曹新福 王鑫淼 劉紅旭 張赫怡 李 享

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

冠心病(Coronary Heart Disease，CHD)是指由于冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化引起冠脈管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧甚至壞死而引發(fā)的心臟病，心血管疾病每年造成1 730多萬(wàn)人死亡，到2030年估計(jì)死亡人數(shù)將增加到2 360萬(wàn)，而CHD是最常見的心血管死亡原因[1-5]。CHD屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，血瘀是CHD的關(guān)鍵病機(jī)，丹參-紅花是常見的活血化瘀藥對(duì)，以其為主要組分的丹紅注射液廣泛用于CHD的治療，且具有確切的療效[6-9]。然而丹參-紅花治療CHD的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制仍不夠明確。目前大多數(shù)關(guān)于丹參、紅花的研究局限在“單一成分”“單一靶點(diǎn)”或“單一途徑”，中醫(yī)理論是建立在系統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法論基礎(chǔ)上的，單一的成分或作用靶點(diǎn)研究，難以充分揭示中藥復(fù)方的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)闡述中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多作用機(jī)制的特點(diǎn)，超越了單靶點(diǎn)思維的束縛，能較全面揭示中藥復(fù)方的作用機(jī)制[10]。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探討丹參-紅花治療CHD的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥物成分及靶點(diǎn)的篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/)，分別以丹參、紅花為關(guān)鍵詞檢索出所有化學(xué)成分，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥18%為篩選條件，篩選相應(yīng)藥物的化學(xué)成分[11]。通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找篩選出的化學(xué)成分的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，將三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)輸入PharmMapper平臺(tái)(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)預(yù)測(cè)化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)[12-13]。最后，使用String 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為其官方名稱[14]。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的收集及藥物-疾病共同靶點(diǎn)篩選 以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，通過檢索DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)，獲取與CHD相關(guān)的靶點(diǎn)[15]。將藥物化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)以及CHD相關(guān)的靶點(diǎn)輸入Venny 2.1在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進(jìn)行交集，求得藥物和疾病之間的共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖[16]。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)[17]。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)代表藥物、成分、靶點(diǎn)、疾病，邊代表藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病之間的相互作用。通過Cytoscape的附加功能CytoNCA計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度中心性(Degree Centrality，DC)、中介中心性(Betweenness Centrality，BC)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)和特征向量中心性(Eigenvector Centrality，EC)，用以篩選丹參-紅花治療CHD的關(guān)鍵成分，參數(shù)值越大，說明節(jié)點(diǎn)越接近網(wǎng)絡(luò)的中心。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在String 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入藥物-疾病的共同靶點(diǎn)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為(>0.40)，其他的參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的直線代表靶點(diǎn)間有相互作用關(guān)系，每種顏色的線條分別代表不同關(guān)系，線條越多代表度值越大，作用關(guān)系越強(qiáng)。

1.5 基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 將80個(gè)藥物-疾病的共同靶點(diǎn)，依據(jù)P<0.05篩選條件導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，并采用Omicshare軟件繪制KEGG富集分析氣泡圖[18]。

2 結(jié)果

2.1 丹參-紅花化學(xué)成分及靶點(diǎn)篩選 共納入化學(xué)成分84個(gè)，丹參65個(gè)，紅花22個(gè)，Baicalin、Luteoli、Poriferast-5-en-3beta-ol為丹參-紅花所共有。借助PubChem查找化學(xué)成分的三維結(jié)構(gòu)，并通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)PharmMapper預(yù)測(cè)得到211個(gè)藥物靶點(diǎn)。

2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的收集及藥物-疾病共同靶點(diǎn)篩選 共得到與CHD相關(guān)的有治療作用的靶點(diǎn)912個(gè)。得到藥物-疾病之間的共80個(gè)共同靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 多個(gè)化學(xué)成分可作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，一個(gè)化學(xué)成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)了丹參-紅花治療CHD多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。見圖2。結(jié)果顯示化學(xué)成分的DC中位數(shù)為10.00，BC中位數(shù)為6.49、CC中位數(shù)為0.41、EC中位數(shù)為0.08，篩選得到丹參-紅花治療CHD的13個(gè)關(guān)鍵成分，丹參中有8個(gè)，紅花中有6個(gè)，Luteolin(木犀草素)為丹參-紅花所共有。見表1。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

