施 敏 劉富林 夏旭婷 張 婷 廖陳敏

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙，410208)

圍絕經(jīng)期失眠癥是指女性在絕經(jīng)期前后,伴隨煩躁、盜汗等一系列圍絕經(jīng)期綜合征出現(xiàn)的以睡眠失常為主的一類癥狀性疾病，以入睡困難、睡后易醒、醒后難以再次入睡、早醒為主要表現(xiàn)，是圍絕經(jīng)期綜合征的主要癥狀[1]。相關(guān)研究表明圍絕經(jīng)期失眠癥占圍絕經(jīng)期綜合征患者的45%～75%，并有逐年升高趨勢[2]。崔亞美等[3]研究表明,圍絕經(jīng)期婦女失眠的發(fā)病率為76.8%。圍絕經(jīng)期是女性各個(gè)階段失眠癥發(fā)病率最高的時(shí)期，同時(shí)失眠癥也是圍絕經(jīng)期所有癥狀中發(fā)病率最高的疾病。近年來，隨著大眾生活節(jié)奏加快，來自社會(huì)多方面的壓力增大，圍絕經(jīng)期女性失眠癥的發(fā)病率呈上升趨勢，目前針對本病的尚沒有較好的治療方法，藥物治療存在依賴性，也存在不同程度的不良反應(yīng)，中醫(yī)通過辨證論治失眠具有獨(dú)特優(yōu)勢，龜甲膠有滋陰補(bǔ)腎，養(yǎng)血補(bǔ)虛的功效，用于治療圍絕經(jīng)期失眠癥可獲良效，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了龜甲膠治療圍絕經(jīng)期失眠癥的作用機(jī)制，希望為龜甲膠治療圍絕經(jīng)期失眠癥的進(jìn)一步臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 龜甲膠所含中藥活性成分及作用靶基因查詢與篩選 借助中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)以“龜甲”“龜板”為關(guān)鍵詞檢索龜甲膠所含中藥化合物中符合條件的化學(xué)成分及相關(guān)作用靶基因。篩選人類基因數(shù)據(jù)庫結(jié)束后，借助UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)、NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等對蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 斯坦尼鈣調(diào)節(jié)蛋白(Stanniocalcin，STC)疾病靶基因的篩選 通過人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)以“Insomnia”為關(guān)鍵詞檢索圍絕經(jīng)期失眠癥的靶基因。

1.3 構(gòu)建“藥物-疾病”交集靶基因數(shù)據(jù)庫 將所篩選的中藥活性成分作用靶基因與疾病靶基因的2組數(shù)據(jù)導(dǎo)入Venny2.1平臺獲取“藥物-疾病”交集靶基因。整合龜甲膠中藥、活性成分和圍絕經(jīng)期失眠癥靶基因、作用通路之間的作用關(guān)系，采用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化。

1.4 構(gòu)建疾病-靶基因-通路-中藥網(wǎng)絡(luò)圖 基于龜甲膠藥物活性成分與新冠肺炎和消化道疾病靶基因之間相互作用關(guān)系，借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建疾病-靶基因-通路-中藥網(wǎng)絡(luò)圖。借助CytoNCA插件對中藥成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，在?gòu)建關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的子網(wǎng)絡(luò)上以Degree和Betweenness≥2倍中位數(shù)為篩選條件，選取滿足二者數(shù)值的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)即為龜甲膠治療圍絕經(jīng)期失眠癥的核心成分。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)的構(gòu)建及核心基因篩選 將龜甲膠治療圍絕經(jīng)期失眠癥相關(guān)的靶基因?qū)朐诰€String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)得到疾病靶基因PPI圖，并借助R語言篩選關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)構(gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)。將交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因間的PPI分析，物種選擇“人”，置信度設(shè)定為大于0.4，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中“邊”代表作用靶基因之間的關(guān)聯(lián)，其粗細(xì)用combinescore表示，邊越粗，combinescore值越大，代表其結(jié)合度越大；節(jié)點(diǎn)代表作用靶基因。

1.6 核心靶基因的通路分析 基于基因本體(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫對上述核心靶基因進(jìn)行基因功能和通路的富集分析，進(jìn)一步挖掘龜甲膠治療圍絕經(jīng)期失眠癥的關(guān)鍵靶基因及其對應(yīng)的活性成分和中藥，通過評估GO生物過程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)等3大模塊對基因進(jìn)行GO富集分析，同時(shí)構(gòu)建可視化的KEGG通路富集分析結(jié)果的條形圖和氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分及作用靶基因 檢索篩選到共6個(gè)龜甲膠活性成分天冬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、碳酸鈣，活性成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)共445個(gè)，有部分成分作用于相同的疾病靶基因，去重后得到283個(gè)作用靶基因。

2.2 STC疾病靶基因 GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到失眠癥靶基因2 563個(gè)，OMIM數(shù)據(jù)庫檢索得到4個(gè)，共2 567個(gè)。

