譚善財，譚長金，鄔小蘭，楊 洋，劉鴻燕

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學院，貴州銅仁 554300；2.中獸藥國家民委重點開放實驗室，貴州銅仁 554300；3.新疆醫(yī)科大學，新疆烏魯木齊 830000）

鐵皮石斛（）質(zhì)量評價的指標為多糖、甘露糖，多糖含量不低于25%，甘露糖為13%～38%，高效液相色譜法測定甘露糖與葡糖糖的峰面積比值應(yīng)為2.4～8.0。2020 年1 月，國家衛(wèi)生健康委、國家市場監(jiān)管總局聯(lián)合發(fā)布貴州、四川、云南等7 個省開展鐵皮石斛按照傳統(tǒng)食品又是中藥材的生產(chǎn)經(jīng)營試點。研究表明鐵皮石斛多糖（polysaccharide，DOP）主要是甘露糖、葡萄糖通過糖苷鍵形成的葡甘露聚糖，具有保護胃黏膜、調(diào)節(jié)血糖、保肝、增強免疫力、降血脂等多種活性。甘露糖（Mannose，Man）是鐵皮石斛多糖組成的主要單糖，作為一種天然活性單糖，對腫瘤、糖尿病、肥胖病、膀胱炎與尿道炎等疾病有較好的輔助療效，可見，甘露糖在醫(yī)藥領(lǐng)域治療各類疾病將會發(fā)揮重要的作用。甘露糖在食品、日化等行業(yè)也具有廣泛的應(yīng)用前景。

植物多糖糖苷鍵在酸性溶液中易斷裂，形成不同聚合度的水解物，因此酸法催化水解是降解植物多糖較為常用的方法。硫酸、三氟乙酸及鹽酸催化輔助沸水浴加熱或直接利用加熱設(shè)備高溫加熱水解鐵皮石斛多糖，耗時長，酸的濃度大，加熱設(shè)備易損壞、成本高。三氟乙酸、鹽酸有毒、極易揮發(fā)，并刺激呼吸系統(tǒng)，操作時難以控制濃度，不適合規(guī)?；厮舛嗵侵苽涓事短?。筆者以稀硫酸為催化劑，在高壓滅菌器中利用水蒸汽輔助一定的溫度和壓力，優(yōu)化鐵皮石斛多糖水解工藝，提高多糖水解的效率和速率，為從植物多糖中大量制備甘露糖提供參考。

柱前衍生化—高效液相色譜法測定糖類物質(zhì)是利用衍生化試劑使其帶上發(fā)色基團，結(jié)合高效液相色譜法進行紫外或熒光檢測實現(xiàn)對糖類化合物定性定量分析。吡唑啉酮類化合物是糖類物質(zhì)衍生化反應(yīng)效果較好的衍生劑，常用的有1-苯基-3-甲基-5 吡唑啉酮（PMP）、1-（2-萘基）-3-甲基-5 吡唑啉酮（NMP）、1-五氘代苯基-3-甲基-5 吡唑啉酮（d5-PMP）、1-（4-異丙苯基）-3-甲基-5 吡唑啉酮（PPMP）等，其中PMP 與醛酮糖類化合物衍生反應(yīng)活性最高。利用PMP 柱前衍生化-高效液相色譜法是分析鐵皮石斛中糖類物質(zhì)較為常用的方法，具有靈敏、快速、準確等優(yōu)點，較氣相色譜（GC）、氣質(zhì)聯(lián)用（GCMS）和液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）方法簡單易行，操作方便。

目前針對不同栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花中甘露糖的含量分析報道較少。因此筆者利用柱前衍生化-高效液相色譜法測定不同栽培方式的鐵皮石斛不同部位甘露糖含量，為非藥用部位葉及花的開發(fā)利用提供科學依據(jù)，同時為鐵皮石斛養(yǎng)生茶、石斛酒、食品保健品及添加劑等產(chǎn)品中甘露糖的測定提供切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛莖、葉、花 由貴州德江縣山頂中藥材有限公司贈予，采于2021 年6 月，2.5 年生，銅仁職業(yè)技術(shù)學院梁玉勇教授鑒定蘭科植物石斛屬鐵皮石斛。大棚栽培以松樹皮等為基質(zhì)添加有機肥種植于苗床上；附樹種植以無紡布纏繞松樹主干上，并附有青苔保濕；附石種植以無紡布圍捆在灰色巖石上，并附有青苔保濕。D-甘露糖對照品、鹽酸氨基葡萄糖、D-葡萄糖對照品 純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈 色譜純，Tedia Company；1-苯基-3 甲基-5-吡唑啉酮（PMP）上海凜恩科技發(fā)展有限公司；氫氧化鈉、苯酚、三氯甲烷、硫酸、甲醇、磷酸二氫鉀、鹽酸、乙醇 化學純，貴州銅仁市科儀化玻站；超純水 自制。

