于澤玥 郝莉雨 陳紅映 李宗源 孫建輝 霍海如 李洪梅

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

慢性非萎縮性胃炎(Chronic Non-Atrophic Gastritis，CNAG)是臨床常見胃部疾病，目前尚無特效療法[1]。CNAG是由各種因素聯(lián)合誘發(fā)的慢性胃黏膜炎性疾病，其中幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori，Hp)超標(biāo)是其主要誘因之一。CNAG患者胃黏膜層以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)為主，其致病機(jī)制主要為防御因子和/或攻擊因子失衡[2]。如若不盡早介入治療，后期極有可能會(huì)出現(xiàn)胃穿孔、胃潰瘍、胃出血等癥狀，進(jìn)而發(fā)展為萎縮性胃炎，甚至胃癌，危及生命。摩羅丹(濃縮丸)是由百合、茯苓、玄參、烏藥、麥冬、澤瀉、當(dāng)歸、茵陳、白術(shù)、白芍、石斛、九節(jié)菖蒲、三七、川芎、地榆、蒲黃、延胡索、雞內(nèi)金等18味中藥飲片組成的中藥制劑，其中百合可以養(yǎng)津護(hù)胃，烏藥可以促進(jìn)消化液分泌，雞內(nèi)金能提高胃液分泌量、酸度、促進(jìn)胃排空和防止膽汁反流，三七可止血、減輕胃黏膜炎癥，當(dāng)歸具有抑菌作用，白術(shù)和茯苓可提高機(jī)體免疫功能，茵陳可利膽，川芎、延胡索具有行氣止痛的作用[3-4]。多味藥合用，具有和胃健脾、理氣消脹、通絡(luò)止痛的功效。臨床上常將其用于治療各種胃部疾病，如慢性胃炎、萎縮性胃炎等。本項(xiàng)研究通過觀察摩羅丹對(duì)CNAG大鼠胃黏膜損傷的修復(fù)情況，和對(duì)血清胃動(dòng)素、胃泌素的含量影響，以及胃液pH值、胃蛋白酶含量來評(píng)價(jià)摩羅丹對(duì)CNAG大鼠胃黏膜的保護(hù)及修復(fù)作用，闡明其相關(guān)藥理機(jī)制，為摩羅丹在CNAG方面的作用提供藥效學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)SD大鼠，80只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院屏障環(huán)境下，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，明暗交替12/12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0003。本研究所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：2020B025)。

1.1.2 藥物 摩羅丹(濃縮丸)(邯鄲制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：S00518003)；枸櫞酸鉍鉀顆粒(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，生產(chǎn)批號(hào)：2003034)。

1.1.3 試劑與儀器 無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20181210)；氨水(北京化工廠，生產(chǎn)批號(hào)：20180808)；甲醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號(hào)：20171111);水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20130201)；去氧膽酸鈉[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，美國(guó)，生產(chǎn)批號(hào)：#SLCC4936]；胃泌素(Gastrin)ELISA Kit試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：L200724640)；胃動(dòng)素(Motilin)ELISA Kit試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：L200724647)；0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1908263201)；電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，型號(hào)：Sartorius BSA323S-CW]；電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號(hào)：PL203 METTLER TOLEDO]；pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號(hào)：FE20]；酶標(biāo)儀(伯騰儀器有限公司，美國(guó)，型號(hào)：Bio Tek Epoch)；自動(dòng)脫水機(jī)(徠卡公司，德國(guó)，型號(hào)：TP1020)；石蠟包埋機(jī)(徠卡公司，德國(guó)，型號(hào)：EG1140H)；生物顯微鏡(徠卡公司，德國(guó)，型號(hào)：DM2500)；全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(美康公司，德國(guó)，型號(hào)：HM355S)；自動(dòng)染色機(jī)(徠卡公司，德國(guó)，型號(hào)：XL5010)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取健康SPF級(jí)80只SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)選取12只大鼠作為正常大鼠，其余大鼠制備CNAG模型[5]。除正常組外，造模大鼠空腹灌胃60%乙醇溶液，每周2次(周二、周五)，每日在非空腹?fàn)顟B(tài)下灌胃20 mmol/L的去氧膽酸鈉溶液。第1～6周，以0.05%氨水作為大鼠飲用水，自由飲用；第7～12周，以0.1%氨水作為大鼠飲用水，自由飲用；且采用2 d足量喂食，1 d禁食(周一、周四)，連續(xù)造模12周；正常對(duì)照組動(dòng)物不限食物，自由飲用純凈水。于第8周時(shí)，隨機(jī)從正常大鼠中取2只大鼠，從造模動(dòng)物中取8只大鼠，雌雄各半，取胃，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，待慢性胃炎模型復(fù)制成功后，再按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，即模型組、枸櫞酸鉍鉀顆粒組，摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量組，每組12只，雌雄各半，繼續(xù)造模12周