表1 關(guān)鍵化學(xué)成分信息

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 度值排名前10的靶點(diǎn)為IL6、AKT1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、IL1B、NOS3、MAPK8、CCL2、MMP9，這些靶點(diǎn)可能為丹參-紅花治療CHD的核心靶點(diǎn)。見圖3～4。

圖3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前20靶點(diǎn)

2.5 GO功能富集分析 共收集到292個(gè)生物過程，25個(gè)細(xì)胞組分，62個(gè)分子功能。見表2～4。

表2 GO富集-生物過程

表3 GO富集-細(xì)胞組分

表4 GO富集-分子功能

2.6 KEGG通路富集分析 共收集到115條信號(hào)通路，以校正P值從小到大進(jìn)行排序，取排名前20的信號(hào)通路，并繪制氣泡圖。見表5，圖5。

表5 KEGG通路富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

CHD屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”范疇，其發(fā)生多與年老體衰、寒邪內(nèi)襲、飲食不節(jié)、情志失調(diào)等因素相關(guān)。普遍認(rèn)為該病病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以氣虛、陰虛、陽(yáng)虛為主，標(biāo)實(shí)多與寒凝、痰濁、瘀血有關(guān)，其中又以心脈瘀阻為關(guān)鍵[19]。穩(wěn)定期多表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜，發(fā)作期則以寒凝血瘀或兼痰濁為主。治法上則強(qiáng)調(diào)急則治其標(biāo)，發(fā)作期以活血化瘀、溫化寒痰為主；緩則標(biāo)本兼治，穩(wěn)定期則以益氣養(yǎng)陰、溫陽(yáng)散寒配合活血化瘀、化痰降濁等治法為關(guān)鍵。血瘀證貫穿CHD發(fā)展的始終，為最主要的證候要素，活血化瘀是治療CHD的核心治法[20-21]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)活血化瘀藥對(duì)丹參-紅花治療CHD的物質(zhì)成分、潛在靶點(diǎn)及可能信號(hào)通路進(jìn)行了初步探討。

藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，丹參-紅花治療CHD的關(guān)鍵成分有13個(gè)，丹參中有8個(gè)，紅花中有6個(gè)，木犀草素為丹參-紅花所共有。本研究發(fā)現(xiàn)與CHD相關(guān)程度較高的成分有5個(gè)，分別為槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮ⅡA、黃芩苷元。槲皮素具有抑制乳酸脫氫酶氧化、舒張血管，保護(hù)血管內(nèi)皮功能、預(yù)防炎癥損傷以及抗血小板聚集等作用[22]。木犀草素通過PI3K/AKT信號(hào)通路抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶2a活性的降低，從而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，同時(shí)減少乳酸脫氫酶的釋放和細(xì)胞凋亡[23]。山柰酚抗缺血再灌注損傷可能與抗氧化、抑制巰基蛋白酶-3有關(guān)[24]。丹參酮ⅡA通過激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路來預(yù)防心肌缺血再灌注損傷[25]。黃芩苷元可以增強(qiáng)心肌抗氧化能力，減輕中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥損傷，降低心肌缺血/再灌注損傷誘導(dǎo)的肌酸激酶和乳酸脫氫酶的釋放，降低心肌梗死和心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生率[26]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，IL6、AKT1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、IL1B、NOS3、MAPK8、CCL2、MMP9等可能為丹參-紅花治療CHD的核心靶點(diǎn)。本研究提示與CHD相關(guān)的靶點(diǎn)有9個(gè)，分別為IL6、AKT1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、IL1B、NOS3、CCL2、MMP9。白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是一種上游炎癥介質(zhì)，在引起動(dòng)脈粥樣硬化的下游炎癥反應(yīng)中起著核心作用，具有IL-6受體變異的個(gè)體CHD患病風(fēng)險(xiǎn)降低[27]。蛋白激酶B1在心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血栓細(xì)胞等心血管系統(tǒng)細(xì)胞的功能行為中具有明確的調(diào)節(jié)作用，蛋白激酶B1基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化、閉塞性冠狀動(dòng)脈疾病[28]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A是促血管生成神經(jīng)保護(hù)因子，在血管生成、修復(fù)和重塑過程中發(fā)揮著重要作用，影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成[29]。IL-8是一種趨化因子CXC，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化中，IL-8能通過其血管生成特性促進(jìn)斑塊形成[30]。環(huán)氧合酶-2衍生的前列環(huán)素通過抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子-1依賴的組織因子來調(diào)節(jié)動(dòng)脈血栓形成,同時(shí)前列環(huán)素具有血管舒張和抗血小板作用[31-32]。CHD患者的高冠狀動(dòng)脈鈣負(fù)荷與血清IL-1β水平顯著升高有關(guān)，其通過促進(jìn)成骨轉(zhuǎn)錄程序而成為血管平滑肌細(xì)胞鈣沉積的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)，IL-1βmAb可抑制低密度脂蛋白受體缺陷小鼠的主動(dòng)脈鈣化[33-34]。一氧化氮合酶3受剪切力和血管舒緩激肽及乙酰膽堿等刺激后釋放一氧化氮以促進(jìn)血管舒張，抑制血小板聚集和黏附，參與內(nèi)皮祖細(xì)胞的活化、平滑肌細(xì)胞增殖等過程[35]。CC基序趨化因子配體2主要由炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，其在促炎刺激和組織損傷后表達(dá)水平上調(diào)，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[36]?；|(zhì)金屬蛋白酶9參與動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段,通過破壞內(nèi)皮細(xì)胞周圍的基底膜促進(jìn)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞上遷移,促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移到動(dòng)脈粥樣硬化病變部位，并在那里增殖和分泌膠原以及形成纖維帽所需的其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[37]。

