張 旭, 蘇世平, 師微檸, Alizet Didi Dom, 馬 強(qiáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)， 甘肅 蘭州 730070)

紅砂(Reaumuriasoongorica)隸屬于檉柳科(Tamari-caceae)石竹亞綱(Caryophyllidae)[1]，主要分布于亞歐大陸(中亞)、南歐和北非，共有21種，亞洲有18種，我國(guó)分布有4種，多產(chǎn)自內(nèi)蒙古和西北地區(qū)[2]。紅砂是我國(guó)干旱荒漠區(qū)分布最廣的植物種之一，也是荒漠化、半荒漠化地區(qū)防風(fēng)固沙和水土保持的優(yōu)良灌木樹種，和荒漠綠洲與荒漠過渡帶的重要植被類型，其具有抗旱、耐旱、耐鹽堿及很強(qiáng)的集沙固沙能力[3-4]。

近年來(lái)，由于干旱和高溫等極端氣候的頻發(fā)，導(dǎo)致紅砂種子繁殖困難，長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖導(dǎo)致遺傳多樣性降低[5]，因此探討紅砂種群的遺傳變異規(guī)律尤為重要，為其遺傳資源的保護(hù)和評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。李秀玲等[6]運(yùn)用空間自相關(guān)對(duì)我國(guó)西北地區(qū)的28個(gè)紅砂種群進(jìn)行空間分布的研究，結(jié)果表明紅砂種群的空間分布模式為隨機(jī)分布。徐莉等[7]應(yīng)用了RAPD分子標(biāo)記，15對(duì)引物對(duì)分布于新疆阜康荒漠7個(gè)亞群的136株紅砂進(jìn)行擴(kuò)增。Shannon多樣性指數(shù)(0.307)和居群間遺傳分化系數(shù)(0.312)揭示了紅砂的遺傳變異多存在于亞種群內(nèi)，亞種群間的遺傳分化較小。殷恒霞等[8]采用磁珠富集法構(gòu)建了紅砂基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)，分析得出微衛(wèi)星重復(fù)基元顯示為5種類型，其中三堿基基元(GGT)n,(TGG)n,(ACC)n最多，占總數(shù)的60.7%。楊九艷等[9]運(yùn)用ISSR對(duì)內(nèi)蒙古高原荒漠區(qū)紅砂居群的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明紅砂居群間有高度的遺傳分化。張穎娟等[10]應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記對(duì)內(nèi)蒙古西部紅砂種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明不同生境下紅砂種群內(nèi)存在較高的遺傳多樣性，聚類分析表明遺傳距離與地理距離之間存在一定相關(guān)性。

本研究基于前人的研究基礎(chǔ)，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記對(duì)來(lái)源于不同區(qū)域的16個(gè)紅砂居群進(jìn)行多樣性水平評(píng)估及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，從分子水平上探究紅砂居群的遺傳規(guī)律，以期為紅砂的合理利用及有效保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。盡管在紅砂遺傳多樣性研究進(jìn)展中有相關(guān)研究，但是都基于小地域，而對(duì)全國(guó)大地域分布區(qū)的研究報(bào)道較少[11-14]。應(yīng)用的SSR分子標(biāo)記具有高度重復(fù)性，豐富多態(tài)性及共顯性的優(yōu)點(diǎn)，為目前應(yīng)用比較廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)[15]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2011年11月在我國(guó)甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古的紅砂天然分布區(qū)的各居群中，隨機(jī)選取紅砂植株并采集種子，標(biāo)記、分裝；2012年1月在武威市林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心苗圃利用所采集的種子進(jìn)行穴盤育苗；2013年4月土壤解凍后進(jìn)行移栽，并按常規(guī)方法進(jìn)行育苗期管理，建立了位于武威市涼州區(qū)下雙鎮(zhèn)國(guó)家樟子松基地向北1 000米的紅砂試驗(yàn)地。本研究實(shí)驗(yàn)材料均取自該試驗(yàn)基地。

