婁 寧，潘洪濤，王新立，蔡仁萍，楊 帆

肺癌是發(fā)病率、病死率較高的惡性腫瘤，肺腺癌是肺癌最常見的類型。早發(fā)現、早診斷能顯著改善患者的預后，手術切除是治療肺腺癌的主要方法[1]。目前，由于缺乏有效的檢測方法，只有少數患者能夠在早期得到治療，而大多數患者就診時腫瘤已進展為中晚期，已發(fā)生周圍組織浸潤、淋巴結轉移等，5年生存率不足20%[2-3]。因此，探討肺腺癌浸潤、轉移的分子機制、尋找新的治療靶點，已成為亟需解決的問題。KISS1缺失或表達下調促進腫瘤的形成、發(fā)生及發(fā)展，EMT起關鍵性作用，但兩者在肺腺癌中的關系研究鮮有報道。因此，本文著重探討肺腺癌中KISS1的表達及與EMT相關分子標志物(E-cadherin和vimentin)的關系，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2017年12月濟南市第八人民醫(yī)院及山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科存檔的103例肺腺癌及對應的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>3 cm)，標本均經病理學明確診斷?；颊吣挲g37～79歲，平均61.8歲；男性60例，女性43例，其中>60歲者67例，≤60歲者36例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期43例，Ⅲ+Ⅳ期60例。納入標準：患者行肺葉切除術，病理診斷為肺腺癌；臨床資料完整，可追蹤隨訪；術前均未行放、化療或免疫治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；有嚴重肝、腎等重要臟器功能損害或其他嚴重基礎病者。

1.2 方法手術標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，免疫組化采用SP法。兔抗人KISS1、vimentin、E-cadherin多克隆抗體、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。切片經65 ℃烤2.5 h，脫蠟水化，微波爐內枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.5)沸騰后，經抗原修復10 min，室溫下冷卻。3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，山羊血清封閉非特異性位點，加入KISS1、E-cadherin、vimentin，4 ℃恒溫過夜。PBS溶液代替一抗作為陰性對照。次日洗滌后加入二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封固。

1.3 判讀標準染色結果由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片，采用半定量法并結合染色強度和染色范圍進行判斷。KISS1、vimentin以腫瘤細胞胞質呈棕黃色為陽性；E-cadherin以腫瘤細胞胞膜呈棕黃色為陽性。光鏡下隨機選取5個高倍鏡視野進行觀察：(1)根據陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞百分數計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將上述兩項得分結果相乘：0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.4 隨訪采用電話進行隨訪，截至2020年12月31日，隨訪時間3～36個月，失訪者的隨訪時間按截尾數據處理。

1.5 統計學分析使用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料以相對數指標(%)表示，采用χ2檢驗；相關性分析采用χ2檢驗及Spearman等級相關分析；應用Kaplan-Meier法計算生存率，組間生存曲線的比較采用Log-rank檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌中KISS1及E-cadherin、vimentin的表達103例肺腺癌組織中KISS1定位于腫瘤細胞質，KISS1陽性50例(48.5%)(圖1A、B)，陰性53例(51.5%)；癌旁正常組織中陽性93例(90.3%)，陰性10例(9.7%)，KISS1在肺腺癌癌組織及癌旁組織中的表達差異有統計學意義(P<0.05)。103例肺腺癌組織中E-cadherin染色定位于細胞膜，陽性46例(44.7%)(圖1C、D)，陰性57例(55.3%)；vimentin染色定位于細胞質，陽性55例(53.4%)(圖1E、F)，陰性48例(46.7%)。

圖1 肺腺癌中各蛋白的表達：A.肺腺癌中KISS1呈弱陽性；B.肺腺癌中KISS1呈強陽性；C.肺腺癌中E-cadherin呈弱陽性；D.肺腺癌中E-cadherin呈強陽性；E.肺腺癌中vimentin呈弱陽性；F.肺腺癌中vimentin呈強陽性，SP法

2.2 肺腺癌中KISS1、E-cadherin、vimentin表達與臨床病理特征的關系肺腺癌組織中，KISS1、E-cadherin在腫瘤低分化、Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結轉移組中的表達顯著低于腫瘤高中分化、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P<0.05)；而vimentin在腫瘤低分化、Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結轉移組中的表達顯著高于腫瘤高中分化、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組，差異有統計學意義(P<0.05)。KISS1、E-cadherin、vimentin與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、組織類型均無關(P>0.05，表1)。

表1 肺腺癌中KISS1、E-cadherin、vimentin表達與臨床病理特征的關系

2.3 KISS1表達與E-cadherin、vimentin表達的相關性采用Spearman等級相關分析103例肺腺癌組織中KISS1與E-cadherin和vimentin的表達，結果顯示：KISS1與E-cadherin的表達呈正相關(r=0.534，P<0.05)，KISS1與vimentin的表達呈負相關(r=-0.611，P<0.05，表2)。

表2 KISS1表達與E-cadherin、vimentin表達的相關性

2.4 肺腺癌中KISS1、E-cadherin及vimentin表達與患者預后的關系本組中位生存期顯示：KISS1陽性組26個月，陰性組19個月；E-cadherin陽性組26個月，陰性組21個月；vimentin陽性組20個月，陰性組26個月。根據肺腺癌患者的預后資料分析患者的3年生存率，結果顯示：KISS1陽性組顯著高于陰性組(χ2=9.226，P=0.002)；E-cadherin陽性組顯著高于陰性組(χ2=5.140，P=0.023)；vimentin陽性組顯著低于陰性組(χ2=5.903，P=0.015，圖2)。

