姚馨悅，吉佳樂，葉雙慧，趙慶寧，何志承

在病理制片過程中常會遇到骨組織或鈣化組織，由于其含有豐富的骨鹽，導致制片效果不佳，需使用脫鈣液進行脫鈣預處理。在日常工作中，對脫鈣液的要求包括：脫鈣時間短，能較好地保存骨組織形態(tài)以及各類抗原等。目前，各實驗室常用的脫鈣液效果參差不齊，影響病理診斷的準確性。因此，迫切需要一種較為理想的脫鈣條件應用于日常骨組織的處理。根據以往研究結果[1-3]，本實驗將10%EDTA、5%鹽酸氯化鈉、5%硝酸甲醛、5%鹽酸甲醛4種脫鈣液進行對比，分別在室溫靜置、超聲、微波條件下對脫鈣時間及效果進行分析，以期摸索出更為適合日常骨組織處理的脫鈣液及使用條件。

1 材料與方法

1.1 組織標本選取陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院送檢的骨組織8例，每例分別用骨鋸切成大小1 cm×1 cm×0.3 cm的骨塊12個，經10%中性福爾馬林固定24 h，用于后續(xù)脫鈣實驗。

1.2 脫鈣液10%EDTA脫鈣液：購于赫特生物公司。5%鹽酸氯化鈉脫鈣液：5 mL HCl，15 g NaCl，蒸餾水加至100 mL。5%硝酸甲醛脫鈣液：10%中性福爾馬林10 mL，硝酸5 mL，蒸餾水加至100 mL。5%鹽酸甲醛脫鈣液：10%中性福爾馬林10 mL，濃鹽酸5 mL、蒸餾水加至100 mL。

1.3 主要儀器Leica 2245石蠟切片機，Leica AacadiaH全自動包埋機，Leica ASP300S脫水機，Leica Autostainer XLST5010自動染色機，昆山KQ-500DV型數控超聲波清洗器，格蘭仕P70D20TL-D4型微波爐。

1.4 方法

1.4.1實驗分組 將所有組織標本分為三組，并按照不同條件進行脫鈣：第一組為室溫靜置脫鈣；第二組為微波脫鈣；第三組為超聲脫鈣。

1.4.2脫鈣方法 (1)第一組：室溫下將標本分別放入裝有4種脫鈣液的燒杯中靜置，每隔12 h換1次脫鈣液，直至脫鈣終點。(2)第二組：將標本分別置于4個試管內，再分別加入4種脫鈣液。將試管放入裝有250 mL蒸餾水的500 mL燒杯中，并將微波爐調至最低檔(輸出功率120 W)，脫鈣5 min后取出，更換燒杯中的水，室溫條件下降溫2 min，再重復上述步驟脫鈣5 min，震蕩混勻脫鈣液，每隔30 min換1次脫鈣液，直至微波處理累積90 min，最后靜置至脫鈣終點。(3)第三組：將標本分別放置于裝有4種脫鈣液的燒瓶中，并放入超聲波清洗器中進行超聲脫鈣(超聲頻率40 KHZ)，脫鈣5 min，靜置2 min(脫鈣時間與微波組相同)，繼續(xù)置入超聲儀中處理5 min，每隔30 min換1次脫鈣液，直至超聲累積處理90 min，再靜置至脫鈣終點。

1.4.3脫鈣終點判斷 脫鈣處理后，每隔12 h更換1次脫鈣液，每隔1 h觀察脫鈣情況，以大頭針能輕松刺進骨皮質作為脫鈣終點標志。

1.4.4脫鈣后處理 脫鈣后標本流水沖洗30 min，常規(guī)脫水，切片，行HE染色和免疫組化EnVision法染色檢測SATB2的表達，鏡下觀察組織的結構及染色情況。

2 結果

2.1 脫鈣時間比較4種脫鈣液脫鈣時間：5%硝酸甲醛脫鈣液<5%鹽酸甲醛液脫鈣液<5%鹽酸氯化鈉脫鈣液<10%EDTA脫鈣液。比較同一脫鈣液中的三種脫鈣處理條件：微波條件下耗時最短，超聲條件次之，室溫靜置最慢。結合以上兩種結果初步得出以下結論：工作中可選用5%硝酸甲醛脫鈣液，利用微波條件進行脫鈣，耗時最短(表1)。