Agilent1260 高效液相色譜儀、Eclipse Plus C（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱 美國安捷倫公司；LDZF-75L-I 立體式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；T-10 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；CPA225D 電子天平 賽多利斯斯泰迪有限公司；TDZ5-WS 低速離心機 東旺化玻儀器有限公司；EXPERT 15K-R 高速冷凍離心機長沙市鑫奧儀器儀表有限公司；DELTA 320 pH 計梅特勒-托利多儀器有限公司；FZG-1 真空干燥箱南京華莎干燥設(shè)備有限公司；New Human PowerⅠ超純水儀 Human Corporation。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖（DOP）樣品的制備與多糖含量測定 鐵皮石斛莖、葉、花在60 ℃下真空干燥，粉粹，過40 目藥篩，分別精密稱取粉末0.4 g，按料液比1:20（g/mL）加入石油醚（沸程60～90 ℃），在50 ℃下熱回流提取1 h 脫脂脫色。濾渣加超純水200 mL，70 ℃下回流提取2 h，提取液離心（4000 r/min）20 min，Sevage 法除上清液中蛋白后，定容至250 mL 容量瓶中，得到多糖樣品溶液，冷藏備用。

精密量取2 mL 多糖樣品溶液于15 mL 的EP管中，按體積1:5 加入無水乙醇，振蕩搖勻，置于4 ℃下冷藏2 h 后，以轉(zhuǎn)速8000 r/min 低溫離心15 min，用無水乙醇清洗沉淀，加50 ℃熱水溶解沉淀，冷卻后定容至25 mL。參照苯酚-硫酸法測定不同栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花多糖含量。

分別精密量取95 μg/mL 葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 具塞試管，加水補足1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用），搖勻，再精密加入硫酸5 mL，搖勻，置沸水中20 min，取出，冷卻至室溫，利用紫外分光光度計在488 nm 的波長處測量各對照品溶液的吸光值，以照品溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，建立線性方程。分別精密量取鐵皮石斛莖、葉、花多糖樣品溶液1 mL 于10 mL 具塞試管，按上述標曲測定方法測定樣品溶液吸光值，并計算多糖含量。

1.2.2 校準品及對照品溶液的配制 精確配制0.505 mg/mL 鹽酸氨基葡萄糖內(nèi)標溶液100 mL，1.20 mg/mL 葡萄糖對照品和1.12 mg/mL 甘露糖對照品溶液各10 mL。分別將2 mL 的內(nèi)標溶液、1 mL 的甘露糖和1 mL 葡萄糖對照品溶液加入到10 mL 的容量瓶，加水定容，得內(nèi)標-對照品混合溶液，冷藏備用。

1.2.3 鐵皮石斛多糖樣品溶液的水解 精密量取4 mL 鐵皮石斛多糖樣品溶液，按體積1:5 加入無水乙醇，置于4 ℃下冷藏2 h 后，低溫離心（8000 r/min）20 min，用無水乙醇清洗沉淀3 次，60 ℃下真空干燥揮去乙醇，稱重。將揮干乙醇的多糖樣品加入3 mol/L的鹽酸3 mL，安瓿瓶封口，混勻，置于高壓蒸汽滅菌器中，在110 ℃下（對應(yīng)壓強為0.15 MPa）水解60 min，水解液放冷，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至中性，加入2 mL 內(nèi)標液，定容至25 mL。冷藏，用于單糖組成分析。

將2.4 mg 的鐵皮石斛多糖樣品溶于一定濃度的酸溶液中，安瓿瓶封口，混勻，置于高壓蒸汽滅菌器，在一定溫度壓力下水解，水解液放冷，加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至中性，加入2 mL 內(nèi)標液，定容至10 mL。優(yōu)化鐵皮石斛多糖水解工藝。

