張曉敏，徐 坤，胡彩虹，何繼瑞

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院特需內(nèi)科（老年病科），甘肅 蘭州 730030）

甲狀腺癌（THCA）是內(nèi)分泌系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，其在頭頸部惡性腫瘤中的發(fā)病率居于首位[1]。近年來(lái)，THCA 在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率呈迅速增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)[2]，根據(jù)腫瘤起源及分化差異，一般將THCA 分為4 種類(lèi)型：甲狀腺乳頭狀癌（PTC）、甲狀腺濾泡癌（FTC）、甲狀腺髓樣癌（MTC）以及甲狀腺未分化癌（ATC），其中PTC 與FTC 合稱(chēng)分化型甲狀腺癌（DTC）。THCA 中95%左右屬于DTC，其生物行為溫和，預(yù)后相對(duì)較好[3]。然而，依然有部分THCA 如局部進(jìn)展或復(fù)發(fā)的DTC、髓樣癌及所有未分化癌等多表現(xiàn)出高度的侵襲性，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，是THCA 治療所面臨的一大挑戰(zhàn)[4]。

后基因組時(shí)代，基于腫瘤發(fā)病機(jī)制與分子靶標(biāo)的精準(zhǔn)靶向治療已成為難治性和高侵襲性THCA 前沿治療方法[5]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)不斷加深，其在各類(lèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所發(fā)揮的作用受到了醫(yī)學(xué)界持續(xù)而廣泛的關(guān)注[6-7]。大量研究表明，lncRNA在THCA 中存在差異化表達(dá)，并可通過(guò)多種方式參與THCA 的發(fā)生和發(fā)展[8-10]。然而，THCA 發(fā)病原因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制還不清楚，尤其對(duì)于高侵襲性THCA而言，臨床上缺乏有效的診斷、治療手段及預(yù)后指標(biāo)。因此，探究lncRNA 表達(dá)與THCA 之間的關(guān)系可為闡明后者的發(fā)病機(jī)制、尋找新的分子治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)提供理論依據(jù)。

H19是一個(gè)只在母系等位基因上表達(dá)（父系印記）的長(zhǎng)度為2.3 kb的lncRNA分子。研究表明，H19可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、抗凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，具有致癌或抗癌作用[11]，可作為腫瘤診斷、治療及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。然而H19在THCA 中的表達(dá)規(guī)律及相關(guān)生物學(xué)機(jī)制目前仍知之甚少。因此，本研究旨在利用UALCAN 和RNA 相互作用百科全書(shū)（ENCORI）數(shù)據(jù)庫(kù)分析lncRNAH19在THCA 中的表達(dá)情況及其可能的作用機(jī)制，以期為T(mén)HCA 的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的選擇以及預(yù)后分析提供一定的理論依據(jù)，為相關(guān)臨床轉(zhuǎn)化研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 采用的數(shù)據(jù)庫(kù)

（1）UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)。UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）是一個(gè)主要針對(duì)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行癌癥數(shù)據(jù)分析與挖掘的在線(xiàn)平臺(tái)。通過(guò)UALCAN 用戶(hù)可方便、快捷地對(duì)TCGA 已公開(kāi)的癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行訪問(wèn)，也可進(jìn)行腫瘤生物標(biāo)志分子鑒定或者對(duì)目標(biāo)基因在腫瘤中的表達(dá)進(jìn)行在線(xiàn)模擬驗(yàn)證和預(yù)后生存分析等。

（2）ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)。ENCORI（http：//starbase.sysu.edu.cn）是由中山大學(xué)團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的用于研究由大規(guī)模紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測(cè)序（CLIPSeq）產(chǎn)生的lncRNA、微小RNA（miRNA）、內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（ceRNA）、RNA 結(jié)合蛋白（RBP）和mRNA 互作網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫(kù)。

（3）RegRNA 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)。RegRNA 2.0（http：//regrna2.mbc.nctu.edu.tw）是一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于RNA 功能性motif 預(yù)測(cè)的網(wǎng)站，可實(shí)現(xiàn)上下游調(diào)控分子的預(yù)測(cè)。