圖2 肺腺癌中KISS1(A)、E-cadherin(B)、vimentin(C)表達與患者預后的關系

3 討論

大多數肺癌患者確診時多為中晚期且預后較差，因此對肺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機制研究具有重要意義。在結直腸癌、胃癌等腫瘤中，KISS1突變或者表達下調可促進腫瘤發(fā)生及進展[4-5]，但在肺腺癌中與EMT相關因子(E-cadherin、vimentin)表達的相關性尚未見報道，與患者預后的關系也尚存在爭議。

KISS1是最先在黑色素瘤細胞中發(fā)現的腫瘤抑制基因，位于染色體1q32～q41區(qū)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義[6]。Guzman等[7]研究發(fā)現KISS1在胰腺癌和卵巢癌發(fā)展的初始階段上調起抑癌作用。然而，當KISS1被某些機制(如啟動子高甲基化)下調后，患者的預后較差。本實驗結果發(fā)現肺腺癌腫瘤組織中KISS1陽性率(48.5%)遠低于癌旁組織(90.3%)，與上述研究結論相吻合，進一步驗證了KISS1可能作為肺腺癌的潛在抑癌基因，進而抑制腫瘤的浸潤、轉移。Zheng等[8]研究發(fā)現KISS1 mRNA和蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織學類型無相關性，而與臨床分期、有無遠處轉移有顯著相關性。本實驗結果與Zheng等報道一致，進一步表明KISS1下調或突變缺失促進了肺腺癌的進展。本實驗結果顯示，肺腺癌患者KISS1陽性組3年生存率顯著高于陰性組，差異有統計學意義(P<0.05)。

腫瘤浸潤、轉移是多分子、多基因相互作用的結果，其中EMT是重要的步驟之一。EMT是指上皮性的細胞(包括正常上皮和腫瘤上皮)表現出間質細胞的特征，獲得了遷徙、運動能力[9]。EMT是正常胚胎發(fā)育的過程，同樣也是最常見的腫瘤浸潤與轉移的起始原因，其標志特征是上皮細胞完整性的丟失，而這種丟失會伴隨維持上皮細胞間接觸的黏附連接下降[10-11]。E-cadherin和vimentin是癌細胞EMT表面和支架的典型代表標志物，E-cadherin蛋白主要參與細胞間質之間特異性黏附連接過程，其功能的缺失與各種惡性上皮源性腫瘤的不良預后顯著有關。胡麗霞等[12]研究發(fā)現E-cadherin mRNA和蛋白在乳腺癌組織中呈陰性；其蛋白表達與臨床分期、脈管侵襲、組織學分級等表達間差異均有顯著性，可能參與乳腺癌的浸潤與轉移。本研究發(fā)現在肺腺癌組織中，E-cadherin蛋白與KISS1蛋白表達呈正相關；推測其表達可能與腫瘤分化程度、脈管累及、遠處轉移、TNM分期相關，與胡麗霞等在乳腺癌組織中的研究結果相吻合。

當細胞發(fā)生EMT時細胞極性喪失、細胞間連接解體、肌動蛋白骨架改變等一系列變化，導致細胞表面上皮標志物E-cadherin等表達逐漸降低，而間充質標志物不斷升高，基膜降解最終使細胞獲得遷移和侵襲從而發(fā)生浸潤轉移[13-14]。本實驗E-cadherin在低分化、有浸潤轉移及TNM分期較晚的肺腺癌組中陽性率降低，提示在腫瘤的發(fā)展過程中隨著其丟失或陰性，腫瘤細胞間的黏附力下降，促進EMT的發(fā)生。vimentin在正常上皮細胞中不表達，但在TNM分期較晚、低分化、有淋巴結轉移的肺腺癌細胞中過表達，同樣可增加EMT活性[15]。經過EMT的細胞失去了它們的上皮細胞特征，表達間充質標志物特性[16]。vimentin在癌組織中過表達后促進癌細胞遷移、運動，減弱細胞黏附，且無法維持細胞完整性，最終導致癌細胞轉移，嚴重影響患者預后。本組相關性分析顯示，vimentin與KISS1蛋白表達呈負相關，提示在肺腺癌組織中E-cadherin陰性和vimentin陽性與腫瘤組織的浸潤、轉移有關。因此，E-cadherin表達下調及vimentin表達上調在浸潤轉移中發(fā)揮重要作用，同時提示患者預后較差。文獻報道KISS1抑制間皮瘤細胞EMT的發(fā)生，抑制了腫瘤的浸潤及轉移。但是，KISS1與EMT的關系在肺腺癌研究中尚未見報道。本實驗探討了KISS1與EMT表達的關系，發(fā)現隨著KISS1表達的降低，E-cadherin表達下調而vimentin表達上調。因此，作者認為肺腺癌中KISS1表達下調參與EMT的發(fā)生，具體通過哪種通路促進EMT發(fā)生有待后續(xù)進一步分析。

綜上所述，KISS1可能作為一種抑癌基因參與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展，表達降低可誘導EMT發(fā)生，進而促進腫瘤的增殖、侵襲與轉移導致患者預后較差，但具體分子機制尚需進一步證實。