2.3 “藥物-疾病”交集靶基因數(shù)據(jù)庫 交集靶基因21個(gè)。見圖1。

圖1 圍絕經(jīng)期失眠、龜甲膠靶基因韋恩圖

2.4 中藥成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖及核心成分 見圖2。

圖2 龜甲膠-中藥成分-通路-疾病靶基因網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)及其核心靶基因 共有21個(gè)節(jié)點(diǎn)、60條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為5.71，平均局部聚類系數(shù)為0.612。采用RX643.6.1軟件按Degree值繪制靶基因的柱狀圖，Degree值排名前10位的核心節(jié)點(diǎn)分別為BDNF、TH、ADRB2、DRD2、FOS、SLC6A2、DDC、DRD1、DRD3、NOS1。見圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)(上)、核心基因柱狀圖(下)

2.6 核心靶基因的通路分析 GO功能富集分析得到條目共1 579個(gè)，其中BP、CC、MF條目分別1 456個(gè)、33個(gè)、90個(gè)，研究表明龜甲膠可通過調(diào)節(jié)多個(gè)BP、CC、MF治療圍絕經(jīng)期失眠癥。見表1。

表1 核心靶基因GO富集分析

KEGG通路富集分析篩選得到11條信號通路，可知龜甲膠可通過可卡因成癮、多巴胺能突觸、苯丙胺成癮、酗酒、cAMP信號通路、酪氨酸代謝、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、松弛素信號通路、組氨酸代謝、TNF信號通路、帕金森綜合征作用通路發(fā)揮對圍絕經(jīng)期失眠癥的治療作用。見圖4。顏色代表富集程度，條形長度、氣泡大小代表富集的基因數(shù)目。

圖4 核心靶基因KEGG富集分析

3 討論

失眠癥屬于中醫(yī)學(xué)“不寐”范疇，有“不寐”“目不瞑”“不得眠”“不得臥”“目不瞑”之稱，圍絕經(jīng)期失眠癥發(fā)生于婦女特定生理階段，與一般內(nèi)科病所致失眠既有一定的共性，亦有其特點(diǎn)[4]。邵素菊教授認(rèn)為肝腎陰虛、虛熱上擾心神為本病的基本病機(jī)，女子七七之年腎精虧損、腎水不能涵養(yǎng)肝木，肝陰不足，虛熱上擾心神而發(fā)為不寐[5]。目前西醫(yī)對圍絕經(jīng)期失眠癥以藥物治療為主，但易出現(xiàn)藥物依賴現(xiàn)象，也存在藥物不良反應(yīng)等。中醫(yī)藥治療本病，形式多元化，通過滋陰補(bǔ)腎、疏肝養(yǎng)血等治法在改善睡眠、緩解伴隨癥等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。張喆等[6]通過對180例肝腎陰虛型圍絕經(jīng)期綜合征患者進(jìn)行多中心隨機(jī)對照研究證明，中醫(yī)干預(yù)能明顯改善圍絕經(jīng)期綜合征患者的睡眠質(zhì)量。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為圍絕經(jīng)期失眠癥的發(fā)生與下丘腦-垂體-卵巢軸失衡有關(guān)，女性卵巢功能減退、雌激素分泌減少、內(nèi)分泌失調(diào)引起自主神經(jīng)功能紊亂，最終導(dǎo)致失眠。諸多研究證明睡眠可由雌激素通過中樞神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)控制，失眠可能與雌激素及其受體減少有關(guān)[7]。圍絕經(jīng)期失眠癥的發(fā)病原因尚未明確，目前多認(rèn)為與雌激素水平下降、圍絕經(jīng)期情緒障礙、5-羥色胺濃度降低、社會(huì)心理因素、絕經(jīng)狀態(tài)相關(guān)。《醫(yī)效秘傳·不得眠》分析失眠病機(jī)為陰虛為陽所勝，故以滋陰養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎之法治療圍絕經(jīng)期失眠，往往能取得顯著療效。龜甲膠滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)益肝腎，應(yīng)肝臟“體陰而用陽”之性，對陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃等圍絕經(jīng)期綜合征有良好療效，可用以治療圍絕經(jīng)期失眠癥。徐昌萬[8]用以龜甲為主要組成的方劑寧心安神湯加減治療失眠癥有效率為96.47%；朱玲[9]通過文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析得出龜甲是治療圍絕經(jīng)期綜合征常用的高頻中藥，相比于西藥，不良反應(yīng)少且輕微,安全可靠。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對龜甲膠有效成分、作用靶點(diǎn)及通路與圍絕經(jīng)期失眠癥的關(guān)聯(lián)及潛在的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)龜甲膠中天冬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸4個(gè)化合物作用于圍絕經(jīng)期失眠癥相關(guān)的BDNF、TH、ADRB2、DRD2、FOS、SLC6A2、DDC、DRD1、DRD3、NOS1等21個(gè)靶點(diǎn)，說明了龜甲膠是通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮治療圍絕經(jīng)期失眠癥。