（4）DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)。DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）全名為注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery），是一個(gè)集生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具于一體的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)批量的基因或蛋白列表進(jìn)行系統(tǒng)全面的生物功能注釋?zhuān)瑥亩鴰椭脩?hù)獲取生物學(xué)信息。

1.2 檢索與分析

（1）以“H19”為關(guān)鍵詞，利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析H19在THCA 中的表達(dá)水平及其與腫瘤分期、種族、性別、年齡及病理亞型之間的關(guān)系及其預(yù)后。

（2）以“H19”為關(guān)鍵詞，利用ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的“RNA-RNA 模塊”和“RBP-Target 模塊”分析預(yù)測(cè)可能與H19結(jié)合的上下游靶基因；利用RegRNA 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)可能與H19結(jié)合的miRNA 進(jìn)行預(yù)測(cè)，檢索參數(shù)設(shè)定采用系統(tǒng)默認(rèn)值。將兩種數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到的靶基因利用Excel軟件進(jìn)行去重復(fù)處理。

（3）利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)（2）中預(yù)測(cè)得到的H19靶基因進(jìn)行GO和KEGG注釋及富集分析。

（4）結(jié)合靶基因功能注釋和通路富集分析結(jié)果，利用ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Pan-Cancer 模塊”對(duì)H19和其靶基因SMAD4 在THCA 組織中表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。

（5）以“SMAD4”為關(guān)鍵詞，利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析SMAD4在THCA中的表達(dá)規(guī)律及其預(yù)后。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

THCA 基因表達(dá)和臨床患者資料源自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Perl 語(yǔ)言進(jìn)行了各組間基因表達(dá)水平的差異t檢驗(yàn)；利用R語(yǔ)言繪制分組Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)，生存率曲線(xiàn)間的顯著性測(cè)定采用log-rank 檢驗(yàn)；通過(guò)Fisher 精確檢驗(yàn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集顯著性分析。以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H19在THCA中的表達(dá)及預(yù)后

通過(guò)UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)，以THCA 為標(biāo)簽共檢索到564 例樣品：其中，正常對(duì)照組（Normal）59 例，原發(fā)性腫瘤組（Primary tumor）505例；按腫瘤分期計(jì)，1期（Stage 1）284 例，2 期（Stage 2）52 例，3 期（Stage 3）112 例，4 期（Stage 4）55 例；按病理亞型計(jì)，經(jīng)典型THCA（Classical Thyroid Papillary Carcinoma）358 例，高細(xì)胞型THCA（Tall Cell Thyroid Papillary Carcinoma）36 例，濾泡型THCA（Follicular Thyroid Papillary Carcinoma）102 例，其他類(lèi)型THCA（Others）9例；按性別計(jì)，男性（Male）136 例，女性（Female）369例；按年齡計(jì)，21～40周歲（Yrs）175例，41～60周歲（Yrs）200 例，61～80 周歲（Yrs）103 例，81～100 周歲（Yrs）10 例；按種族計(jì)，高加索裔或白種人（Caucasian）334 例，非洲裔或黑種人（African-American）27例，亞洲裔或黃種人（Asian）51例。

H19在THCA 中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，H19在THCA 中的表達(dá)無(wú)顯著差異（P＜0.05，圖1-A），但與腫瘤分期顯著相關(guān)，2期樣品中H19基因的表達(dá)量顯著下降，進(jìn)入3 期以后則顯著升高（P＜0.05，圖1-B）；H19在THCA 中的表達(dá)與性別、年齡、種族因素?zé)o顯著相關(guān)（P均＞0.05），圖1-D、圖1-E、圖1-F）；此外，H19在THCA 中的表達(dá)與病理亞型關(guān)系密切：H19基因在高細(xì)胞型THCA 中的表達(dá)顯著高于經(jīng)典型THCA、濾泡型THCA 和其他類(lèi)型THCA（P均＜0.05）；在經(jīng)典型THCA 中的表達(dá)顯著高于濾泡型THCA 和其他類(lèi)型THCA（P均＜0.05），見(jiàn)圖1-C。