1.2.2 給藥方法 各組分別灌胃枸櫞酸鉍鉀顆粒(0.72 g/kg，臨床等效劑量的2倍)、摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量(1.00 g/kg、0.50 g/kg、0.25 g/kg，臨床等效劑量的0.5、1、2倍)，灌胃正常組與模型組等體積純凈水，1次/d，連續(xù)4周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 一般生理狀況和體質(zhì)量 觀察大鼠一般生理狀況(精神、攝食量、毛發(fā)、行為)和體質(zhì)量變化，記錄大鼠給藥前與給藥后每周的體質(zhì)量。

1.2.3.2 標(biāo)本采集 末次給藥后，各組大鼠禁食16 h，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打開腹腔，并結(jié)扎幽門下0.3 cm處，縫合腹腔。待5 h后，將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h后，離心半徑16.7 cm，3 500 r/min,離心15 min，分離血清，于-80 ℃冰箱保存；剪開結(jié)扎處收集胃液，3 000 r/min,離心15 min，取上清液待測(cè)。

1.2.3.3 胃黏膜組織病理學(xué)檢查 取出胃，收集胃液后，沿胃大彎剪開，用冰生理鹽水沖洗，并迅速置于10%甲醛中固定24 h。24 h后取出流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片3.5 μm，蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、照相。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胃的病理形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)行組間比較。

1.2.3.4 胃液pH和胃蛋白酶活性測(cè)定 取胃液上清液，用pH計(jì)測(cè)定其pH值。并按試劑盒說明書測(cè)定胃蛋白酶活性。

1.2.3.5 血清胃動(dòng)素、胃泌素測(cè)定 取血清，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)說明書測(cè)定血清中胃動(dòng)素、胃泌素的含量。

2 結(jié)果

2.1 摩羅丹對(duì)大鼠一般狀況和體質(zhì)量的影響 實(shí)驗(yàn)過程中，正常組大鼠精神狀態(tài)良好，動(dòng)作敏捷，攝食正常，被毛無明顯脫落。造模期間，與正常組比較，造模大鼠精神萎靡，懶食少動(dòng)，蜷縮，攝食量減少，體質(zhì)量呈降低趨勢(shì)。給藥期間，與模型組動(dòng)物比較，各給藥組動(dòng)物精神狀態(tài)及活動(dòng)狀態(tài)變好，攝食量增加，體質(zhì)量未見明顯差異。見圖1～2。

圖1 摩羅丹對(duì)雄性大鼠體質(zhì)量影響

圖2 摩羅丹對(duì)雌性大鼠體質(zhì)量影響

2.2 摩羅丹對(duì)胃組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常組大鼠胃黏膜未見有充血、水腫，淺層黏膜未見有脫落，黏膜下肌層未見有水腫，血管未見有充血，組織結(jié)構(gòu)正常。模型組可見胃黏膜大面積、階段性脫落，黏液滲出較多，脫落的黏膜內(nèi)有淋巴細(xì)胞、少量漿細(xì)胞滲出，并有嗜酸性細(xì)胞出現(xiàn)，黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下肌層充血、淤血，間質(zhì)充血水腫，組織明顯水腫。與模型組比較，枸櫞酸鉍鉀顆粒組、摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量組大鼠胃黏膜僅有少量脫落，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)滲出和水腫、肌層充血和淤血，以及腺細(xì)胞嗜酸性變等病變癥狀均有不同程度的減輕。通過對(duì)病理學(xué)情況進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，得出正常組、各給藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1，圖3。

