楊曉青，黃巖杰，楊月麗，任獻青，丁 櫻，翟文生，張琳琪

原發(fā)性局灶節(jié)段腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)和微小病變腎病(minimal change disease,MCD)是兒童和成人腎病綜合征的常見病理類型[1]。光鏡下MCD無明顯病變，而FSGS可見局灶和節(jié)段的腎小球硬化以及上皮細胞肥大增生等病變[2]；電鏡下兩者均可見顯著的腎小球足細胞足突融合病變[2-3]。光鏡下早期FSGS病變呈局灶性和節(jié)段性，且常發(fā)生于皮髓交界區(qū)腎小球[1]。因此，早期FSGS和MCD難以鑒別[4]。近年研究顯示，F(xiàn)SGS的早期腎小球壁層上皮細胞(parietal epithelial cell,PEC)活化，并從腎小球包曼囊壁向毛細血管袢遷移啟動了腎小球節(jié)段硬化的發(fā)生[5-7]。CD44屬于細胞黏附分子家族，是重要的腫瘤干細胞標(biāo)志物[8]，也是腎小球PEC活化的標(biāo)志[9]，參與細胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程。Smeets等[2]研究顯示檢測腎小球PEC活化標(biāo)記CD44有助于鑒別早期FSGS和MCD，但是該研究未對CD44表達進行定位分析，也未對預(yù)測的早期FSGS進行臨床病理分析。本文檢測腎小球PEC特異性標(biāo)記Claudin-1[10]和活化標(biāo)記CD44在腎小球的表達和定位，并結(jié)合患者的臨床治療和隨訪信息明確其診斷價值，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年1月～2020年12月河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病理實驗室18例原發(fā)性FSGS和54例MCD標(biāo)本。其中18例FSGS患者中男性13例，女性5例；兒童8例，成人10例；年齡5～48歲，平均(23.22±15.06)歲。54例MCD患者中男性30例，女性24例；兒童34例，成人20例；年齡1～56歲，平均(19.79±16.02)歲。所有患者腎活檢時均表現(xiàn)為腎病綜合征。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟組織3 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，免疫組化采用EnVision法?？乖迯?fù)(pH 6.0枸櫞酸高溫高壓修復(fù)3 min)；滴加兔抗人CD44和Claudin-1抗體，均購自Abcam公司(稀釋比1 ∶100)。4 ℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加Polink-2增強型染色試劑，購自北京中杉金橋公司。先加聚合物輔助劑37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，再加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG多聚體37 ℃孵育20 min，PBS沖洗；DAB顯色；蘇木精復(fù)染細胞核；脫水，透明，封固，鏡下觀察。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)MCD診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]：腎活檢光鏡下腎小球無明顯病變，免疫熒光陰性或僅有IgM強度為“≤1+”的沉積，電鏡下足細胞足突彌漫融合，無電子致密物沉積；臨床以腎病綜合征發(fā)病，并除外繼發(fā)性腎臟疾病。按照D’Agati哥倫比亞FSGS病理分型標(biāo)準(zhǔn)[12]將FSGS分為頂端型、細胞型、門部型、經(jīng)典型和塌陷型，并除外繼發(fā)性FSGS[13]。18例FSGS患者包括頂端型8例、細胞型2例、經(jīng)典型7例和塌陷型1例。FSGS門部型多為繼發(fā)性，同期2例門部型病例尿蛋白水平低于腎病水平蛋白尿被排除。光鏡下所有病例腎小球數(shù)≥10個。對CD44+PEC的MCD病例進行組織形態(tài)學(xué)分析和PAS染色，對比陽性位置的形態(tài)學(xué)特征。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，分別統(tǒng)計FSGS和MCD中CD44在腎小球基膜(glomerular basement membrane,GBM)上皮側(cè)以及在腎小球包曼囊壁PEC的陽性率。

2 結(jié)果

2.1 FSGS中CD44和Claudin-1的表達采用免疫組化對PEC的特異性標(biāo)記Claudin-1和活化標(biāo)記CD44進行染色，18例原發(fā)性FSGS病例均可見CD44+PEC局灶節(jié)段定位于GBM上皮側(cè)。CD44和Claudin-1陽性表達模式均為呈線狀或小團塊狀分布于細胞膜和細胞質(zhì)。頂端型FSGS(圖1A、B)：腎小球尿極端PEC增生，其中部分PEC活化表達CD44。細胞型FSGS(圖1C、D)：腎小球節(jié)段毛細血管內(nèi)增生呈分葉狀的毛細血管袢外PEC增生形成假新月體，增生的PEC和毛細血管袢內(nèi)浸潤的炎細胞表達CD44。經(jīng)典型FSGS(圖1E、F)：腎小球節(jié)段硬化區(qū)毛細血管袢外側(cè)可見單層排列的PEC，其中部分PEC細胞活化表達CD44。塌陷型FSGS(圖1G、H)：腎小球節(jié)段塌陷的毛細血管袢外PEC增生形成假新月體，增生的PEC活化表達CD44。18例原發(fā)性FSGS病例中，6例(33.33%)偶見CD44+PEC定位于腎小球包曼囊壁；Claudin-1在腎小球包曼囊壁PEC中表達。