表1 供試材料紅砂不同居群信息Table 1 Information of different populations of R. Soongorica

1.2 DNA提取及擴(kuò)增

用磁珠法基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)根據(jù)產(chǎn)品說明按步驟進(jìn)行總DNA的提取。從96對(duì)引物中篩選出11對(duì)多態(tài)性較高的引物(SSR引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成)用于PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為15 μL：2×Taq PCR Master Mix7.5 μL，Mix primer(引物混合液)2.0 μL,DNA template 1 μL,ddH2O 4.5 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，52℃～62℃退火30 s，72℃延伸30 s,共10個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,共22～25個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min;4℃保存[11-12]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過群體遺傳學(xué)軟件GeneAlex6.41計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、觀察雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、基因分化系數(shù)(Fst)、基因流(Gene Flow,Nm)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)等[16]；并對(duì)群體間進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)[17-18]、居群間的遺傳距離(Nei′s Genetic Distance,D)和遺傳一致度(Nei′s Genetic Identity,GI)[19]。基于Nei′s遺傳距離，用Phylip軟件構(gòu)建UPGMA聚類圖[20]。

有效等位基因數(shù)為純合度的倒數(shù)，是反應(yīng)群體遺傳變異大小的指標(biāo)之一，其值越接近等位基因數(shù)的絕對(duì)值，表明等位基因在群體中分布越均勻[21]。式中，Pi為第i個(gè)位點(diǎn)上等位基因出現(xiàn)的頻率。

Ne=1/1-He

香農(nóng)信息指數(shù)用于估算居群內(nèi)的遺傳分化,指數(shù)越大居群間或居群內(nèi)的分化程度越高，且遺傳多樣性越高[22]。

I=-∑pilnpi

期望雜合度(Expected heterozygosity,He)，根據(jù)每個(gè)等位基因的基因頻率計(jì)算，期望雜合度的值越高，表明物種多態(tài)性越高[23]。

多態(tài)信息含量指數(shù)用來(lái)衡量基因座多態(tài)性高低的程度[24]。式中，n代表的是樣本中序列的數(shù)量。

自然群體并非是理想群體，如果僅考慮單基因座上一對(duì)等位基因，對(duì)于由若干個(gè)地方群體組成的生物大群體，各層次現(xiàn)實(shí)群體中基因型頻率期望值偏差一般用Fst度量。計(jì)算公式如下[25]：

式中，群體內(nèi)平均雜合度(The mean Heterozygosity within Populations,Hs),為各個(gè)居群的期望雜合度的算數(shù)平方根。

整體期望雜合度(Total Expected Heterozygosity,HT)的計(jì)算公式如下：

基因流代表等位基因從一個(gè)居群到另一個(gè)居群間的轉(zhuǎn)移?；蛄鞔笥?，就能發(fā)揮均質(zhì)化作用，能有效抑制有遺傳漂變而引起的遺傳分化[26]。

Nm=[(1/FST)-1]/4

2 結(jié)果與分析

2.1 位點(diǎn)多態(tài)性評(píng)估

11對(duì)引物擴(kuò)增出67個(gè)等位基因，其中多態(tài)等位基因?yàn)?6個(gè)，多態(tài)率為83.58%。擴(kuò)增長(zhǎng)度為126～396 bp，位點(diǎn)ReS078上擴(kuò)增出的等位基因數(shù)最多，位點(diǎn)ReS008最少。多態(tài)含量指數(shù)為0.061～0.910，均值為0.396，位點(diǎn)ReS078的多態(tài)含量指數(shù)(0.910)為最高，位點(diǎn)ReS008的PIC指數(shù)(0.061)為最低。紅砂基因位點(diǎn)的多態(tài)性水平為中度多態(tài)性(表2)。

2.2 居群多樣性分析

所測(cè)紅砂居群的等位基因數(shù)為2.364～4.455，均值為3.735，有效等位基因數(shù)為1.504～2.585，均值為2.221，結(jié)果顯示居群的觀測(cè)等位基因數(shù)均高于有效等位基因數(shù)(表3)。其中居群THCY的Na(4.455)和Ne(2.585)為最高，居群MQXX的Na(2.364)和Ne(1.504)為最低。觀測(cè)雜合度為0.295～0.418，均值為0.358。居群LZ的Ho(0.418)為最高，表明該居群內(nèi)雜合子占比為41.8%；MQXX的Ho(0.286)為最低，說明該居群內(nèi)純合子占比較多。居群觀測(cè)雜合度和期望雜合度均小于0.5。僅有MQXX觀測(cè)雜合度大于期望雜合度，在該居群內(nèi)存在雜合度缺失的現(xiàn)象。香農(nóng)信息指數(shù)為0.420～0.873，均值為0.763，說明居群內(nèi)的遺傳分化程度低，按照香農(nóng)多樣性指數(shù)評(píng)估紅砂居群的遺傳多樣性水平：THCY,ZZG>LZ>NMYH>QYS>HSZ>WWYH>MJW>SSC>BYHT>HG>XGG>SGK>WD>SMY>MQXX。