表1 不同脫鈣液與脫鈣條件對脫鈣時間的影響

2.2 HE染色效果比較10%EDTA脫鈣液與5%硝酸甲醛脫鈣液處理后的骨組織脫鈣充分均勻，切片完整不易掉片，且切片無皺痕、無刀痕，鏡下見組織結構完整，骨板形態(tài)清晰，細胞核呈藍色，核仁清晰，核質對比鮮明(圖1A、B)。5%鹽酸甲醛脫鈣液效果稍次之，鏡下見組織結構完整，但部分核紅染、核質對比不佳(圖1C)。5%鹽酸氯化鈉脫鈣液效果最差，切片過程中部分組織有沙粒感，脫鈣不均勻，鏡下可明顯觀察到核染色發(fā)紅且結構不清(圖1D)。室溫靜置條件下脫鈣效果最好，微波、超聲條件均較好。比較分析4種HE染色結果顯示：10%EDTA脫鈣液與5%硝酸甲醛脫鈣液處理后的骨組織，HE染色效果最佳。

圖1 微波條件下經4種脫鈣液脫鈣的骨組織：A.10%EDTA脫鈣液脫鈣的骨組織；B.5%硝酸甲醛脫鈣液脫鈣的骨組織；C.5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣的骨組織；D.5%鹽酸氯化鈉脫鈣液脫鈣的骨組織 圖2 微波條件下經4種脫鈣液脫鈣的骨組織免疫組化染色：A.10%EDTA脫鈣液脫鈣的骨組織中SATB2的表達，EnVision法；B.5%硝酸甲醛脫鈣液脫鈣的骨組織中SATB2的表達，EnVision法；C.5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣的骨組織中SATB2的表達，EnVision法；D.5%鹽酸氯化鈉脫鈣液脫鈣的骨組織中SATB2的表達，EnVision法

2.3 免疫組化SATB2染色效果比較標本經4種脫鈣液脫鈣后行免疫組化染色，SATB2均陽性，其中10%EDTA脫鈣液(圖2A)與5%硝酸甲醛脫鈣液(圖2B)處理后的骨組織免疫組化染色效果最佳，陽性細胞表達明顯且定位準確，但也存在部分非特異性著色情況。5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣處理后免疫組化染色掉片較為嚴重(圖2C)，且存在部分非特異性著色；5%鹽酸氯化鈉脫鈣液脫鈣處理后免疫組化陽性信號較弱且輕微卷片(圖2D)。微波條件下效果最好，超聲次之，室溫靜置條件下相對最差。比較4種脫鈣液脫鈣后的免疫組化染色結果顯示：10%EDTA脫鈣液和5%硝酸甲醛脫鈣液處理后的骨組織SATB2染色效果最佳。

3 討論

組織內含有骨質或鈣化灶時，直接脫水包埋后切片質量差，故需先進行脫鈣處理，軟化組織后再進行脫水包埋切片。骨質由有機成分和無機成分組成，有機成分由90%膠原纖維和基質組成，無機成分由骨鹽組成，骨鹽是羥基磷灰石結晶，沉淀于纖維間，主要有鈣、鎂、磷等。脫鈣是指運用物理或者化學方法將骨組織標本中有機成分和骨鹽分離，通過去除鈣鹽從而獲得完整的膠原纖維組織和基質[4]，進而使組織變軟易于制片染色。在常規(guī)病理切片過程中，如果脫鈣液使用不正確會嚴重破壞組織結構和細胞形態(tài)，影響最終病理診斷的準確性。因此，尋找一種對組織破壞程度較小且脫鈣效率高的脫鈣液，對臨床病理診斷工作意義重大。

