馬文娟，蘇 琦

陜西省西北婦女兒童醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710061

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，調(diào)查顯示卵巢癌發(fā)病率地域性明顯，卵巢癌早期檢出率低，超過40%患者被確診時(shí)已處于中晚期[1]?；熢诼殉舶┲械玫綇V泛應(yīng)用，已成為卵巢癌治療的重要方法，其中鉑類藥物被指南推薦為一線治療藥物[2]。但鉑類藥物的耐藥問題逐漸突出，影響化療效果和患者預(yù)后[3]。目前，臨床認(rèn)為鉑類藥物耐藥是由多基因、多因素共同作用的結(jié)果，與DNA損傷、DNA分子通路密切相關(guān)[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)自cDNA測序被發(fā)現(xiàn)以來，其在卵巢癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、侵襲及增殖中的作用被證實(shí)，還有研究顯示lncRNA可與RNA結(jié)合蛋白相互作用，參與卵巢癌耐藥[5]。近年來有學(xué)者提出競爭性RNA(ceRNA)概念，即具有相同miRNA應(yīng)答元件的mRNA、lncRNA等轉(zhuǎn)錄物通過競爭性結(jié)合參與調(diào)控細(xì)胞功能，發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。本研究采用細(xì)胞生物學(xué)方法建立ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討其在篩選卵巢癌鉑類藥物耐藥基因中的價(jià)值，并驗(yàn)證其可行性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年4月至2020年4月在本院治療的64例卵巢癌鉑類藥物耐藥患者作為耐藥組，患者平均年齡(48.09±13.37)歲；按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期，Ⅲ期42例，Ⅳ期22例；腫瘤平均最大徑(4.36±1.02) cm。另納入同期在本院治療的64例對鉑類藥物敏感的卵巢癌患者作為對照組，患者平均年齡(47.71±12.85)歲；按FIGO分期，Ⅲ期37例，Ⅳ期27例；腫瘤平均最大徑(4.50±0.94)cm。兩組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲本院倫理委員會(huì)審批同意。所有患者均知悉本研究內(nèi)容，簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)鉑類耐藥診斷參照FIGO和美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南標(biāo)準(zhǔn)[7]。耐藥，即接受規(guī)范化療達(dá)到臨床緩解目標(biāo)，完成化療后復(fù)發(fā)時(shí)間<6個(gè)月；敏感，即接受規(guī)范化療達(dá)到臨床緩解目標(biāo)，完成化療后6個(gè)月內(nèi)無復(fù)發(fā)。(2)患者均接受手術(shù)+化療治療，并通過手術(shù)病理檢查確診為卵巢癌。(3)臨床資料完整。(4)患者年齡≥18歲。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠或哺乳期患者；(2)精神意識障礙者；(3)肝腎功能嚴(yán)重不全或有嚴(yán)重心肺基礎(chǔ)疾病者；(4)合并有其他惡性腫瘤者。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用PubMed數(shù)據(jù)庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)在線檢索與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關(guān)的lncRNA文獻(xiàn)，再分別利用RNA Locate與LncATLAS在線平臺分析定位lncRNA位置，以DIANA-lncBase和miRcode在線平臺分析記錄與lncRNA結(jié)合的miRNA，并采用miRTarBase在線工具分析miRNA靶向mRNA。以DAVID在線平臺進(jìn)行基因本體(GO)功能注釋，并行京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。以綜合得分>10分、P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，記錄差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。采用ceRNA預(yù)測數(shù)據(jù)庫在線平臺(http://www.bio-bigdata.net/miRSponge)構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2臨床檢驗(yàn)驗(yàn)證 取兩組患者手術(shù)病理標(biāo)本1.0～3.0 cm，取新鮮組織標(biāo)本切片至直徑2～5 mm，置于EP管，存于液氮罐中備用。根據(jù)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的結(jié)果，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測ceRNA網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵lncRNA的水平，試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供，以GAPDH作為內(nèi)參對照，以2-ΔΔCt計(jì)算基因水平。

1.2.3生存預(yù)后觀察 患者化療結(jié)束后進(jìn)行隨訪，隨訪以電話和入院復(fù)診形式進(jìn)行，每2周電話隨訪1次，以發(fā)生腫瘤進(jìn)展為隨訪終點(diǎn)，記錄并比較不同HOTAIR和SOX2水平卵巢癌患者無進(jìn)展生存(PFS)率。

