黃金麗，關(guān)宏偉，盧 穎，侯 力，黃玉紅，張晴晴，宋 波

2018年最新統(tǒng)計(jì)顯示，我國胃癌死亡人數(shù)約占全球胃癌死亡的一半[1]。單鏈非編碼microRNAs(miRNAs)長度為19～25個(gè)核苷酸，其可結(jié)合相關(guān)靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)域，改變mRNA的穩(wěn)定性或調(diào)控其翻譯。編碼hsa-miR-501-5p(miR-501)的基因位于X染色體上，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-501在胃癌細(xì)胞和組織中表達(dá)增高[2-3]，可靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制因子DKK1、NKD1和GSK3β，促進(jìn)胃癌干細(xì)胞樣表型，與胃癌較差的預(yù)后有關(guān)[2]，也可靶向LPAR1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移[3]。eIF4E3是真核翻譯起始因子4E家族的第3個(gè)成員，現(xiàn)有研究提示eIF4E3在急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma of head and neck,HNSCC)中起抑癌作用[4-5]，eIF4E3高表達(dá)也與乳腺癌良好生存率有關(guān)[6]。經(jīng)miRNA分析軟件TargetScan預(yù)測，eIF4E3是miR-501的潛在靶點(diǎn)。因此，miR-501可能通過下調(diào)eIF4E3表達(dá)，參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本文通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miR-501對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其對(duì)eIF4E3表達(dá)的靶向調(diào)控，以期為胃癌診斷、治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和胃癌MGC-803細(xì)胞，購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。SGC-7901細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化內(nèi)科惠贈(zèng)，BGC-823細(xì)胞為大連醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室李巖教授贈(zèng)予。RPMI-1640、DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)，均購自美國Gibco公司。Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、eIF4E3引物，購自美國Invitrogen公司。miR-501 mimic購自廣州銳博生物公司；siRNA eIF4E3購自蘇州吉瑪基因公司；eIF4E3 3′-UTR野生型及突變型載體，購自上海吉?jiǎng)P基因公司。miR-501引物購自美國Applied Biosystems公司；eIF4E3多克隆抗體購自美國Signalway Antibody(SAB)公司；Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit和TaqMan Universal Master Mix II，購自美國Applied Biosystems公司。PrimeScript RT Reagent Kit和TB Green Premix Ex Taq II，均購自大連Takara公司。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，購自美國Promega公司。

1.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染(1)實(shí)驗(yàn)分組：miR-501 mimic組(miR-501)和miRNA無關(guān)序列對(duì)照組(NC)；eIF4E3敲低組(eIF4E3-si)和siRNA無關(guān)序列對(duì)照組(NCi)。(2)BGC-823細(xì)胞按照3×105個(gè)/孔鋪至6孔板中，待細(xì)胞生長密度達(dá)60%～70%時(shí)，利用Lipofectamine 2000將終濃度為100 nmol/L的miR-501 mimic或siRNA eIF4E3轉(zhuǎn)入細(xì)胞，6 h后加入20%FBS。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后提取RNA，48 h后提取蛋白。

1.3 qRT-PCR檢測miR-501和eIF4E3 mRNA表達(dá)水平TRIzol試劑提取總RNA，按試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，在Agilent MX3005p上進(jìn)行熒光定量PCR。U6為miR-501的內(nèi)參，β-actin為eIF4E3的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-501和eIF4E3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。miR-501(Applied Biosystems公司，批號(hào)：P161011-002 H09)，U6(Applied Biosystems公司，批號(hào)：P160808-004 E06)；eIF4E3引物序列：正向引物：5′-CTGGGTCAAAGTCCAGAGGA-3′，反向引物：3′-CATAAGACCCGGTGAGCAGT-5′；β-actin引物序列：正向引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3′，反向引物：3′-GGAACCGCTCATTGCCAAT-5′。

1.4 Western blot檢測eIF4E3蛋白表達(dá)收集細(xì)胞提取蛋白，每組上樣40 μg，采用12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗eIF4E3(1 ∶200)孵育，4 ℃過夜，β-tubulin(1 ∶500)為內(nèi)參。山羊抗兔或抗鼠熒光二抗(1 ∶16 000)37 ℃孵育1 h。Odessey紅外熒光成像儀掃膜成像。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測(1)CCK-8實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種到96孔板中，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5天后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處光密度值，繪制細(xì)胞增殖曲線。(2)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1×103個(gè)/孔)接種到6孔板中，每2天更換新鮮培養(yǎng)基，14天后4%多聚甲醛固定15 min，1%結(jié)晶紫染色30 min，計(jì)數(shù)并拍照。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)基按1 ∶4稀釋基質(zhì)膠，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞(5×104個(gè))加入上室，下室加入600 μL含10%血清培養(yǎng)基，12 h后甲醇固定20 min，1%結(jié)晶紫染色30 min，100倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)上室不用基質(zhì)膠包被，直接將轉(zhuǎn)染細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后加入上室。

