DAB顯色。切片經(jīng)PBS沖洗后，用蘇木精對細胞核復(fù)染，分化、沖洗返藍。乙醇脫水，中性樹膠封固，鏡下觀察并拍照。

1.3 結(jié)果判斷(1)根據(jù)陽性細胞百分比進行計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分。(2)根據(jù)陽性細胞的染色強度進行計分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：≥3分者為陽性，<3分者為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 23.0及Graph Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。使用配對t檢驗分析癌組織和癌旁正常組織配對樣本W(wǎng)ASF1的表達差異。采用Wilcoxon秩和檢驗分析TIMER數(shù)據(jù)庫中WASF1 mRNA的表達差異，以及拷貝數(shù)變異對免疫細胞浸潤的影響。通過R語言“Survival”中的coxph函數(shù)進行Cox回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC和癌旁正常組織中WASF1 mRNA和蛋白表達使用R語言limma軟件對535例LUAD組織和59例癌旁正常組織以及502例LUSC組織和49例癌旁正常組織中WASF1 mRNA表達進行差異分析，結(jié)果顯示W(wǎng)ASF1 mRNA在LUAD和LUSC中的表達均高于癌旁正常組織(P<0.05，圖1A、B)。配對LUAD、LUSC組織和對應(yīng)癌旁正常組織分別有59對和49對。對其WASF1 mRNA表達進行分析，發(fā)現(xiàn)WASF1 mRNA在LUAD和LUSC中的表達均高于匹配的癌旁正常組織(P<0.05，圖1C、D)。使用TIMER數(shù)據(jù)庫評估WASF1 mRNA在多種腫瘤和正常組織中的表達，結(jié)果顯示：WASF1 mRNA在LUAD和LUSC中的表達均高于癌旁正常組織(P<0.001,圖1E)。

圖1 非小細胞肺癌和癌旁正常組織中WASF1 mRNA的表達：A.TCGA-肺腺癌；B.TCGA-肺鱗狀細胞癌；C.TCGA-肺腺癌配對組織；D.TCGA-肺鱗狀細胞癌配對組織；E.TIMER數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

本實驗通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，WASF1蛋白在NSCLC組織中的陽性率(70%，21/30)顯著高于癌旁正常NSCLC組織(30%，9/30)(圖2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.279，P=0.001)。采用qRT-PCR檢測30對NSCLC和癌旁正常組織中WASF1 mRNA表達水平，結(jié)果顯示NSCLC組織中WASF1 mRNA表達(1.46±0.48)顯著高于癌旁正常組織(1.00±0.38)(P<0.001，圖3A)。

圖2 WASF1蛋白在不同肺組織中的表達：A.WASF1蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達；B.WASF1蛋白在癌旁正常組織中的表達，SP兩步法

2.2 WASF1 mRNA表達與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系使用OncoLnc數(shù)據(jù)庫分析WASF1 mRNA表達與NSCLC(LUAD和LUSC)患者預(yù)后的關(guān)系，根據(jù)WASF1 mRNA表達水平的中位數(shù)將LUAD和LUSC患者分為WASF1 mRNA高表達組和低表達組。結(jié)果顯示W(wǎng)ASF1 mRNA表達水平影響LUAD和LUSC患者的OS，WASF1 mRNA高表達組LUAD患者的OS顯著低于WASF1 mRNA低表達組(HR=1.41，95%CI=1.05～1.89，P=0.024，圖3B)，而WASF1 mRNA高表達LUSC患者的OS高于WASF1 mRNA低表達LUSC患者的OS(HR=0.68，95%CI=0.52～0.89，P=0.005，圖3C)。

圖3 WASF1 mRNA表達及其與非小細胞肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性：A.qRT-PCR檢測WASF1 mRNA在非小細胞肺癌及癌旁正常組織中的表達；B.WASF1 mRNA表達與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系；C.WASF1 mRNA表達與肺鱗狀細胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.3 NSCLC中WASF1 mRNA表達與免疫細胞浸潤的關(guān)系TIMER分析結(jié)果顯示，LUAD中WASF1 mRNA表達與細胞純度、B細胞、CD8+T細胞和CD4+T細胞的免疫浸潤水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)；與巨噬細胞(r=0.131，P<0.01)、中性粒細胞(r=0.207，P<0.01)和樹突狀細胞(r=0.093，P<0.05)的免疫浸潤水平呈正相關(guān)。LUSC中WASF1 mRNA表達對B細胞的免疫浸潤水平無影響(P>0.05)；與細胞純度(r=0.275，P<0.01)呈正相關(guān)；與CD8+T細胞(r=-0.138，P<0.01)、CD4+T細胞(r=-0.132，P<0.01)、巨噬細胞(r=-0.149，P<0.01)、中性粒細胞(r=-0.247，P<0.01)和樹突狀細胞(r=-0.186，P<0.01)的免疫浸潤水平呈負相關(guān)(圖4A)。進一步評估浸潤的免疫細胞對NSCLC患者臨床預(yù)后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：B細胞(Log-rankP<0.001)和樹突狀細胞(Log-rankP=0.048)浸潤水平較高的LUAD患者存活時間越長，預(yù)后越好(圖4B)；其中B細胞還可以作為LUAD獨立預(yù)后因素(表1)；而浸潤的免疫細胞對LUSC患者預(yù)后無影響(P>0.05，表2)。本實驗亦發(fā)現(xiàn)LUAD中WASF1的拷貝數(shù)變異對B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平有影響，LUSC中WASF1的拷貝數(shù)變異對B細胞、CD4+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平有影響(圖4C)。以上結(jié)果提示，WASF1有可能參與NSCLC細胞的免疫浸潤過程。