表2 11對(duì)引物多樣性評(píng)估Table 2 Diversity Evaluation of 11 pairs of primers

表3 居群各項(xiàng)多樣性參數(shù)(均值)Table 3 Values of population diversity parameters(Mean value)

2.3 遺傳分化及基因流

紅砂整體近交系數(shù)為-0.026～0.548，整體表現(xiàn)為近親交配，但在地方亞群內(nèi)存在異交現(xiàn)象(表4)。居群間遺傳分化系數(shù)為0.041～0.21，平均值為0.088，說明居群間遺傳分化程度較低。AMOVA結(jié)果表明，居群間的遺傳差異占變異總來(lái)源的5.8%，個(gè)體間占14.8%，個(gè)體內(nèi)的遺傳差異占79.4%，得出紅砂的遺傳變異材料主要來(lái)源于紅砂個(gè)體內(nèi)。各居群基因交流為0.940～5.807，平均值為3.163，該結(jié)果表明所測(cè)紅砂居群間有較強(qiáng)的基因交流。

表4 各位點(diǎn)F-Statistics統(tǒng)計(jì)值和基因流Table 4 Each point F-statistics Statistics and gene flow

2.4 遺傳結(jié)構(gòu)及Mantel檢測(cè)

紅砂居群間的遺傳距離為0.009～0.229，均值為0.062，遺傳距離最近的居群是WD和SMY，最遠(yuǎn)的居群是MQXX和HG(表5)。遺傳距離小于0.1的居群占總數(shù)的76.7%，大于0.1的占總數(shù)的23.3%，表明所測(cè)紅砂居群間的遺傳距離相近。居群間遺傳一致度為0.795～0.983，均值為0.933，其中遺傳相似性最大的居群是WD和SMY，最小的是MQXX和HG。Mantel檢測(cè)(圖1)得出紅砂居群的遺傳距離和地理距離顯著性相關(guān)(R2=0.3254,P=0.02<0.05)。

表5 遺傳距離(左下)和遺傳一致度(右上)Table 5 Enetic Distance (Lower left) and Genetic Identity (Upper right)

圖1 遺傳距離與地理距離的Mantel檢測(cè)Fig.1 Mantel test of Genetic distance and geographical distance

2.5 聚類分析及PCoA主成分分析

基于紅砂居群間的遺傳距離并采用UPGMA進(jìn)行聚類(圖2)。SSC,SGK,WD,SMY,THCY,BYHT,NMYH,MJW,QYS,WWYH,ZZG被聚為一類；然后和MQXX聚成第二類；和HSZ聚為第三類；再和XGG,HG聚為第四類；最后和遺傳距離較遠(yuǎn)的LZ聚為第五類。PCoA分析結(jié)果(圖3)將紅砂居群被分為5個(gè)部分。第一部分為HG,XGG；第二部分為NMYH；第三部分為L(zhǎng)Z；第四部分為MQXX；其余居群為第五部分。PCoA與UPGMA聚類結(jié)果基本一致。

圖2 不同居群紅砂UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA clustering diagram of R. soongorica in different cohabitation groups