睡眠與覺醒涉及復(fù)雜的神經(jīng)生理過程,研究表明有多種神經(jīng)遞質(zhì)參與其調(diào)控[10]。王桂斌和劉運(yùn)海[11]通過研究失眠患者多導(dǎo)睡眠圖特征發(fā)現(xiàn)，睡眠障礙與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的抑制性氨基酸和興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡被打破密切相關(guān)；魏文靜[12]研究發(fā)現(xiàn)許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)。龜甲膠富含多種氨基酸，可平衡中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平從而治療圍絕經(jīng)期失眠癥。

目前有多項(xiàng)臨床研究表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)可能通過其神經(jīng)營養(yǎng)功能直接參與睡眠的自我平衡調(diào)節(jié)過程而干預(yù)失眠癥狀，其作用機(jī)制可能與雌激素作用于γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元，或者與位于BDNF基因上的雌激素反應(yīng)元件相互作用促進(jìn)BDNF的表達(dá)有關(guān)[13-14]。即刻早期基因c-fos為核內(nèi)蛋白類細(xì)胞癌基因，c-fos蛋白參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、學(xué)習(xí)、記憶和信息傳遞等生理過程，在各種電化學(xué)刺激引起的睡眠剝奪里，c-fos基因和蛋白產(chǎn)物可當(dāng)作是神經(jīng)細(xì)胞被激活的標(biāo)志以及細(xì)胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的第三信使進(jìn)一步作用于基因，最終改變整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮性以及神經(jīng)細(xì)胞的固有結(jié)構(gòu)，從而破壞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的興奮-抑制平衡而引起失眠[15]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)眼睡眠剝奪可引起老年大鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)c-fos蛋白表達(dá)明顯增高[16]。多巴胺水平與失眠癥狀相關(guān)，黃俊山等[17]研究發(fā)現(xiàn)血清多巴胺水平高低與失眠癥中醫(yī)虛實(shí)證型相關(guān)；張華等[18]研究證明多巴胺具有維持覺醒和行為興奮的作用，其含量的升高可增加覺醒次數(shù)，破壞睡眠的完整度。本研究通過分析得出龜甲膠可通過作用于多巴胺D1受體(Dopamine D1 Receptor,DRD1)、DRD2、DRD3基因調(diào)控多巴胺的水平從而保證完整的睡眠。

KEGG通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，龜甲膠的GO功能富集主要體現(xiàn)在兒茶酚胺代謝、神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)、突觸傳遞、多巴胺能、氨基酸結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等。在KEGG通路富集分析中，篩選得到的通路分別為多巴胺能突觸、cAMP信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、TNF信號通路等。腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)是免疫系統(tǒng)重要的細(xì)胞因子,除參與炎癥反應(yīng)外,還參與機(jī)體睡眠、腦發(fā)育、食欲和內(nèi)分泌等生理功能的調(diào)節(jié)，腦內(nèi)TNF的表達(dá)受到晝夜節(jié)律的影響,動(dòng)物血中單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF的能力與睡眠-覺醒周期有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TNF可延長非快速眼動(dòng)睡眠時(shí)間,說明TNF參與非快速眼動(dòng)睡眠的調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)腦內(nèi)5-羥色胺的合成而調(diào)節(jié)睡眠[19]。有研究表明,睡眠剝奪過程中增加的cAMP可防止因睡眠喪失而導(dǎo)致的記憶鞏固不足[20-21]。龜甲膠治療圍絕經(jīng)期失眠癥涉及靶點(diǎn)最多的通路是神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，該通路包含質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號通路相關(guān)的受體和配體[22]。龜甲膠可能通過調(diào)節(jié)上述這些代謝通路而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸傳遞，最終達(dá)到良好的治療效果?？梢?，龜甲膠主要以多成分多靶點(diǎn)通過調(diào)節(jié)多巴胺能系統(tǒng)影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量變化，進(jìn)而達(dá)到睡眠覺醒穩(wěn)態(tài)以發(fā)揮治療失眠的功能。

綜上所述，龜甲膠所含的天冬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸等活性成分可能通過兒茶酚胺代謝、神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)、突觸傳遞，多巴胺能、氨基酸結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等通路作用于BDNF、TH、ADRB2、DRD2、FOS、SLC6A2、DDC、DRD1、DRD3、NOS1等作用靶點(diǎn)發(fā)揮作用，提示龜甲膠可以通過多化合物-多靶點(diǎn)-多通路達(dá)到治療圍絕經(jīng)期失眠癥的作用，這體現(xiàn)了中醫(yī)藥“多點(diǎn)顯效、協(xié)同增效”的特點(diǎn)。