表1 摩羅丹對(duì)CNAG組織形態(tài)學(xué)的影響方法

病理學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1)“-”：大鼠胃黏膜未見有水腫、滲出，黏膜未見有脫落，黏膜下肌層未見有水腫，血管內(nèi)未見有明顯充血，結(jié)構(gòu)正常；2)“+”：大鼠胃黏膜未見明顯水腫，有輕度充血、滲出，小片狀病變，有個(gè)別腺細(xì)胞輕度水腫，肌層有少量嗜酸性細(xì)胞滲出，未見有明顯組織水腫；3)“++”：大鼠胃黏膜有小面積水腫、充血，黏膜淺層有節(jié)段性脫落，有少部分腺細(xì)胞有水腫、嗜酸樣變，細(xì)胞個(gè)體較大，胞質(zhì)被染成粉色。肌層有少量炎癥、充血，組織輕度水腫；4)“+++”：大鼠胃黏膜淺層有脫落，黏膜間質(zhì)有充血、滲出性黏液及水腫；部分胃腺細(xì)胞腫大，胞質(zhì)粉染，黏膜層有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞滲出，黏膜下肌層有大量嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)及少量漿細(xì)胞滲出，肌層組織有大面積水腫，血管內(nèi)淤血、充血較嚴(yán)重；5)“++++”：大鼠胃黏膜有大面積節(jié)段性脫落，淺層較重，黏液較多，脫落的黏膜內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞滲出，并有少量嗜酸性細(xì)胞；胃黏膜間質(zhì)有水腫，黏膜上層有部分腺細(xì)胞腫大；黏膜下肌層有大面積充血、淤血，嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫。

2.3 摩羅丹對(duì)胃液pH和胃蛋白酶活性的影響 模型組大鼠較正常組大鼠胃蛋白酶含量有所下降，胃液pH值顯著降低(P<0.05)。各給藥組較模型組胃液pH值、胃蛋白酶含量有不同程度的升高。其中，摩羅丹(濃縮丸)高劑量組、枸櫞酸鉍鉀顆粒組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4～5。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色，×200)

圖4 各組胃液pH值

圖5 各組胃液胃蛋白酶含量

2.4 摩羅丹對(duì)血清胃動(dòng)素、胃泌素含量的影響 模型組較正常組胃泌素含量上升，胃動(dòng)素含量下降。各給藥組較模型組胃動(dòng)素含量有不同程度的上升，胃泌素含量有不同程度的下降。其中，摩羅丹中劑量組、低劑量組胃動(dòng)素表達(dá)水平與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖6～7。

圖6 各組胃泌素含量

圖7 各組胃動(dòng)素含量

3 討論

中醫(yī)學(xué)將CNAG歸屬于“胃痛”“嘈雜”“胃痞”等病證范疇[6]。中成藥干預(yù)是我國(guó)CNAG治療的重要組成部分，一項(xiàng)發(fā)表于2017年的《慢性非萎縮性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見》中將香砂六君丸、三九胃泰顆粒等11種中成藥作為治療慢性萎縮性胃炎的推薦藥物[7]。目前，已有研究證明摩羅丹對(duì)萎縮性胃炎、慢性胃炎有顯著的治療效果[8-12]。摩羅丹能夠顯著降低萎縮性胃炎患者表皮生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)，以調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞的增殖、分化，調(diào)節(jié)胃酸分泌，修復(fù)胃黏膜；摩羅丹與常規(guī)西藥合用(如莫法替丁、奧美拉唑等)治療萎縮性胃炎見效更快；摩羅丹與葉酸、維生素E聯(lián)用，可以治療萎縮性胃炎，甚至逆轉(zhuǎn)輕、中度胃上皮內(nèi)瘤病情的進(jìn)展。且摩羅丹治療慢性胃炎的急性毒性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)證明其安全有效，無不良反應(yīng)[13]。截止到目前，在國(guó)家不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心未出現(xiàn)任何藥物不良反應(yīng)報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)主要研究摩羅丹對(duì)CNAG的治療作用，為摩羅丹在非萎縮性胃炎方面的藥效學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