圖3 不同居群的PCoA分析Fig.3 PCoA analysis of different populations

2.6 STRUCTURE結(jié)構(gòu)分析

當(dāng)K=2時(shí)，299份材料被分為2個(gè)亞群；當(dāng)K=3時(shí)，能將MQXX,HSZ和XGG,HG區(qū)分開；模擬k值2～20，得出的最大似然值為5，說明299份紅砂材料被分為5個(gè)亞群(圖4)。第Ⅰ亞群(綠色)共75份材料，占總數(shù)的25%，第Ⅱ亞群(藍(lán)色)共75份紅砂，占總體的25%，第Ⅲ亞群(粉色)包含66份材料，占總數(shù)的22.1%，第Ⅳ亞群(橙色)包含材料56份，占比為18.7%。第Ⅴ亞群(黃色)共27份，占比為9%。聚類分析將299份材料分為5個(gè)亞群(圖5)，第Ⅰ類中LZ為4份，THCY,HSZ各3份，ZZG,MJW,SSC,QYS,SGK各2份。第Ⅱ類中與XGG,HG(占總數(shù)37.8%)分在一起的有46份材料，各占比為NMYH(9.2%),WWYH(7.8%),THCY(6.5%)。第Ⅲ類以MJW為主共計(jì)聚類23份材料。第Ⅳ類共有76份紅砂材料，其中ZZG(13.1%)，HSZ(15.7%)，NMYH(9.2%)，SSC(9.2%)聚在一起。第Ⅴ類共有106份紅砂材料，占比為MQXX(15%)，SMY(13.2%)，WD(11.3%)，BYHT和SGK(各為8.4%)，THCY,SSC和QYS(各占6.6%),NMYH,ZZG(各占5.6%),MJW(4.7%),WWYH(2.8%),HSZ(1.8%),XGG(0.9%)。利用聚類分析校對(duì)了紅砂的亞群分類，兩者結(jié)果顯示299份紅砂材料被分為5個(gè)亞群。

圖4 不同k值的遺傳結(jié)構(gòu)與Δk值的折線圖Fig.4 Genetic structure of different K values and the magnitude of Δk

圖5 299份紅砂材料的聚類分析Fig.5 Clustering results of 299 R. Soongorica materials

3 討論

3.1 居群遺傳多樣性

本研究的11對(duì)引物能成功擴(kuò)增出3～9個(gè)等位基因，與張穎娟[10]和馮亮亮[14]的研究結(jié)果大致相同。等位基因多態(tài)率為83.58%，多態(tài)信息含量指數(shù)為0.395，得出紅砂的基因位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性，在今后的育種工作中可以利用該物種豐富的遺傳材料，通過雜交、篩選等方法獲得生態(tài)效益更高的紅砂品種[27]。紅砂居群的等位基因數(shù)均高于有效等位基因數(shù)，表明紅砂的等位基因在染色體上分布不均勻，紅砂居群在雜交過程中有明顯的、通過染色體較大片段而進(jìn)行遺傳傳遞的現(xiàn)象。該現(xiàn)象可能會(huì)導(dǎo)致在遺傳時(shí)發(fā)生后代遺傳信息偏親遺傳的現(xiàn)象[28]。基因雜合度是衡量居群遺傳變異的參數(shù)之一[29]。經(jīng)研究表明紅砂居群的雜合度均較低，其中居群MQXX的觀測(cè)雜合度(0.286)最低，表明該居群內(nèi)雜合率低，在雜交過程中產(chǎn)生的雜合度丟失的現(xiàn)象[30]，推測(cè)產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因與紅砂的繁殖特性有關(guān)，位于干旱、沙化生境的成熟階段的紅砂居群主要以無(wú)性繁殖為主[3]，而該紅砂分布區(qū)常年高溫少雨、干旱[31]，因此居群內(nèi)主要以根基劈裂和不定根的方式進(jìn)行繁殖，使紅砂居群內(nèi)雜合度缺失及分化程度降低，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)性降低。本研究表明地方內(nèi)紅砂居群有一定程度的異交，這種交配所產(chǎn)生的后代具有雜合基因型。雜合基因型是產(chǎn)生基因交換、重組和產(chǎn)生新基因型的基礎(chǔ)，這種交配方式的存在，提高了紅砂居群內(nèi)的基因雜合度，在紅砂的進(jìn)化過程中為其創(chuàng)造更廣泛的遺傳變異材料[32-33]。分化系數(shù)是從兩個(gè)地方群體中任意抽取兩個(gè)配子是同源的概率，可以度量紅砂居群間的遺傳分化程度[34]。結(jié)果表明紅砂居群間的遺傳分化主要來(lái)源于個(gè)體內(nèi)DNA堿基序列的差異，AMOVA分析表明居群間遺傳變異僅占遺傳總材料的5.8%,這種結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[10,35]。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)

