鄭 恬，劉家云，周 磊，周 柯，陳 瀟，白 露，王美珠，楊玉琪△

空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院：1.檢驗科；2.疾病預防控制科，陜西西安 710032

鮑曼不動桿菌目前被定位為全球醫(yī)療設(shè)施環(huán)境污染中最麻煩的病原體之一[1]。同時，鮑曼不動桿菌也是臨床上常見的革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院獲得性感染的主要傳染源，如呼吸道病毒感染、敗血癥、泌尿道感染和傷口感染等[2-4]，對公眾健康構(gòu)成重大威脅。近年來，隨著鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥(CRAB)[3-4]，尤其是多重耐藥性(MDR)[5]的逐漸增加，引起臨床廣大醫(yī)護人員的高度關(guān)切。重癥監(jiān)護病房(ICU)患者，由于病情嚴重且免疫力極為低下多伴多器官衰竭，故為鮑曼不動桿菌的主要易感人群[6-7]。如何控制鮑曼不動桿菌的水平傳播已成為控制醫(yī)院感染的重點課題[8]。所以，通過對鮑曼不動桿菌的流行病學特征研究及其菌株間的遺傳同源性分析，探討其在醫(yī)院內(nèi)的水平傳播路徑，對臨床預防和控制醫(yī)院感染具有指導意義。

本研究就某院2020年5月至2021年2月神經(jīng)內(nèi)科ICU患者和環(huán)境中分離的46株鮑曼不動桿菌進行細菌鑒定及藥敏試驗，并采用多位點序列分型(MLST)確定菌株基因型別，采用BioNumerics 8.0軟件進行同源相關(guān)性分析，探討鮑曼不動桿菌在某院神經(jīng)內(nèi)科ICU的傳播及流行狀況，為臨床合理使用抗菌藥物、有效防控醫(yī)院感染的發(fā)生提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 46株鮑曼不動桿菌中，40株分離自某院2020年5月至2021年2月神經(jīng)內(nèi)科ICU患者痰液標本(所有痰液標本均來自使用呼吸機的患者，吸痰留取)，6株分離自神經(jīng)內(nèi)科ICU環(huán)境采樣標本。40例患者年齡為12～90歲，男女性別比為1.22∶1.00(22/18)。

1.2儀器與試劑 全自動細菌鑒定分析儀VITEK 2 Compact、GN革蘭陰性菌鑒定卡片、AST GN09 革蘭陰性菌藥敏卡片、VITEK-MS、基質(zhì)液及其靶板(法國Biomerieux)；Beckman DU800核酸蛋白分析儀(美國Beckman公司)；QIAamp DNA純化試劑盒(德國Qiagen公司)；DNA凝膠電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；ABI 2720聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(美國ABI)；藥敏紙片(英國Oxoid公司)；Mueller-Hinton培養(yǎng)基(北京奧博星公司)；電泳成像系統(tǒng)(上海復日公司)及PCR反應試劑(上海生工公司)。

1.3方法

1.3.1菌株分離鑒定 嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[9]操作步驟進行常規(guī)培養(yǎng)、分離細菌，采用全自動細菌鑒定分析儀VITEK 2 Compact或 VITEK-MS對細菌進行鑒定。

1.3.2藥敏試驗 采用全自動細菌鑒定系統(tǒng)VITEK 2 Compact及其相配套的細菌鑒定卡片和藥敏卡片進行藥敏試驗以及抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)檢測，以K-B法作為補充試驗。藥敏結(jié)果依據(jù)美國和臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)藥敏試驗2019年M100-S29[10]標準判斷結(jié)果。

1.3.3細菌DNA提取 以QIAamp DNA純化試劑盒，對單菌落進行細菌DNA的抽提，并利用Beckman DU800核酸蛋白分析儀檢測DNA純度和濃度，確保DNA質(zhì)量。

1.3.4引物的設(shè)計與合成 選取鮑曼不動桿菌菌株的7個獨立管家基因片段，即gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi及rpoD作為引物序列模板，并與上海生工公司共同設(shè)計、合成，詳見表1。

表1 鮑曼不動桿菌MLST各管家基因名稱、引物序列及片段長度

1.3.5PCR反應與擴增條件 反應體系由Premix Taq 12.5 μL、上下游引物(10.0 μmol/L)各1.0 μL和DNA模板2.0 μL，加無菌蒸餾水8.5 μL至總體積25.0 μL配制而成。反應步驟：(1)預變性為94 ℃，5 min；(2)變性為95 ℃，1 min；(3)退火為57 ℃，30 s；(4)延伸為72 ℃，40 s；(5)30個循環(huán)；(6)延伸72 ℃，10 min。

1.3.6擴增產(chǎn)物測序與比對 擴增后產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并被確定為單一條帶后，交由上海生工公司進行進一步雙向測序，后對測序結(jié)果進行校正和拼接。

1.3.7菌株ST型別確定 將拼接后的菌株基因序列與MLST數(shù)據(jù)庫進行比對、分析，確定7個管家基因相對應的等位基因，從而獲得菌株的ST型別。

1.3.8鮑曼不動桿菌基因同源性分析

1.3.8.1聚類樹的構(gòu)建 采用軟件BioNumerics 8.0導入由菌株的7個等位基因編號組成的profile文件，以UPGMA構(gòu)建聚類樹。