圖1 FSGS中CD44、Claudin-1的表達，EnVision法：A.頂端型FSGS，CD44陽性定位于腎小球尿極端GBM上皮側(cè)和個別包曼囊壁PEC；B.頂端型FSGS，Claudin-1陽性定位于腎小球尿極端增生的PEC和包曼囊壁PEC；C.細胞型FSGS，CD44陽性定位于腎小球內(nèi)浸潤的炎細胞和節(jié)段增生區(qū)的GBM上皮側(cè)；D.細胞型FSGS，Claudin-1陽性定位于腎小球節(jié)段增生區(qū)的GBM上皮側(cè)和包曼囊壁PEC；E.經(jīng)典型FSGS，CD44陽性定位于腎小球節(jié)段硬化區(qū)的GBM上皮側(cè)和個別包曼囊壁PEC；F.經(jīng)典型FSGS病例，Claudin-1陽性定位于腎小球節(jié)段硬化區(qū)的GBM上皮側(cè)和包曼囊壁PEC；G.塌陷型FSGS，CD44陽性定位于腎小球節(jié)段塌陷區(qū)的GBM上皮側(cè)；H.塌陷型FSGS，Claudin-1陽性定位于腎小球節(jié)段塌陷區(qū)的GBM上皮側(cè)和包曼囊壁PEC

2.2 MCD中CD44和Claudin-1的表達54例MCD中，有3例(5.56%)可見CD44+PEC局灶節(jié)段定位于GBM上皮側(cè)。54例MCD中有7例(12.96%)偶見CD44+PEC定位于腎小球包曼囊壁，其中1例(1.85%)同時在腎小球包曼囊壁和GBM上皮側(cè)可見CD44+PEC(圖2)，6例(11.11%)僅在腎小球包曼囊壁可見CD44+PEC。3例進行連續(xù)切片PAS染色顯示：例1可見CD44+PEC肥大、周圍系膜基質(zhì)輕度增生；例2可見CD44+PEC肥大；例3可見CD44+PEC腫脹、空泡變性(圖2)。

圖2 MCD中CD44和Claudin-1免疫組化及PAS染色：A.CD44陽性定位于腎小球節(jié)段GBM上皮側(cè)(箭頭)，EnVision法；B.Claudin-1陽性定位于腎小球節(jié)段GBM上皮側(cè)和包曼囊壁PEC(箭頭)，EnVision法；C.腎小球節(jié)段系膜基質(zhì)輕度增生，節(jié)段GBM上皮側(cè)上皮細胞肥大(箭頭)，PAS染色；D.腎小球節(jié)段GBM上皮側(cè)見1個CD44陽性的上皮細胞(箭頭)，EnVision法；E.腎小球節(jié)段GBM上皮側(cè)見1個Claudin-1陽性上皮細胞(箭頭)，EnVision法；F.腎小球節(jié)段GBM上皮側(cè)上皮細胞肥大(箭頭)，PAS染色；G.CD44陽性定位于腎小球節(jié)段GBM上皮側(cè)(箭頭)，EnVision法；H.Claudin-1陽性定位于腎小球節(jié)段GBM上皮側(cè)和包曼囊壁PEC(箭頭)，EnVision法；I.腎小球節(jié)段GBM上皮側(cè)上皮細胞肥大(箭頭)，PAS染色

2.3 FSGS、MCD中GBM上皮側(cè)表達CD44+PEC與臨床病理特征的關(guān)系18例原發(fā)性FSGS均可見CD44+PEC局灶節(jié)段定位于GBM上皮側(cè)，提示CD44+PEC局灶節(jié)段定位于GBM上皮側(cè)有助于診斷原發(fā)性FSGS，且特異性強。54例MCD中有3例(5.56%)可見CD44+PEC局灶節(jié)段定位于GBM上皮側(cè)。3例患者均非激素敏感型腎病綜合征，例1和例3經(jīng)激素聯(lián)合他克莫司治療5個月尿蛋白轉(zhuǎn)陰，病情穩(wěn)定；例2病史2年，激素治療過程中多次復(fù)發(fā)，尿蛋白持續(xù)陽性。

2.4 FSGS和MCD中腎小球包曼囊壁CD44+PEC與臨床病理特征的關(guān)系18例原發(fā)性FSGS中，6例(33.33%)腎小球包曼囊壁可見散在CD44+PEC，其陽性率低于GBM上皮側(cè)的CD44+PEC陽性率(100%)。54例MCD患者中，7例(12.96%)腎小球包曼囊壁可見散在CD44+PEC，僅1例(1.85%)同時見CD44+PEC定位于GBM上皮側(cè)。6例(3.70%)MCD僅偶見腎小球包曼囊壁CD44+PEC，其臨床表現(xiàn)均為激素敏感型腎病綜合征。腎小球包曼囊壁PEC表達CD44提示有PEC活化，但如果活化的PEC未移行到GBM上皮側(cè)，可能不具備參與FSGS病理損傷的能力。因此，可能也不具備診斷和早期預(yù)測FSGS的價值。