本研究表明WD和SMY的遺傳距離最近(0.007)，MQXX和HG的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.229)，Mantel檢測(cè)得出紅砂居群的遺傳距離和地理距離顯著相關(guān)(R2=0.3254,P=0.02<0.05)，由此類現(xiàn)象推測(cè)出可能隨著物種的進(jìn)化所產(chǎn)生的地理隔離現(xiàn)象，經(jīng)歷不同的自然選擇、不同的進(jìn)化方向、進(jìn)而產(chǎn)生種內(nèi)差異而形成的地理小種[36-37]。聚類分析表明，來(lái)自騰格里沙漠東南邊沿的SSC,SGK,WD,SMY,THCY,BYHT,NMYH,MJW,QYS被聚在第一類，這些居群在地理位置上較為集中，并且在紅砂散粉期[38](7-8月)受中國(guó)夏季風(fēng)的影響[39](風(fēng)向由南向北，為夏季風(fēng)盛行期)，導(dǎo)致這些居群間有較頻繁的基因交流，這種現(xiàn)象表明臨近紅砂居群間可以通過風(fēng)媒促進(jìn)居群間的基因交流，從而改變居群內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)及富集基因庫(kù)。來(lái)源于祁連山中段的LZ居群在遺傳結(jié)構(gòu)上其他居群分化明顯，推測(cè)該現(xiàn)象是由于地理分布不同引起的種間差異[40]，郝曉莉等[41]的研究結(jié)果表明五柱紅砂(R.kaschgaricaRupr.)分布延伸至祁連山中段，因此LZ和其他居群的差異極有可能是由屬內(nèi)的不同種間引起的。居群QYS和MJW間的基因交流較頻繁、遺傳分化較小，極有可能是居群間能夠自由交配的兩個(gè)亞群，基因流在居群間是隨機(jī)的、均一的，使得居群間相似性變大，進(jìn)而導(dǎo)致居群間表現(xiàn)為基因頻率和基因型頻率的哈迪-溫伯格平衡[42]?；蛄魅趸俗匀贿x擇和遺傳漂變的作用，使居群間趨于一致，更有助于紅砂群體內(nèi)部能夠穩(wěn)定的生存和發(fā)育[43]。引物不能很好的區(qū)分THCY和BYHT，想要進(jìn)一步了解紅砂居群的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，需開發(fā)鑒別性更高的引物或在此基礎(chǔ)上增加其他引物[44]。通過種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，可有效降低資源利用過程中的盲目性。基于不同居群遺傳結(jié)構(gòu)表明，XGG,HSZ與其他居群遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，居群內(nèi)遺傳多樣性豐富，在進(jìn)行紅砂雜交組合選擇時(shí)，可利用這2個(gè)居群的材料與其他材料進(jìn)行組配，從而為育種工作者親本選配提供科學(xué)依據(jù)[45]。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)16個(gè)不同地理來(lái)源的紅砂居群進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析。研究結(jié)論得出紅砂的基因多態(tài)性為中度，等位基因不均勻的分布在染色體上。觀測(cè)雜合度和F指數(shù)說明居群內(nèi)雜合度缺失，純合體過量。按照香農(nóng)多樣性指數(shù)評(píng)估紅砂居群遺傳多樣性水平：THCY,ZZG>LZ>NMYH>QYS>HSZ>WWYH>MJW>SSC>BYHT>HG>XGG>SGK>WD>SMY>MQXX。Fst指數(shù)表明居群間分化程度較低，且紅砂的遺傳變異主要來(lái)自源于個(gè)體內(nèi)DNA序列的不同。各居群間基因交流為3.163，說明居群間有較頻繁的基因交流。Mantel檢測(cè)得出遺傳距離和地理距離顯著相關(guān)。UPGMA將16個(gè)紅砂居群分為5大類，聚類分析表明居群間的基因交流是影響居群聚類的重要因素。STRUCTURE結(jié)構(gòu)分析將材料分為5個(gè)亞群。各亞群中，第Ⅴ亞群內(nèi)的紅砂個(gè)體血統(tǒng)較為純正，第Ⅱ亞群內(nèi)的紅砂個(gè)體血統(tǒng)混雜。