2 結(jié) 果

2.1與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關(guān)的lncRNA 通過PubMed數(shù)據(jù)庫篩選與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關(guān)的lncRNA：上調(diào)12個(gè)，包括lncRNA ORM1、lncRNA ITPA、lncRNA HOTAIR、lncRNA DEPDC7、lncRNA IMPDH2、lncRNA AKAP12、lncRNA HULC、lncRNA SLIT3、lncRNA PDE4D、lncRNA NRF2、lncRNA SOX2及l(fā)ncRNA BRCA2；下調(diào)5個(gè)，包括lncRNA GPX3、lncRNA CAIR、lncRNA HCP5、lncRNA PRKDC及l(fā)ncRNA LAMP3。

2.2構(gòu)建卵巢癌鉑類藥物耐藥相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)亞細(xì)胞定位顯示，有6個(gè)lncRNA與鉑類藥物耐藥相關(guān)，且均存在于細(xì)胞質(zhì)中，見表1。lncRNA-miRNA調(diào)控預(yù)測顯示，miR-148b-3p、miR-130a、miR-34a、miR-218-5p、miR-362-3p、miR-183-5p、miR-183、miR-145、miR-126、miR-1696、miR-921、miR-17、miR-185共13個(gè)miRNA與lncRNA分子存在靶向結(jié)合關(guān)系。根據(jù)GO和KEGG分析結(jié)果構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2是ceRNA網(wǎng)絡(luò)中兩個(gè)關(guān)鍵的lncRNA，其中l(wèi)ncRNA HOTAIR與miR-148b-3p、miR-130a、miR-519d及OCT4、HRAS、XIAP組成ceRNA網(wǎng)絡(luò)，lncRNA SOX2與miR-302、miR-429、miR-140-3p及EGFR、ABHD2、ALDH1構(gòu)成ceRNA。故臨床驗(yàn)證中主要檢測lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2兩個(gè)基因。

表1 定位于細(xì)胞質(zhì)的6個(gè)lncRNA

2.3兩組患者lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2相對表達(dá)量的比較 耐藥組患者lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2水平分別為2.72±0.58和1.45±0.37，明顯高于對照組的1.92±0.49和1.26±0.40，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判斷卵巢癌鉑類藥物耐藥及患者預(yù)后的價(jià)值 ROC曲線分析顯示，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2對判斷鉑類耐藥具有一定的應(yīng)用價(jià)值(AUC>0.75，P<0.05)。見圖1和表2。128例卵巢癌患者中l(wèi)ncRNA HOTAIR<2.350者59例，10例腫瘤進(jìn)展，1年P(guān)FS率為83.1%；lncRNA HOTAIR≥2.350者69例，24例腫瘤進(jìn)展，1年P(guān)FS率為65.2%。lncRNA SOX2<1.325者68例，13例腫瘤進(jìn)展，1年P(guān)FS率為80.9%；lncRNA SOX2≥1.325者60例，21例腫瘤進(jìn)展，1年P(guān)FS率為65.0%。lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者PFS率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=5.501、4.054，P=0.019、0.044)，見圖2、3。

圖1 lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判斷卵巢癌鉑類藥物耐藥的ROC曲線分析

表2 lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判斷卵巢癌鉑類藥物耐藥的ROC曲線分析結(jié)果

圖2 不同lncRNA HOTAIR水平患者1年P(guān)FS率比較

圖3 不同lncRNA SOX2水平患者1年P(guān)FS率比較

3 討 論

目前有關(guān)卵巢癌鉑類藥物耐藥機(jī)制已深入分子領(lǐng)域，研究證明基因參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA損傷修復(fù)、信號通路傳導(dǎo)及腫瘤細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)行為[8]。lncRNA屬非編碼RNA，可通過調(diào)控基因表達(dá)參與染色體修飾、蛋白質(zhì)折疊及細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)等過程，lncRNA還可經(jīng)其二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)核酸結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞分裂、凋亡[9]，在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用。而ceRNA包含miRNA和miRNA應(yīng)答元件，可通過與lncRNA結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[10]。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由ceRNA-miRNA-mRNA構(gòu)成，在該網(wǎng)絡(luò)中，各RNA分子間可競爭性結(jié)合miRNA，拮抗miRNA對編碼基因的抑制作用，從而達(dá)到相互調(diào)控、維持基因表達(dá)穩(wěn)定的目的[11]。因而，通過ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于進(jìn)一步深入探討腫瘤耐藥機(jī)制。