1.3.8.2最小生成樹的構(gòu)建 采用Categorical分類法計算相似系數(shù)而繪制最小生成樹。

1.4統(tǒng)計學處理 采用WHONET5.6統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1菌株耐藥率分析結(jié)果 在40株分離自患者標本的鮑曼不動桿菌中，新發(fā)現(xiàn)的1株ST型(N1)對頭孢哌酮/舒巴坦中介，對替加環(huán)素敏感，對其余12種抗菌藥物均為耐藥；1株ST1821型對14種抗菌藥物均敏感，其余39株均對亞胺培南和美羅培南耐藥且為多重耐藥菌株，占總數(shù)的97.5%(39/40)；進行藥敏試驗的14種抗菌藥物中，替加環(huán)素的耐藥率最低，為5%(2/40)，其次為復方磺胺甲噁唑(37.5%，15/40)，左氧氟沙星和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為42.5%(17/40)和45.0%(18/40),對頭孢菌素類的耐藥率較高，均高達97.5%(39/40)。40株分離自患者的鮑曼不動桿菌對14種抗菌藥物的耐藥情況見表2。

表2 40株分離自患者標本的鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的藥敏結(jié)果

2.2PCR擴增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果 PCR擴增后經(jīng)電泳鑒定結(jié)果顯示，46株鮑曼不動桿菌均可擴增為7個管家基因的特異性產(chǎn)物，產(chǎn)物大小為425～921 bp，電泳結(jié)果見圖1。

圖1 電泳結(jié)果圖

2.3MLST分型結(jié)果 由7個等位基因編號組成profile文件導入軟件BioNumerics 8.0，以UPGMA方法構(gòu)建聚類樹。46株鮑曼不動桿菌菌株共被分為12個ST型，其中發(fā)現(xiàn)1株新的ST基因型(N1)。ST469和ST195分別為11株和9株，占23.91%和19.57%；ST369有8株，占17.39%；ST381有5株，占10.87%；ST540有4株，占8.70%；ST208有3株，占6.52%；其余ST型別菌株數(shù)量較少。其中以ST195最為主要，ST208、ST540、ST369、ST136、ST436均為ST195的單基因變異株，僅在gpi管家基因與ST195不同。46株鮑曼不動桿菌MLST分型及構(gòu)成比情況見表3。

表3 46株鮑曼不動桿菌ST型別及構(gòu)成比

46株鮑曼不動桿菌中，分離自神經(jīng)內(nèi)科ICU環(huán)境采樣標本的6株為3個ST型別，分別是ST469、ST195、ST381，其分別與10、8、1株分離自患者標本的鮑曼不動桿菌為同一型別，高度懷疑發(fā)生醫(yī)院內(nèi)鮑曼不動桿菌感染。

MLST分型聚類樹(圖2)結(jié)果顯示，ST208、ST540、ST195、ST369、ST136和ST436這6個ST型別同源相關(guān)性大于85%，僅僅為管家基因gpi不同。而ST381、ST469和ST938這3個型別同源相關(guān)性為70%左右，存在兩個管家基因的不同，分別為gpi和gyrB。而新ST型別N1與其他型別的同源相關(guān)性<10%。

圖2 MLST分型聚類樹

2.4最小生成樹結(jié)果 經(jīng)軟件BioNumerics 8.0處理后繪制生成的最小生成樹中，以圓圈數(shù)量表示序列型個數(shù)，以圓圈面積的大小表示菌株的多寡，每個圓圈分成的份數(shù)代表該ST型包含菌株的株數(shù)，圓圈邊上的數(shù)字即為該ST型的名稱，倆圓圈間的連線上的所示數(shù)字即為兩個ST型間的位點數(shù)量差。本研究的MLST分型結(jié)果顯示，在46株鮑曼不動桿菌的12個ST型別中，ST195為各ST型共同的祖先(Founder)，周圍放射出8個單體組。從圖3中可見ST208、ST540、ST369、ST136和ST436這5個ST型別與ST195的距離相同，親緣關(guān)系比較近，僅1個位點gpi有所差異；ST381、ST469和ST938這3個ST型別與ST195的距離相同，存在gpi和gyrB 2個位點的差異。而ST1821與ST195距離相對較遠其親緣關(guān)系差，且6個位點均不同。N1為新型別，距離最遠，尚待進一步追蹤調(diào)查。

圖3 最小生成樹

3 討 論

鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院感染暴發(fā)的最常見病原體之一[11]，在逐年醫(yī)院感染的病原菌中名列前茅。近年來，在我國大多數(shù)醫(yī)療機構(gòu)CRAB及其MDR菌株檢出越來越普遍[12-14]，使得臨床選擇治療藥物范圍明顯減少，從而給臨床感染治療帶來困難。因此，在臨床實踐中應加強對鮑曼不動桿菌在醫(yī)院內(nèi)水平傳播的防控能力。