1.7 雙熒光素酶檢測miR-501與eIF4E3的靶向關(guān)系化學(xué)合成含miR-501結(jié)合位點(diǎn)的eIF4E3 mRNA 3′-UTR野生型(wt)和突變型(mut)雙鏈寡核苷酸，通過XhoI-XbaI酶切位點(diǎn)插入pmiRGLO載體中。293T細(xì)胞(5×104個(gè))鋪于24孔板中，過夜后利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。(1)野生組：eIF4E3-wt和miR-501共轉(zhuǎn)染；(2)野生對(duì)照組：eIF4E3-wt和NC共轉(zhuǎn)染；(3)突變組：eIF4E3-mut和miR-501共轉(zhuǎn)染；(4)突變對(duì)照組：eIF4E3-mut和NC共轉(zhuǎn)染。同時(shí)轉(zhuǎn)染pRL-TK Renilla質(zhì)粒作為發(fā)光內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48 h后采用Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測細(xì)胞熒光素酶活性。每孔熒光素酶相對(duì)活性=每孔螢火蟲/Renilla(發(fā)光值)，對(duì)照組表達(dá)量化為1，野生組和突變組分別與其對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.8 生物信息學(xué)分析miR-501和eIF4E3在正常胃組織和胃癌組織中的表達(dá)利用TCGA(The cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫，比較miR-501和eIF4E3 mRNA在正常胃組織和胃癌組織中的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞和組織中miR-501的表達(dá)通過qRT-PCR檢測內(nèi)源性miR-501在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823和MGC-803中miR-501表達(dá)水平分別是正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的2.78±0.28、2.51±0.30和1.62±0.14倍(P<0.05，圖1A)。利用TCGA數(shù)據(jù)庫比較387例胃癌組織中miR-501表達(dá)與40例正常胃組織的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-501在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于正常胃組織(P<0.001，圖1B)，提示miR-501高表達(dá)可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。

圖1 miR-501在胃癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)：A.與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1比較；B.與正常胃組織比較(TCGA數(shù)據(jù)庫)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 miR-501對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性NC組相比，miR-501 mimic轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)5天后在450 nm處的吸光度值明顯增高(23.03%±4.60%)(P<0.01，圖2A)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-501組BGC-823細(xì)胞的克隆集落數(shù)為(513±41)個(gè)，高于NC組的(357±17)個(gè)(P<0.05，圖2B)，提示miR-501可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖活性。

圖2 miR-501可促進(jìn)BGC-823細(xì)胞增殖能力：A.CCK-8實(shí)驗(yàn)；B.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)；與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 miR-501對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞遷移和侵襲的影響Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-501的BGC-823細(xì)胞穿膜數(shù)為(587±16)個(gè)，高于NC組的(396±34)個(gè)(P<0.05，圖3A)。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-501組BGC-823細(xì)胞穿膜數(shù)為(553±43)個(gè)，高于NC組的(398±21)個(gè)(P<0.05，圖3B)，提示miR-501可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖3 miR-501可促進(jìn)BGC-823細(xì)胞遷移和侵襲能力：A.Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)；B.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)；與NC組比較，*P<0.05

2.4 miR-501與eIF4E3的靶向調(diào)控關(guān)系利用TargetScan(www.targetscan.org)數(shù)據(jù)庫預(yù)測eIF4E3 mRNA 3′-UTR區(qū)域包含有與miR-501結(jié)合的位點(diǎn)(AAAGGAT)(圖4A)，將包含miR-501預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)的eIF4E3 mRNA 3′-UTR野生型(eIF4E3-wt)或突變型(eIF4E3-mut)寡核苷酸序列插入pmiRGLO載體，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示：與共轉(zhuǎn)染miRNA無關(guān)序列和eIF4E3-wt相比，共轉(zhuǎn)染miR-501和eIF4E3-wt的293T細(xì)胞中，熒光素酶活性降低(44.86%±4.82%)(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染miR-501和eIF4E3-mut則熒光素酶活性無明顯改變(圖4B)，表明eIF4E3是miR-501的直接靶點(diǎn)。

圖4 miR-501可靶向調(diào)控eIF4E3：A.eIF4E3 mRNA 3′-UTR與miR-501結(jié)合位點(diǎn)示意圖，eIF4E3-wt為野生型，eIF4E3-mut為突變型；B.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，**P<0.01

2.5 miR-501對(duì)eIF4E3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響為了進(jìn)一步揭示miR-501和eIF4E3之間的調(diào)控關(guān)系，通過qRT-PCR和Western blot法檢測eIF4E3 mRNA和蛋白表達(dá)。與NC組相比，miR-501過表達(dá)可使BGC-823細(xì)胞eIF4E3 mRNA水平降低(40.78%±5.93%)(P<0.05)，與陽性對(duì)照eIF4E3-si組趨勢一致(圖5A)；BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-501后eIF4E3蛋白表達(dá)也顯著減少，與eIF4E3-si組趨勢保持一致(圖5B)，表明miR-501可在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控eIF4E3表達(dá)。