GO富集分析結(jié)果顯示，生物過程主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、血管生成、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)等。細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞外間隙、受體復(fù)合體、細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞器膜、質(zhì)膜、血小板α顆粒腔、細(xì)胞外基質(zhì)等。分子功能主要涉及酶結(jié)合、類固醇激素受體、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、類固醇結(jié)合、腎上腺素結(jié)合、蛋白質(zhì)均聚活性等。

KEGG通路富集分析結(jié)果中與CHD相關(guān)度較高的通路有5條，分別為流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路。剪應(yīng)力代表了血流施加在血管壁內(nèi)皮表面的摩擦力，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展相關(guān)，紊亂血流相關(guān)的“啟動(dòng)”狀態(tài)使內(nèi)皮細(xì)胞更容易受到高低密度脂蛋白膽固醇和高血糖等危險(xiǎn)因素的影響，并激活多種炎癥事件，包括通透性增加、活性氧生成、核因子κB的激活等[38-39]。另外，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的流體剪切應(yīng)力的增加可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶活性顯著升高，從而增加血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的生成[40]。IL-17調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，包括腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、IL-1β和γ干擾素,此外還誘導(dǎo)核因子κB的激活,IL-17介導(dǎo)的促炎癥介質(zhì)到達(dá)一個(gè)共同的下游信號(hào)通路，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[39-40]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1)通過細(xì)胞特異性反應(yīng)，作用于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、一氧化氮、活性氧和血小板生長(zhǎng)因子，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管生成和炎癥,在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[43]；同時(shí)HIF-1信號(hào)通路對(duì)組織缺血后的恢復(fù)也十分必要，HIF-1可上調(diào)促血管生成的VEGF及促血管舒張的相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，從而減輕組織缺血損傷[44]。巨噬細(xì)胞清道夫受體和泡沫細(xì)胞的形成在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，TNF-α通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程下調(diào)巨噬細(xì)胞清道夫受體基因表達(dá)，而TNF-α誘導(dǎo)的MAPK通路在巨噬細(xì)胞清道夫受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和受體表達(dá)增加中起重要作用[45]。松弛素保護(hù)心臟的能力很可能是通過其抗纖維化、抗心肌細(xì)胞肥大、抗炎和血管舒張作用介導(dǎo)的，同時(shí)也可直接刺激心肌的再生和修復(fù)[46-47]。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)丹參-紅花治療CHD具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。丹參-紅花通過調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程、減輕血管炎癥反應(yīng)、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗血栓形成、減輕心肌缺血缺氧損傷，從而發(fā)揮治療CHD的作用。本研究初步揭示了丹參-紅花治療CHD的可能成分、潛在靶點(diǎn)以及信號(hào)通路，為進(jìn)一步開展丹參-紅花治療CHD的相關(guān)研究提供了新的思路。