1.2.4 內(nèi)標-對照品混合溶液及鐵皮石斛多糖樣品水解液的衍生化 參考文獻[1]方法。分別將等體積（400 μL）的內(nèi)標-對照品混合溶液和鐵皮石斛多糖樣品水解液中各加入400 μL 0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液和400 μL 0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液于4 mL的EP 管中混勻，在69～71 ℃的溫度下水浴中加熱100 min，冷卻后，加入500 μL 的0.3 mol/L 的鹽酸溶液，以2 mL 三氯甲烷充分萃取除去衍生劑PMP，冷藏備用。

1.2.5 鐵皮石斛多糖樣品中單糖組成分析 色譜柱為安捷倫Eclipse Plus C（4.6 mm×150 mm，5 μm），高效液相色譜分析的條件：以0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（A）-乙腈（B）為流動相，按10%～15%B（0～3.0 min）、15%～25% B（3.0～8.0 min）、25%～35% B（8.0～12.0 min）、35%～10% B（12.0～15.0 min）方法梯度洗脫，流速1.0 mL/min，進樣體積10 μL，檢測波長250 nm。柱溫和進樣器的溫度維持35 ℃。

對比校準品鹽酸氨基葡萄糖和對照品甘露糖及葡萄糖色譜峰保留時間，分析多糖樣品水解液中單糖組成，計算不同栽培方式的鐵皮石斛不同部位的甘露糖及葡萄糖的峰面積比。

1.2.6 鐵皮石斛多糖水解工藝的單因素實驗

1.2.6.1 酸的種類及濃度 水解樣品質(zhì)量2.4 mg，按料液比1:1.5 加入相同摩爾濃度鹽酸或硫酸溶液，以甘露糖含量為指標，在溫度110 ℃（對應(yīng)壓強為0.15 MPa）下，鹽酸和硫酸各自濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L，水解40 min，考察酸種類以及濃度對鐵皮石斛多糖水解程度的影響。

1.2.6.2 料液比 水解樣品質(zhì)量2.4 mg，在溫度110 ℃（壓強為0.15 MPa）下，加入1.0 mol/L 的硫酸溶液，料液比分別為1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0、1:2.5，水解40 min，并以甘露糖含量為指標，考察料液比對鐵皮石斛多糖水解程度的影響。

1.2.6.3 水解溫度 水解樣品質(zhì)量2.4 mg，按1:1.5比例加入1.0 mol/L 的硫酸溶液，置于立體式高壓蒸汽滅菌器中，在溫度90、100、110、120、130 ℃（對應(yīng)壓強分別為常壓、常壓、0.15、0.20、0.25 MPa）下，水解40 min，并以甘露糖含量為指標，考察水解溫度對鐵皮石斛多糖水解程度的影響。

1.2.6.4 水解時間 水解樣品質(zhì)量2.4 mg，按1:1.5比例加入1.0 mol/L 的硫酸溶液，在溫度110 ℃（壓強為0.15 MPa）下，水解20、40、60、80、100 min，并以甘露糖含量為指標，考察水解時間對鐵皮石斛多糖水解程度的影響。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇1.0 mol/L 硫酸作為催化劑，固定料液比1:1.5，采用兩因素五水平的中心組合設(shè)計方法（Central Composite Design，CCD），以水解溫度（A）和時間（B）兩個因素為待優(yōu)化因素，如表1。以甘露糖含量為指標，利用Design-Expent 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，得出鐵皮石斛多糖最優(yōu)水解工藝，并對其驗證。

表1 響應(yīng)面試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.8 甘露糖（Man）含量測定方法

1.2.8.1 校準因子的測定 按“1.2.5”的色譜條件，利用高效液相色譜儀測定內(nèi)標液和對照品峰面積，按以下公式計算校正因子：

其中A：內(nèi)標物峰面積；A：甘露糖峰面積；m：內(nèi)標物質(zhì)量；m：甘露糖質(zhì)量。

1.2.8.2 甘露糖含量的計算 根據(jù)內(nèi)標物峰面積和質(zhì)量以及樣品中甘露糖的峰面積，甘露糖的含量按下面公式計算：

其中A：內(nèi)標物峰面積；A：樣品中甘露糖峰面積；m：內(nèi)標物質(zhì)量；M：樣品質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0 軟件對影響甘露糖含量的水解溫度和水解時間進行多元回歸擬合，利用軟件SPSS（SPSS，IBM，version 23）對不同栽培方式、不同部位鐵皮石斛多糖、甘露糖含量進行組間差異性分析，＜0.05 為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花多糖的含量比較