圖5 miR-501可下調(diào)eIF4E3 mRNA和蛋白表達(dá)：A.qRT-PCR實(shí)驗(yàn)；B.Western blot實(shí)驗(yàn)；*P<0.05，**P<0.01

2.6 敲低eIF4E3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及eIF4E3 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)本組利用針對(duì)eIF4E3的siRNA轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞以敲低eIF4E3表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA無關(guān)序列(NCi)組相比，eIF4E3敲低可顯著增強(qiáng)BGC-823細(xì)胞的增殖活性，450 nm處光密度值增加了24.62%±5.34%(P<0.01，圖6A)。同時(shí)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：eIF4E3敲低可使BGC-823細(xì)胞的克隆形成數(shù)量為(546±55)個(gè)，明顯增多；而NCi組為(357±17)個(gè)(P<0.05，圖6B)。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示：與NCi組的穿膜細(xì)胞數(shù)(182±13)個(gè)相比，eIF4E3-si組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(299±32個(gè))，明顯增多(P<0.01)。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)也呈相同趨勢，eIF4E3-si組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(271±14)個(gè)，多于NCi組的(166±21)個(gè)(P<0.01，圖6C)。這些結(jié)果表明，eIF4E3敲低可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。通過TCGA數(shù)據(jù)庫比較eIF4E3 mRNA在415例胃癌組織和34例正常胃組織中的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eIF4E3 mRNA在正常胃組織中的表達(dá)顯著高于胃癌組織(P<0.001，圖6D)，提示eIF4E3低表達(dá)可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。

圖6 敲低eIF4E3可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，eIF4E3 mRNA在胃癌組織中表達(dá)降低：A.CCK-8實(shí)驗(yàn)；B.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)；C.Transwell小室實(shí)驗(yàn)；D.TCGA數(shù)據(jù)庫分析eIF4E3 mRNA表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，病死率僅次于肺癌[1,7]，嚴(yán)重威脅患者健康。因此，探討胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找診斷的生物學(xué)標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善胃癌患者預(yù)后是非常必要的。

本組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-501在子宮頸癌組織中表達(dá)增高，其高表達(dá)與子宮頸癌分化程度、原發(fā)瘤大小、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-501可通過靶向下調(diào)抑癌基因CYLD，激活其下游的NF-κB p65促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[8]。本文探討miR-501在胃癌細(xì)胞惡性表型中的作用及其通過靶向下調(diào)eIF4E3的表達(dá)，發(fā)揮促癌作用的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-501在胃癌細(xì)胞和組織中表達(dá)明顯增高，miR-501過表達(dá)可明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖活性以及遷移和侵襲能力。Fan等[2]報(bào)道m(xù)iR-501在胃癌細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)，是胃癌患者預(yù)后差的預(yù)測因子。另有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-501在肝癌[9-10]、肺腺癌[11]、HNSCC組織[12]中過表達(dá)，且與肺腺癌高TNM分期相關(guān)[11]。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-501可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和對(duì)5-FU耐藥[13]。這些研究表明miR-501可能具有促癌作用，本組結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

目前，文獻(xiàn)對(duì)eIF4E3的研究較少[14-15]，其在胃癌中的作用尚不清楚?，F(xiàn)有的研究提示其與eIF4E1不同[16]，eIF4E3可起抑癌基因作用。Borden課題組首先報(bào)道，在AML標(biāo)本中eIF4E3表達(dá)顯著降低[4]；有文獻(xiàn)報(bào)道eIF4E3在HNSCC中表達(dá)缺失[5]；一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E3高表達(dá)與乳腺癌更好的生存率相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)eIF4E3是miR-501的直接靶點(diǎn)，miR-501可在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控eIF4E3蛋白表達(dá)，eIF4E3沉默可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，eIF4E3 mRNA在胃癌組織中表達(dá)顯著低于正常胃組織。在AML和HNSCC中研究者發(fā)現(xiàn)eIF4E3表達(dá)與eIF4E1呈負(fù)相關(guān)，eIF4E3具有特殊識(shí)別m7G帽子結(jié)構(gòu)的新作用機(jī)制，可抑制VEGF、c-Myc、Cyclin D1和NBS1 mRNA的表達(dá)，而這些通常是eIF4E1的下游因子，推測eIF4E3可能與具有促增殖作用的eIF4E1產(chǎn)生競爭，通過抑制eIF4E1功能而起到抑癌作用[4,17]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-1298可通過靶向eIF4E3，抑制TGF-β/Smad通路和激活Wnt通路，抑制氧化損傷[18]。

綜上所述，miR-501在胃癌細(xì)胞和組織中表達(dá)增高，miR-501可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，其可能是通過靶向下調(diào)抑癌基因eIF4E3表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。因此，miR-501有望成為胃癌治療的潛在候選靶點(diǎn)。