圖1 H19基因在甲狀腺癌中的表達(dá)

基因表達(dá)與預(yù)后相關(guān)分析表明，H19高表達(dá)的THCA 患者（n=127）其預(yù)后生存率顯著低于中低表達(dá)的患者（n=377，P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 H19基因表達(dá)對(duì)甲狀腺癌患者生存預(yù)后的影響

2.2 H19靶基因預(yù)測(cè)、功能注釋及通路富集分析結(jié)果

對(duì)H19靶基因進(jìn)行GO 注釋?zhuān)蔡崛〉脚c其相關(guān)的103條GO 功能標(biāo)簽。GO 注釋標(biāo)簽富集分析顯示，上述靶基因主要涉及RNA 聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、序列特異性DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活因子活性等功能。

KEGG 通路注釋和富集分析顯示，H19靶基因主要富集在致癌錯(cuò)誤轉(zhuǎn)錄（transcriptional misregulation in cancer）、黏合連接（adherens junction）、癌癥相關(guān)通路（pathways in cancer）、多能干細(xì)胞調(diào)控信號(hào)通路（signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）、結(jié)腸直腸癌（colorectal cancer）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 信號(hào)通路（TGF-beta signaling pathway）、HTLV-I 感染（HTLV-I infection）、Hippo 信號(hào)通路（hippo signaling pathway）、急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia）、細(xì)胞周期（cell cycle）、FoxO 信號(hào)通路（FoxO signaling pathway）、Wnt 信號(hào)通路（Wnt signaling pathway）、THCA等13條通路。

2.3 H19與其靶基因SMAD4表達(dá)相關(guān)性

基于H19靶基因功能注釋和通路富集結(jié)果，在ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Pan-Cancer 模塊”選擇“RNA-RNA CoExpression”，分析H19與其靶基因SMAD4 在THCA 組織中的表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果顯示：THCA 中H19和SMAD4 基因的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.107，P＜0.05）（圖3）。推測(cè)THCA 中H19可能通過(guò)靶向性地調(diào)節(jié)SMAD4基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

圖3 H19與SMAD4基因的表達(dá)相關(guān)性

2.4 SMAD4在THCA中的表達(dá)及預(yù)后

SMAD4 在THCA 中的表達(dá)情況見(jiàn)圖4。結(jié)果表明：與正常對(duì)照組相比，SMAD4 在THCA 中的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4-A；SMAD4在THCA 中的表達(dá)與腫瘤分期、性別、年齡、種族因素?zé)o顯著相關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)圖4-B、圖4-D、圖4-E、圖4-F；不同病理亞型病灶組織中的表達(dá)差異分析顯示，SMAD4基因在經(jīng)典型THCA 中的表達(dá)顯著高于高細(xì)胞型THCA（P＜0.05），與濾泡型THCA 和其他類(lèi)型THCA相比則無(wú)顯著差異（P均＞0.05），見(jiàn)圖4-C。由圖5可以看出，SMAD4 高表達(dá)量THCA 患者與中低表達(dá)量患者的預(yù)后生存率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但存在SMAD4 中低表達(dá)患者生存率低于高表達(dá)患者的趨勢(shì)。

圖4 SMAD4基因在甲狀腺癌中的表達(dá)

圖5 SMAD4基因表達(dá)對(duì)甲狀腺癌患者生存預(yù)后的影響

3 討論

本研究利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)考察了lncRNAH19在THCA 中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：H19在THCA 中的表達(dá)與腫瘤分期顯著相關(guān)，尤其當(dāng)腫瘤發(fā)展至3期以后其表達(dá)水平顯著升高。此外，與中、低表達(dá)患者相比，H19高表達(dá)THCA 患者的預(yù)后生存率顯著降低。這與劉娜等[12]的研究結(jié)果是一致的。H19表達(dá)上調(diào)與不同類(lèi)型惡性腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性已被很多學(xué)者證實(shí)[13-17]。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們推測(cè)H19可能是THCA 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要生物學(xué)調(diào)控分子之一。