亞細(xì)胞定位、miRNA及MRE序列與ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)效能密切相關(guān)。本研究通過RNALocate和lncATLAS在線平臺對與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關(guān)的lncRNA進(jìn)行定位，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，挖掘與鉑類耐藥相關(guān)的關(guān)鍵lncRNA，構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而通過臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)關(guān)鍵lncRNA與鉑類藥物耐藥及卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，為今后靶向治療提供依據(jù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2是關(guān)鍵的ceRNA分子，在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2異常高表達(dá)將增加卵巢癌鉑類藥物耐藥風(fēng)險(xiǎn)，且降低PFS率。通過監(jiān)測lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2水平，并指導(dǎo)臨床早期干預(yù)，將有助于避免耐藥及提高治療效果。

lncRNA HOTAIR是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有反式轉(zhuǎn)錄作用的lncRNA，具有特異性雙向結(jié)合功能，并與PRC2、LSD1等形成復(fù)合體，產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)[12]。lncRNA HOTAIR已被證實(shí)在卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，而沉默lncRNA HOTAIR能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲、增殖[13]。本研究結(jié)果顯示lncRNA HOTAIR定位于卵巢癌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，提示其可能在卵巢癌鉑類藥物耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NADAL等[14]也發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR可能通過調(diào)節(jié)p21WAF1/CIP1，增強(qiáng)肺腺癌對鉑類藥物的耐藥性。FAYDA等[15]則證明lncRNA HOTAIR表達(dá)水平與p21 mRNA呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示lncRNA HOTAIR可能通過抑制miR-519d，靶向作用于XIAP、OCT4。同時(shí)，lncRNA-miRNA-mRNA這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)能更清晰闡述lncRNA HOTAIR參與卵巢癌鉑類藥物耐藥的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR作為ceRNA，可與mRNA競爭miRNA-148b-3p結(jié)合位點(diǎn)，影響mRNA表達(dá)，進(jìn)而干擾其對靶基因的調(diào)控，參與耐藥。lncRNA SOX2屬于干細(xì)胞標(biāo)志蛋白，韓玲等[16]的研究顯示lncRNA SOX2過表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移、增殖，基礎(chǔ)研究還證明lncRNA SOX2可調(diào)控MMP-9、FN1活性，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，而敲除lncRNA SOX2則可增加腫瘤細(xì)胞凋亡，降低化療敏感性[17]。本研究顯示lncRNA SOX2可靶向作用于與耐藥相關(guān)的miR-302、miR-429及miR-140-3p，進(jìn)而調(diào)控EGFR、ABHD2。因而，推測lncRNA SOX2可能通過調(diào)控EGFR和ABHD2參與卵巢癌鉑類藥物耐藥。

lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，本研究收集對鉑類藥物耐藥與敏感的卵巢癌各64例，采用RT-PCR法檢測lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2在鉑類藥物耐藥與敏感癌組織中的表達(dá)量，對比分析二者對判斷耐藥的價(jià)值，并觀察lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2判斷鉑類藥物耐藥的AUC分別為0.875和0.750，提示檢測癌組織lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2水平有助于鉑類耐藥的早期篩查，這對于指導(dǎo)臨床用藥具有較高應(yīng)用價(jià)值。另外，lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者1年P(guān)FS率差異顯著，這一結(jié)果說明lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2有助于判斷卵巢癌患者預(yù)后，逆轉(zhuǎn)lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2水平有助于改善PFS率，這將為今后臨床靶向治療提供新的方向。但癌組織lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2檢測可重復(fù)性差，是否可采用血清指標(biāo)替代癌組織作為試驗(yàn)標(biāo)本用于耐藥和預(yù)后判斷，還有待于今后進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，ceRNA網(wǎng)絡(luò)有助于篩選卵巢癌鉑類藥物耐藥相關(guān)基因，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2與卵巢癌鉑類藥物耐藥密切相關(guān)。