表1 Cox多因素分析WASF1表達與肺腺癌總生存率相關(guān)的免疫細胞

表2 Cox多因素分析WASF1表達與肺鱗狀細胞癌總生存率相關(guān)的免疫細胞

圖4 WASF1表達與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤之間的相關(guān)性：A.WASF1 mRNA在非小細胞肺癌中的表達與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性；B.免疫細胞對非小細胞肺癌患者臨床預(yù)后的影響；C.非小細胞肺癌中WASF1的拷貝數(shù)變異對免疫細胞浸潤水平的影響

2.4 WASF1相關(guān)通路富集分析對WASF1可能富集的相關(guān)信號通路進行分析，結(jié)果顯示：與LUAD和LUSC中WASF1高表達相關(guān)的基因均富集于細胞周期、核苷酸切除修復(fù)和DNA復(fù)制等信號通路(圖5)；提示W(wǎng)ASF1基因可能參與NSCLC發(fā)生、發(fā)展的多個生物學(xué)過程。

圖5 GSEA富集分析WASF1調(diào)控的相關(guān)通路：A.WASF1在肺腺癌中的富集通路；B.WASF1在肺鱗狀細胞癌中的富集通路

3 討論

WASF1在細胞運動中起重要作用，參與細胞的變形和遷移[17]，是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。研究發(fā)現(xiàn)，WASF1在前列腺癌細胞和組織中均高表達，敲除WASF1后前列腺癌細胞侵襲性顯著降低[5]。WASF1在白血病細胞系中過表達，通過影響B(tài)CL-2的磷酸化水平及其在線粒體的定位對細胞凋亡起負調(diào)控作用[7]。WASF1可通過調(diào)控MMP家族蛋白，促進膠質(zhì)瘤細胞向周圍腦實質(zhì)轉(zhuǎn)移和浸潤。WASF1在上皮性卵巢癌中高表達且與預(yù)后不良相關(guān)，WASF1可作為上皮性卵巢癌的獨立預(yù)后因子[18]。WASF1在卵巢癌組織中亦呈高表達，且參與K562細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程。WASF1是連接Cdc42和肌動蛋白細胞骨架的下游分子，可以通過調(diào)節(jié)細胞背側(cè)皺褶的形成和細胞外基質(zhì)的降解，參與腫瘤的惡性進程[19]。WASF1在NSCLC組織中表達上調(diào)，在不同TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達有差異[20]。本實驗通過生物信息分析和分子生物學(xué)實驗，進一步驗證WASF1在NSCLC中高表達與患者預(yù)后有關(guān)，與文獻報道一致，提示W(wǎng)ASF1基因可作為NSCLC的預(yù)后生物學(xué)標志物。

近年，腫瘤微環(huán)境的免疫逃逸機制及免疫療法在腫瘤治療中起越來越重要的作用[21]。肺癌中浸潤的免疫細胞可能是預(yù)后和免疫治療反應(yīng)的重要決定因素，有望成為藥物的有效靶點[22]。記憶B細胞缺乏或M0巨噬細胞數(shù)量增加與LUAD早期預(yù)后不良有關(guān)。在LUSC中，T濾泡輔助細胞與良好的預(yù)后相關(guān)，而中性粒細胞數(shù)量的增加預(yù)示患者預(yù)后不良[23]。本實驗發(fā)現(xiàn)，LUAD和LUSC中WASF1 mRNA表達水平與多種免疫細胞的免疫浸潤水平相關(guān)。

最近，有研究報道免疫細胞浸潤對NSCLC的臨床和預(yù)后具有重要作用，將免疫細胞浸潤作為特征納入預(yù)后模型，有助于臨床醫(yī)師對患者的預(yù)后進行更可靠和準確的預(yù)測[23]。腫瘤相關(guān)B細胞可以協(xié)調(diào)并維持黑色素瘤炎癥，可能是生存和免疫檢查點阻斷治療反應(yīng)的預(yù)測因子[24]。本實驗發(fā)現(xiàn)B細胞浸潤可以作為LUAD的獨立預(yù)后因素，顯著影響LUAD患者的預(yù)后。此外，WASF1的拷貝數(shù)變異對多種免疫細胞的浸潤水平都有影響。這些結(jié)果提示，WASF1可能通過影響免疫細胞與腫瘤細胞的相互作用，從而調(diào)控NSCLC的進展。研究發(fā)現(xiàn)，WASF1是重要的促自噬蛋白，通過Beclin 1/BCL-2和Beclin 1/pi3k-Ⅲ復(fù)合依賴性途徑，可能提高白血病細胞的存活率和調(diào)節(jié)化療耐藥[25]。WASF1在ASK1/JNK依賴性途徑中調(diào)節(jié)BCL-2磷酸化，從而調(diào)節(jié)線粒體ROS水平和ER Ca2+穩(wěn)態(tài)[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)，WASF1可能參與細胞周期、核苷酸切除修復(fù)和DNA復(fù)制等信號通路從而影響NSCLC的進展。以上研究為進一步探索WASF1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的分子機制提供了基礎(chǔ)。研究肺癌發(fā)生的分子機制，特別是癌變過程的分子機制，對于提高肺癌早期診斷，降低肺癌發(fā)病率和病死率具有重要意義[26]。

綜上所述，NSCLC組織中WASF1高表達，影響患者的OS。WASF1 mRNA表達和拷貝數(shù)變異可影響多種免疫細胞浸潤水平，其可能在免疫浸潤細胞中發(fā)揮重要作用，并參與細胞周期調(diào)控等相關(guān)通路。為進一步闡明WASF1在NSCLC中的功能和作用，還需分子生物學(xué)實驗進行驗證和分析。