CNAG的主要癥狀為胃黏膜損傷，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CNAG模型大鼠常采用饑飽失常、低濃度氨水溶液與水楊酸鈉溶液或去氧膽酸鈉溶液聯(lián)合制備[14-16]。本實(shí)驗(yàn)采用饑飽失常法聯(lián)合低濃度氨水溶液、去氧膽酸鈉溶液，使大鼠胃防御屏障與刺激因素失衡，模擬Hp感染狀態(tài)下高濃度的氨對(duì)胃黏膜的毒性損害，進(jìn)而引起慢性或急性炎癥損傷，來制備CNAG鼠模型，且其表現(xiàn)與臨床癥狀相似。模型組胃黏膜病理檢查結(jié)果顯示胃黏膜大面積脫落，脫落的黏膜內(nèi)有淋巴細(xì)胞、少量漿細(xì)胞滲出，并有嗜酸性細(xì)胞出現(xiàn)，黏膜下肌層充血、淤血，組織水腫等，與正常組胃組織病理學(xué)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示本實(shí)驗(yàn)CNAG大鼠模型制備成功。

CNAG大鼠分別經(jīng)過摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量治療后，病理結(jié)果顯示與模型組大鼠比較，各給藥組胃黏膜組織均有不同程度的改善和修復(fù)(P<0.01)，提示摩羅丹(濃縮丸)可以保護(hù)和修復(fù)CNAG的胃黏膜組織，摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低3個(gè)劑量組與2倍臨床等效劑量的陽(yáng)性對(duì)照藥治療效果相當(dāng)。此外，胃酸pH過低會(huì)引起空腹胃痛、損傷胃黏膜組織[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示摩羅丹(濃縮丸)可以通過恢復(fù)CNAG模型大鼠胃液pH值至正常水平來維持、保護(hù)胃黏膜組織。但此次給藥組相較于模型組胃液中胃蛋白酶的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

胃動(dòng)素又名腦-腸肽激素，對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)與胃腸電活動(dòng)都有較大影響。胃動(dòng)素可刺激胃蛋白酶的分泌，使胃黏膜血流量增加，維持胃酸pH值正常水平，對(duì)胃組織不同區(qū)域的肌細(xì)胞有明顯的收縮作用[18-19]。故而胃動(dòng)素釋放含量降低時(shí)，胃蠕動(dòng)能力下降，胃酸pH值易失衡。胃泌素主要由胃竇部G細(xì)胞合成，其主要生物學(xué)功能包括：促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化，刺激胃酸分泌，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)等，但當(dāng)其分泌過多時(shí)，會(huì)損傷胃黏膜組織[20]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠血清胃動(dòng)素含量較正常組下降，枸櫞酸鉍鉀顆粒組、摩羅丹高劑量、中劑量、低劑量組大鼠胃動(dòng)素含量有不同程度的上升，其中摩羅丹中劑量組和低劑量組較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，這提示摩羅丹(濃縮丸)治療CNAG可能與調(diào)節(jié)胃動(dòng)素的分泌有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)中，各給藥組血清胃泌素含量與模型組比較，未見明顯差異。

綜上所述，摩羅丹(濃縮丸)能夠減輕CNAG大鼠的胃黏膜損傷，其作用機(jī)制可能與維持胃液pH值，調(diào)節(jié)胃動(dòng)素的分泌的有關(guān)，表明摩羅丹(濃縮丸)對(duì)CNAG有較好的治療作用，并對(duì)胃黏膜有修復(fù)損傷和保護(hù)作用。