3 討論

本組聯(lián)合檢測腎小球PEC特異性標(biāo)記Claudin-1和活化標(biāo)記CD44在原發(fā)性FSGS和MCD腎小球中的表達，結(jié)果顯示100%的原發(fā)性FSGS均能檢測到CD44+PEC在GBM上皮側(cè)表達；94.44%的MCD中GBM上皮側(cè)未檢測到CD44+PEC。以上結(jié)果表明CD44+PEC在GBM上皮側(cè)的表達可作為鑒別MCD和FSGS的可靠病理特征。Smeets等[2]的研究顯示87%的FSGS腎小球節(jié)段性表達CD44。兩組病例陽性率有差異，可能與兩方面因素有關(guān)：(1)本實驗納入病例的腎小球數(shù)目多、更容易檢測到CD44+PEC；(2)Smeets等的研究納入的病例均為成人，臨床表現(xiàn)為腎病水平蛋白尿，且文中沒有提供FSGS病理分型信息；而本組納入病例包括兒童和成人，臨床表現(xiàn)均為腎病綜合征，病理分型以頂端型FSGS病例為主。

為進一步明確CD44+PEC定位于GBM上皮側(cè)，而不是腎小球包曼囊壁，對于診斷和早期預(yù)測FSGS更具特異性。本組將CD44+PEC表達于腎小球包曼囊壁和GBM上皮側(cè)分別進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示：100%的FSGS在GBM上皮側(cè)均見CD44+PEC，而僅33.33%的FSGS可同時在腎小球包曼囊壁見CD44+PEC。本組MCD患者中有11.11%僅在腎小球包曼囊壁見CD44+PEC，1.85%同時在包曼囊壁和GBM上皮側(cè)見CD44+PEC，3.70%僅在GBM上皮側(cè)見CD44+PEC。雖然Smeets等[2]未對FSGS和MCD患者腎組織中CD44+PEC進行準(zhǔn)確定位，但報道的95例MCD和FSGS中CD44+PEC僅有4%定位于腎小球包曼囊壁。Zhao等[14]在大鼠糖尿病腎損傷研究中發(fā)現(xiàn)，正常大鼠偶見腎小球包曼囊壁CD44+PEC，但糖尿病腎病大鼠腎小球包曼囊壁CD44+PEC明顯增多；白蛋白可誘導(dǎo)體外原代培養(yǎng)大鼠PEC表達CD44。Hayashi等[15]在環(huán)孢霉素A誘導(dǎo)的FSGS動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，在形態(tài)學(xué)顯示早期FSGS病變(腎小球包曼囊壁與毛細血管袢形成上皮細胞橋)前18周即可見腎小球包曼囊壁PEC表達CD44。以上研究結(jié)果提示，病理狀態(tài)下多種原因可誘導(dǎo)腎小球包曼囊壁PEC表達活化標(biāo)記CD44。因此，CD44只在腎小球包曼囊壁表達不能作為診斷FSGS的可靠標(biāo)志物；而PEC活化后遷移到GBM上皮側(cè)，具有輔助診斷和早期預(yù)測FSGS的臨床價值。

為深入探討CD44+PEC定位于MCD患者GBM上皮側(cè)的臨床意義，本實驗對GBM上皮側(cè)檢測到CD44+PEC的3例MCD患者腎組織進行連續(xù)切片PAS染色，結(jié)果顯示CD44+PEC胞體肥大、偶見空泡，可伴周圍基質(zhì)增多，但未見明顯節(jié)段硬化病變。3例MCD患者均為非激素敏感型腎病綜合征，例1和例3均經(jīng)激素聯(lián)合他克莫司治療5個月后尿蛋白轉(zhuǎn)陰性；例2病史2年，激素治療過程中多次復(fù)發(fā)，最近一次發(fā)病經(jīng)激素和他克莫司治療未能轉(zhuǎn)陰性。因此，這3例MCD患者不能除外FSGS的診斷，需繼續(xù)觀察治療效果和預(yù)后，必要時重復(fù)腎活檢以明確診斷。王慧等[16]報道6例激素抵抗型MCD發(fā)展為FSGS。Smeets等[2]的研究顯示，25%的MCD患者腎小球中檢測到PEC活化標(biāo)記CD44，但是研究者未對PEC的活化標(biāo)記進行定位分析，也未對這些患者進行臨床病理分析。

綜上所述，聯(lián)合檢測PEC特異性標(biāo)記Claudin-1和活化標(biāo)記CD44在GBM上皮側(cè)表達，可用于診斷和早期預(yù)測FSGS；僅見腎小球包曼囊壁PEC表達CD44不是診斷早期FSGS的可靠證據(jù)。