2020年5月常規(guī)工作中，首次于神經(jīng)內(nèi)科ICU空氣培養(yǎng)中分離出鮑曼不動桿菌(cy1號菌株)，同時在短時間內(nèi)，從幾例神經(jīng)內(nèi)科ICU患者呼吸道標本中培養(yǎng)出鮑曼不動桿菌，引起筆者的關(guān)注，而后便對神經(jīng)內(nèi)科ICU進行了持續(xù)的密切觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cy1的型別為ST195，即為筆者最開始分離出的ST型別，隨后陸續(xù)從患者痰液標本中分離出9株ST195型別的鮑曼不動桿菌。懷疑最開始發(fā)生了空氣傳播，大多數(shù)神經(jīng)內(nèi)科ICU患者接受了氣管切開術(shù)，鮑曼不動桿菌可能會從周圍物體表面或空氣中落下，易于附著在患者切開的傷口處或通過呼吸進入患者呼吸道。MLST分型顯示，26株與ST195同源性大于85%的菌株，占比大于50.0%,分析可能是因為患者用藥之后，導致菌株產(chǎn)生一定的型別變異。

46株鮑曼不動桿菌中，15號患者的菌株型別為ST381，與15號患者周圍環(huán)境中分離的cy2、cy3、cy4、cy5號菌株的型別相同(cy2分離自15號患者排痰儀管患者端，cy3分離自15號患者床頭柜，cy4分離自15號患者氣管切開處，cy5分離自呼吸機塔吊臺面)，可以推測，該患者周圍環(huán)境已經(jīng)發(fā)生該型別鮑曼不動桿菌的水平傳播。據(jù)文獻報道，鮑曼不動桿菌主要是通過人傳人而導致醫(yī)院感染暴發(fā)，而醫(yī)務(wù)人員或污染的診療環(huán)境是主要的媒介，同時由于鮑曼不動桿菌可以長時間存活在診療環(huán)境空氣中或物體表面上，造成接觸傳播的發(fā)生，引起醫(yī)院感染暴發(fā)[15]。

本研究中，筆者采用MLST技術(shù)對引起神經(jīng)內(nèi)科ICU醫(yī)院感染的鮑曼不動桿菌進行基因分型[16]，對擴增獲得的7個管家基因，通過與數(shù)據(jù)庫比對及測序分析，確定每個菌株的基因型別。研究數(shù)據(jù)顯示，46株鮑曼不動桿菌被分為12個ST型，其中1個為新發(fā)現(xiàn)的型別(N1)。ST469和ST195分別分離出11株和9株，占23.91%和19.57%；ST369有8株，占17.39%；ST381有5株，占10.87%；ST540有4株，占8.70%；ST208有3株，占6.52%；其余ST型別菌株數(shù)量較少。這與其他醫(yī)院的情況有所不同，可能與地域和院內(nèi)感染情況有關(guān)[17]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，46株鮑曼不動桿菌中，26株(6個ST型別)鮑曼不動桿菌僅在管家基因gpi上存在差異，占56.52%。有文獻報道，管家基因gpi在所有管家基因中最容易發(fā)生突變[18]。本研究顯示，管家基因gpi在區(qū)分各ST型別具有重要意義。

結(jié)合藥敏試驗和MLST分型結(jié)果，40株分離自患者痰液標本的鮑曼不動桿菌中，39株為CRAB的MDR菌株，占菌株總數(shù)的97.5%。除ST1821以及新型別STN1以外，其余10種ST型別的同源性大于70%，均為CRAB，型別間具有一定相關(guān)性。新ST基因型STN1僅對替加環(huán)素敏感，而對頭孢哌酮/舒巴坦中介，對其他12種抗菌藥物耐藥程度均較高，為究其原因，將對其作進一步的追蹤與研究。環(huán)境標本cy2、cy3、cy4、cy5為15號患者周圍的環(huán)境采樣，且型別均為ST381，耐藥性除阿米卡星不一致(cy2、cy3、cy4、cy5為敏感，15號患者為耐藥)外，其余均一致，患者對阿米卡星耐藥原因可能是由于接受過阿米卡星的治療所引起。

研究結(jié)果表明，ICU的環(huán)境或工作人員也可能成為ICU內(nèi)傳染的傳播來源。該院ICU鮑曼不動桿菌的感染以ST496和ST195基因型為主，且ST195為各ST型共同的祖先[19-20]。MLST分型結(jié)果顯示，46株鮑曼不動桿菌菌株間具有基因同源性，同屬于一個克隆復合體，且呈現(xiàn)ICU內(nèi)傳播的趨勢，發(fā)現(xiàn)新型別STN1距離最遠，同源性最小。因此，加強臨床醫(yī)護人員的生物安全意識，加強所使用的醫(yī)療器械消毒、更換、管控，制訂有效的預防和控制措施或預案，防止醫(yī)院感染的暴發(fā)與流行。

綜上所述，神經(jīng)內(nèi)科ICU環(huán)境中分離的鮑曼不動桿菌與患者分離株具同源相關(guān)性，且有水平傳播趨勢。MLST技術(shù)對明確醫(yī)院感染傳播路徑及細菌感染路徑有重要意義，有助于指導控制病原菌的傳播。