為了深入了解H19的分子作用機(jī)制，對(duì)H19的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG注釋和富集分析。結(jié)果顯示，靶基因SMAD4的出現(xiàn)頻率最高且顯著富集到了TGF-β 信號(hào)通路。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，H19與SMAD4 的表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系；并且SMAD4在THCA中的表達(dá)顯著降低，而SMAD4低表達(dá)THCA 患者預(yù)后變差。眾所周知，TGF-β 信號(hào)通路在生理狀態(tài)下被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生的抑制性通路[18]。TGF-β 信號(hào)通路若出現(xiàn)紊亂，將使得細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程失去控制，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。SMAD4 是位于人類(lèi)核染色體18 q21.1 上的一種抑癌基因，一旦SMAD4 基因缺失或突變，整個(gè)TGF-β 超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)即會(huì)被破壞，TGF-β 信號(hào)通路在腫瘤發(fā)展中的抑制效應(yīng)便會(huì)消失[19]。相關(guān)研究也顯示，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫與THCA 并存患者組織標(biāo)本中SMAD4 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率相比于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫與甲狀腺瘤并存組均顯著降低[20]。因此，推測(cè)在THCA中，H19可能通過(guò)與SMAD4 相互作用使后者的表達(dá)量下調(diào)，從而對(duì)TGF-β 信號(hào)通路產(chǎn)生抑制，進(jìn)而促進(jìn)THCA的發(fā)生、發(fā)展。

需要指出的是，在本研究中，與健康人群相比，THCA 患者病灶組織中H19未呈現(xiàn)出表達(dá)上的差異，而與其顯著相關(guān)的預(yù)測(cè)靶基因SMAD4則出現(xiàn)了顯著的表達(dá)變化。分析原因，一方面圖1-A 的結(jié)果中區(qū)只分了健康人群和THCA 患者2 個(gè)組，這就可能使得腫瘤分期導(dǎo)致的表達(dá)差異被掩蓋，因?yàn)闃颖局蠺HCA 患者可能處于不同的腫瘤分期，而如前所述，H19在THCA 中的表達(dá)與腫瘤分期顯著相關(guān)；另一方面，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有非線(xiàn)性特點(diǎn)，上游分子信號(hào)還可能在基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中被級(jí)聯(lián)放大[21]。另外，還要認(rèn)識(shí)到mRNA-miRNA-lncRNA 三元ceRNA 網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)復(fù)雜生物學(xué)調(diào)控機(jī)制[22]，lncRNA的分子功能具有多樣性的特點(diǎn)。因此，本研究中結(jié)果顯示H19基因的表達(dá)與腫瘤分期顯著相關(guān)，而SMAD4 的表達(dá)則與腫瘤分期無(wú)關(guān)，且H19高調(diào)表達(dá)的THCA 患者其預(yù)后生存率顯著低于中低表達(dá)的患者而SMAD4 高調(diào)表達(dá)與中低表達(dá)THCA 患者的預(yù)后生存率差異不顯著，這可能與H19在分子調(diào)控功能上的多樣性有關(guān)，其可能通過(guò)與其他分子互作從而調(diào)控腫瘤分期。本研究是基于生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)和分析，H19和SMAD4 在THCA 中的表達(dá)規(guī)律及其互作關(guān)系尚有待今后通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)和臨床加以驗(yàn)證；此外，在本研究中我們更多地著眼于H19和SMAD4 基因在THCA 中的表達(dá)，而未完成ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，后續(xù)可利用甲狀腺癌和正常配對(duì)組織的mRNA、miRNA、lncRNA 數(shù)據(jù)，完成mRNA、miRNA、lncRNA 互作的可視化分析，并結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證識(shí)別出更多的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，以期為今后THCA的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估，提供一定的參考依據(jù)。