鐵皮石斛莖、葉、花多糖的含量按方程Y=0.0558X+0.1397（=0.9995）計算，線性范圍：2.71～13.57 μg/mL。如表2 所示，同一種栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花多糖的含量差異極顯著（＜0.01，莖＞葉＞花），含量分別在29.32%～33.78%、15.91%～17.31%和8.37%～8.68%之間，莖達到《中國藥典》對多糖含量不低于25%的要求。從多糖的含量來總體評價鐵皮石斛，大棚栽培方式質(zhì)量優(yōu)于附石、附樹栽培，附石優(yōu)于附樹栽培。大棚采用苗床栽培，以松樹皮和鋸木屑為主要基質(zhì)，表面覆有青苔；附石栽培，石斛生長在青苔之中；附樹栽培僅用無紡布捆綁在松樹上。這種因栽培方式的不同使多糖含量表現(xiàn)顯著的差異，可能與栽培基質(zhì)的保濕、保存養(yǎng)料有關(guān)。大棚、附樹和附石三種栽培方式的葉、莖多糖含量較為豐富，葉多糖含量分別為17.31%±0.73%、16.57%±0.84%和15.91%±0.38%,莖分別為8.37%±0.65%、8.67%±0.72%和8.68%±0.57%?？梢姡煌耘喾绞降蔫F皮石斛莖含有較高的多糖，同時利用保濕、保存養(yǎng)料的基質(zhì)仿野生栽培鐵皮石斛可以提高莖葉多糖的含量。

表2 3 種栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花多糖含量比較分析Table 2 The contents compare of polysaccharide in stems,leaves and flowers from D.officinale under three different cultivation methods

2.2 3 種栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花單糖組成分析

在“1.2.5”色譜條件下，鹽酸氨基葡萄糖、甘露糖和葡萄糖能實現(xiàn)較好的分離，保留時間分別為10.68、11.01 和13.04 min，對比色譜峰保留時間（圖1），可知鐵皮石斛多糖主要由甘露糖和葡萄糖組成，這與黃俊彬等報道的云南、丹霞、浙江三個不同種源的鐵皮石斛多糖中單糖組成主要為甘露糖和葡萄糖是一致的；大棚、附樹及附石三種栽培方式中，鐵皮石斛的莖、葉、花中甘露糖和葡萄糖色譜峰面積比值分別為5.72、5.24、4.25；5.53、5.13、4.37；5.65、5.34、4.62，都符合中國藥典規(guī)定的2.4～8.0 的要求?？梢?，鐵皮石斛莖多糖中也含有較多的甘露糖，是甘露糖提取的天然優(yōu)質(zhì)資源。

圖1 對照品及樣品的 HPLC 色譜圖（λ=250 nm）Fig.1 HPLC chromatograms of reference standard and sample(λ=250 nm)

2.3 鐵皮石斛多糖水解條件的優(yōu)化

根據(jù)不同栽培方式鐵皮石斛的莖、葉、花中多糖及其甘露糖和葡糖糖色譜峰面積比值的分析，可知鐵皮石斛莖中多糖、甘露糖含量最高，是提取甘露糖的主要來源，葉、花產(chǎn)量低，多糖、甘露糖含量相對莖低得多。因此選擇大棚栽培的鐵皮石斛莖進行優(yōu)化試驗。

2.3.1 單因素實驗

2.3.1.1 不同濃度的鹽酸、硫酸對甘露糖含量的影響圖2 顯示：硫酸濃度在0.5～1.0 mol/L 之間，隨濃度的增加，甘露糖含量不斷增加，最大含量達62.84%，濃度大于1.0 mol/L，含量不斷減少，這可能與濃度過高引起多糖炭化有關(guān)；鹽酸作為催化劑水解多糖，濃度在0.5～1.5 mol/L 之間，水解程度不斷增強，甘露糖最大含量為59.35%，濃度大于1.5 mol/L，含量不斷減少，這可能與鹽酸在高溫高壓閉環(huán)境中氧化性和強酸性對多糖的破壞有關(guān)。鹽酸沸點低、易揮發(fā)，在水解過程中濃度難以控制，污染環(huán)境；因此選擇硫酸作為催化劑水解鐵皮石斛多糖。