本實驗發(fā)現經5%鹽酸氯化鈉脫鈣液脫鈣后的組織，HE染色示細胞核發(fā)紅現象明顯，核結構不清，染色對比度差，且免疫組化染色SATB2表達效果不佳；而5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣后組織HE染色效果比5%鹽酸氯化鈉脫鈣液效果佳，結構更為完整。鹽酸是一元無機強酸，與骨組織中骨鹽結合可加速脫鈣。曹穎[1]實驗發(fā)現氯化鈉可降低溶液中離子的活度，導致骨組織中骨鹽(羥基磷灰石結晶)的溶解度增加、膠原纖維的酸解程度降低，而10%中性福爾馬林是組織固定最常用的試劑，組織滲透力強、收縮小，能夠較好保存多數的抗原物質，由于10%中性福爾馬林中加入磷酸緩沖液，不易被氧化，故對組織標本的固定(特別是長期固定)、染色效果較為有利，在脫鈣液中加入10%中性福爾馬林后加快脫鈣速度的同時又能保護細胞形態(tài)及抗原，且穿透力強，固定均勻[5]。此外，本實驗發(fā)現延長脫鈣時間后，10%EDTA脫鈣液脫鈣效果最佳，且免疫組化染色結果更為穩(wěn)定。由于EDTA是一種相對較好的螯合脫鈣劑，對組織結構、細胞形態(tài)影響較小，且能較好地保存組織中的抗原物質和某些酶類的活性[6]，經10%EDTA脫鈣液脫鈣后的組織行HE和免疫組化染色效果佳，且不易掉片，但因其脫鈣時間過長，不推薦用于臨床診斷的骨組織脫鈣；5%硝酸甲醛脫鈣液中，硝酸是一種強氧化性和腐蝕性的強酸，是六大無機強酸之一，且低濃度的硝酸能較好的保持組織的完整性和細胞形態(tài)。本實驗中5%硝酸甲醛脫鈣液脫鈣時間明顯低于10%EDTA脫鈣液，且兩種脫鈣液HE染色與免疫組化染色效果相差較小，鏡下無皺縮、龜裂、膨脹現象，切片平整，厚薄均勻。綜合以上各種脫鈣液的優(yōu)缺點，聯(lián)合臨床實際，推薦使用5%硝酸甲醛脫鈣液作為臨床工作中的常用脫鈣液。

室溫靜置條件下，組織脫鈣時間較長(24～48 h)，嚴重影響病理報告的時效性；而微波、超聲均可加強試劑對組織的穿透作用，從而加快脫鈣速度，且抗原保存得更好，同時微波、超聲過程中需不斷更換脫鈣液，在防止溫度過高的同時，也可將脫掉的鈣鹽棄掉，增加脫鈣強度[7]。微波電磁場將能量直接作用于脫鈣組織，增大脫鈣液穿透力，使脫鈣液與組織充分接觸，但是由于高溫會破壞組織細胞形態(tài)，本實驗使用間歇性微波輻射控制脫鈣液，避免高溫對組織的影響，以達到最佳脫鈣效果；超聲波發(fā)射的波長短、頻率高，故傳播方向性好且穿透能力強。經研究發(fā)現[8]，超聲波可加速脫鈣液中分子運動，加強對骨組織的滲透作用，超聲波不能加熱試劑，所以結合恒溫水浴，控制骨組織在合適的溫度下進行處理，既可以避免高溫引起的組織收縮破壞及蛋白抗原變性，又可以加快脫鈣液對組織的滲透速度，從而縮短脫鈣時間。

另外，在日常工作中對骨組織進行脫鈣操作時還應注意以下幾點：(1)對組織進行及時、充分固定，才能保存好形態(tài)結構和組織細胞的抗原性，由于固定不充分對組織的損傷是不可逆性的，所以脫鈣前組織固定尤為重要；(2)脫鈣終點選擇需謹慎，脫鈣不徹底則無法切片，脫鈣過度則會導致細胞形態(tài)破壞，影響診斷；脫鈣終點的物理法測定包括手掐、針刺、鉗夾等方法，手輕輕按壓組織柔軟有彈性、不刺手、無粗糙砂粒感，大頭針可以輕松刺入骨皮質判斷為達到脫鈣終點；(3)脫鈣后需用流水徹底沖洗30 min，以避免酸性液體殘存，導致HE染色時核質對比不清晰，細胞核著色暗淡[9]。

本組中10%EDTA脫鈣液、5%硝酸甲醛脫鈣液，在不同的處理條件下均能取得較好的脫鈣效果，5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣后進行免疫組化染色易掉片或卷片，5%鹽酸氯化鈉脫鈣液對組織損傷較大，不宜使用。同時，微波、超聲條件下均能提高脫鈣速度，相比之下，微波比超聲效果更好，條件更穩(wěn)定。聯(lián)合臨床病理診斷的時效性，我們推薦在微波條件下使用5%硝酸甲醛脫鈣液，可在較短的時間內獲得最佳的脫鈣效果。