圖2 不同濃度鹽酸、硫酸對甘露糖含量的影響Fig.2 The effect of different concentrations of hydrochloric acid and sulfuric acid on content of the mannose

當硫酸濃度大于1.0 mol/L 時，甘露糖含量急劇下降，在0.5 mol/L～1.0 mol/L 之間甘露糖含量變化率較小，在1.0 mol/L 時最大。因此，確定硫酸的濃度為1 mol/L 進行后續(xù)試驗。

2.3.1.2 料液比 在料液比為1:0.5～1:1.5 之間，甘露糖含量隨硫酸的用量增加而明顯升高，1:1.5 時，含量最高，在1:1.5～1:2.5 之間，甘露糖含量增加不明顯（圖3），原因可能是絕大部分鐵皮石斛多糖已被水解了，再增加料液比，甘露糖的含量不再增加，或料液比增加，在萃取除去衍生劑PMP 時所用的三氯甲烷用量增加，使含甘露糖的上層溶液體積增加導致。

圖3 料液比對甘露糖含量的影響Fig.3 The effect of the ratio of solid to liquid on the content of the mannose

在料液比1:0.5～1:1.5 時，甘露糖含量增加明顯，在1:1.5 時最大，當硫酸溶液用量再增加時，甘露糖的含量不再增加，考慮到節(jié)約成本，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中，設(shè)定料液比1:1.5。

2.3.1.3 水解溫度 水解溫度在90～110 ℃之間，溫度不斷升高，甘露糖含量明顯增加；從110 ℃增加到120 ℃的過程中，甘露糖含量略有降低的趨勢，高于120 ℃時，甘露糖含量明顯降低（如圖4）。苯酚-硫酸測定多糖的原理為多糖類化合物在硫酸作用下先水解成單糖，然后脫水生成糠醛衍生物，再與苯酚生成有色化合物?？梢?，在溫度升高到110 ℃之前，溫度越高，多糖水解越徹底，含量越高；當溫度超過110 ℃時，甘露糖可能被氧化為糠醛衍生物，使其含量降低。故選擇溫度100、110、120 ℃三個梯度進行優(yōu)化。

圖4 水解溫度對甘露糖含量的影響Fig.4 The effect of the hydrolysis temperature on the content of the mannose

2.3.1.4 水解時間 圖5 表明，水解時間在20～60 min之間，甘露糖含量不斷升高，說明多糖在不斷水解；在60～80 min 之間，甘露糖含量增加不明顯，可能因為多糖水解已完全；而在80～100 min 之間呈減小趨勢，可能是甘露糖長時間在高溫高壓下被氧化成糖醛衍生物導致含量下降。80 min 時，甘露醇含量雖然較高，但是相較于60 min 時，含量開始下降，水解時間較長，考慮到水解效率，以及時間成本，因此選擇20、40、60 min 三個水平進行優(yōu)化。

圖5 水解時間對甘露糖含量的影響Fig.5 The effect of the hydrolysis time on the content of the mannose

2.3.2 響應(yīng)面試驗

2.3.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 以甘露糖含量為響應(yīng)值，利用Central-Composite Design 法設(shè)計水解溫度（A）和水解時間（B）兩因素五水平的響應(yīng)面試驗，優(yōu)化鐵皮石斛多糖水解工藝，方案與結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計實驗方案和結(jié)果Table 3 Experimental scheme and results of response surface optimization experiment

對甘露糖得率回歸擬合分析，得方程：

Y=63.27+1.22A+5.51B-1.26AB-4.64A-3.99B，表4 結(jié)果顯示：該模型0.01，差異極顯著性；失擬項=0.0795，大于0.05，沒有顯著差異，說明該模型適合水解溫度和時間對甘露糖得率影響的分析；調(diào)整系數(shù)=0.9901，變異系數(shù)CV 為0.59%，表明方程相關(guān)性良好，模型較穩(wěn)定，能較好地描述實際試驗。

表4 響應(yīng)面回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of response surface regression equation

2.3.2.2 方差與交互作用 表4 的方差來源A、B、AB、A、B的值分別為＜0.0001、＜0.0001、0.0002、＜0.0001、＜0.0001，（2057.34）＞（101.50）＞（53.53），這表明水解溫度、水解時間及其交互作用對鐵皮石斛多糖水解有極顯著的影響（＜0.01），影響大小表現(xiàn)為B＞A＞AB，在3D 響應(yīng)面圖曲線坡度陡峭程度上得到驗證（圖6），水解時間的曲面坡度大于水解溫度曲面坡度，水解時間的曲面和水解溫度曲面等高線都較陡峭，說明兩者交互作用對多糖水解有顯著影響。

圖6 水解溫度和水解時間對甘露糖含量交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot showing the effect of the hydrolysis temperature and time on the content of mannose

2.3.2.3 最佳水解工藝的確定與驗證 利用該模型分析得到最佳水解工藝為：水解溫度112 ℃，水解時間44 min，甘露糖含量理論預測值達到64.22%。以溫度112 ℃，時間44 min，重復3 次試驗驗證，實驗值達到64.35%±0.76%，比理論值提高0.13 百分點，可見，該模型預測較好，適于鐵皮石斛多糖的水解。

2.4 3 種栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花甘露糖含量比較

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳水解多糖工藝，對大棚、附樹及附石3 種栽培方式的鐵皮石斛不同部位的多糖進行水解，結(jié)果如表5 所示，同一種栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花甘露糖的含量表現(xiàn)出顯著的差異（＜0.05，莖＞葉＞花），與多糖呈現(xiàn)相同變化規(guī)律；莖、葉、花甘露糖含量分別在18.17%～21.05%、10.28%～11.11%和5.30%～5.75%之間，莖能達到《中國藥典》對甘露糖含量13%～38%的要求；不同栽培方式的鐵皮石斛莖甘露糖含量差異顯著（＜0.05，大棚栽培＞附石栽培＞附樹栽培）；大棚栽培的鐵皮石斛葉甘露糖含量與附石、附樹栽培的葉有顯著差異（＜0.05），而附石、附樹栽培的葉甘露糖含量差異不顯著（＞0.05）；附石、附樹栽培的鐵皮石斛花甘露糖含量與大棚栽培的花差異顯著（＜0.05），而附石、附樹栽培的花甘露糖含量差異不顯著（＞0.05）。

表5 3 種栽培方式的鐵皮石斛不同部位甘露糖含量比較分析Table 5 Content compare of mamnose in stems,leaves and flowers from D.officinale under three different cultivation methods

從甘露糖的含量總體評價鐵皮石斛，大棚栽培方式的質(zhì)量優(yōu)于附石、附樹栽培，附石優(yōu)于附樹栽培，這與鐵皮石斛多糖含量表現(xiàn)出相同變化規(guī)律，這說明栽培的基質(zhì)、養(yǎng)料和水分等外部環(huán)境對鐵皮石斛多糖和甘露糖含量影響是一致的。

3 結(jié)論

利用高溫高壓水蒸氣輔助硫酸水解鐵皮石斛多糖，采用響應(yīng)面法優(yōu)化水解工藝，以1 mol/L 的硫酸溶液為催化劑，料液比1:1.5、水解溫度112 ℃（壓強0.15 MPa）、水解44 min，甘露糖含量達64.35%±0.76%。該方法溫度、壓強可控，操作簡單，成本低，同時能殺滅微生物，用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域大規(guī)模不同樣品多糖水解生產(chǎn)高效可行。

通過比較分析鐵皮石斛莖、葉、花功能性成分多糖、甘露糖的含量，結(jié)果表明，不同栽培方式的鐵皮石斛莖、葉、花含豐富多糖及甘露糖，單糖主要為差向異構(gòu)體的甘露糖和葡糖糖，甘露糖質(zhì)量是葡糖糖的4.2～5.8 倍，可見鐵皮石斛莖、葉、花是甘露糖制備的天然優(yōu)質(zhì)資源。鐵皮石斛莖為《中國藥典》規(guī)定的藥用部位，從多糖、甘露糖的含量來評價，不同栽培方式的鐵皮石斛的莖都符合《中國藥典》標準；從食品、保健品開發(fā)的角度來看，非藥用部位葉及花具有廣闊的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價值，可以根據(jù)不同需要，充分利用鐵皮石斛附加資源葉和花，制作養(yǎng)生茶、食品保健品及添加劑等。