汪佑宏，崔浩然，張菲菲，江澤慧，余林鵬，楊明亮，馬建鋒，田根林

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園林學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.黃山華塑新材料科技有限公司，安徽 黃山 245900；3.國(guó)際竹藤中心，北京 100102）

棕櫚藤（rattan）是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景的熱帶和亞熱帶森林中的植物資源，屬于棕櫚科Palmae藤類(lèi)植物，全世界共有棕櫚藤13屬664種，其中我國(guó)自然分布有4屬43種26變種（新增多鱗藤屬M(fèi)yrialepis），但具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的僅20～30種[1-3]。棕櫚藤藤莖俗稱(chēng)藤條，長(zhǎng)度從幾米至170余米，直徑從3～80 mm甚至高達(dá)200 mm不等，平均節(jié)間長(zhǎng)度約20 cm。生長(zhǎng)中的成熟藤莖，除基部外被帶刺葉鞘所覆蓋，成熟后的藤莖呈奶黃、乳白等顏色，為僅次于木材和竹材的具有多種用途的林產(chǎn)品，被廣泛用于制造桌、椅、沙發(fā)、床等藤制家具，以及各種藤編小飾品等，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景[1-2]。

目前，對(duì)于棕櫚藤的研究多集中在構(gòu)造特征[4-7]、物理力學(xué)性質(zhì)[8-9]方面，對(duì)于化學(xué)性質(zhì)的研究涉及不多。棕櫚藤材化學(xué)成分主要包括細(xì)胞壁成分纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，以及抽提物、灰分等，大多數(shù)傳統(tǒng)的植物細(xì)胞壁的化學(xué)分析都是破壞性的，且僅僅顯示了生物質(zhì)中三大組分（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）在宏觀區(qū)域的含量和變異，如吳玉章[10]對(duì)單葉省藤、白藤和黃藤的化學(xué)組成進(jìn)行了研究，尚莉莉[11]對(duì)鉤葉藤纖維素、半纖維素含量的變異進(jìn)行了研究，不能體現(xiàn)出化學(xué)成分的微觀變異。同時(shí)，涉及到細(xì)胞壁微區(qū)化學(xué)成分變化的研究相對(duì)較少，如汪佑宏等[12-14]運(yùn)用可見(jiàn)光顯微分光光度計(jì)，對(duì)黃藤材導(dǎo)管、薄壁細(xì)胞和纖維細(xì)胞的木質(zhì)素微區(qū)分布進(jìn)行了研究。與可見(jiàn)光顯微分光光度計(jì)法定性測(cè)量相比，劉杏娥等[15]結(jié)合共聚焦顯微熒光和拉曼光譜成像技術(shù)系統(tǒng)，半定量地研究了黃藤材藤莖中不同類(lèi)型細(xì)胞及同一細(xì)胞不同形態(tài)區(qū)域的木質(zhì)素化學(xué)特點(diǎn)，得到了與Gierlinger等人[16]一致的研究結(jié)果。

總的來(lái)說(shuō)，目前針對(duì)木材[17-18]、竹材[19-20]細(xì)胞壁化學(xué)成分的微區(qū)分布進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，對(duì)棕櫚藤材細(xì)胞則僅集中在木質(zhì)素微區(qū)分布上。如何利用拉曼光譜成像技術(shù)，對(duì)棕櫚藤材細(xì)胞壁成分微區(qū)分布進(jìn)行研究，對(duì)于構(gòu)建其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模型、擴(kuò)大棕櫚藤材的用途、提高棕櫚藤材的利用率有著十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高地鉤葉藤Plectocomia himalayanaGriff.屬棕櫚科Palmae鉤葉藤屬Plectocomia，攀援、叢生、大徑藤（藤?gòu)?～5 cm），主要分布于中國(guó)、不丹、印度、尼泊爾、老撾、泰國(guó)等國(guó)家，其中我國(guó)主要分布于云南南部、西南部、西部地區(qū)海拔1 450～1 800 m的竹林、山地常綠闊葉林中；其藤莖質(zhì)地較粗糙，屬于劣質(zhì)材，一般用于編織較粗糙的藤器或柵欄[1-2]。

高地鉤葉藤采自云南南部的梁河縣平山鄉(xiāng)，海拔為1 480～1 500 m，選取健康、生長(zhǎng)適中的高地鉤葉藤10株，齊根伐倒后，去除葉鞘，測(cè)得藤莖直徑為13～30 mm，長(zhǎng)16～20 m，節(jié)間長(zhǎng)度為16.5～26.5 cm，每株藤材從基部向梢部每2 m長(zhǎng)截成一段并編號(hào)，待用。

1.2 研究方法

1.2.1 軟 化

選擇1株高地鉤葉藤（考慮到不同藤株間對(duì)應(yīng)部位無(wú)法保證為相同年份，故只選擇1株進(jìn)行分析），在高2 m處截取長(zhǎng)1 cm左右的試樣。將截取的藤莖試樣浸沒(méi)在盛水的燒杯中，置于微波爐內(nèi)“高火”檔，按10 min/次加熱，然后取出并迅速放入冷水中浸泡1 min左右；再按上述方法加熱、冷卻，如此循環(huán)至試樣下沉、變軟為止。

1.2.2 包 埋

將試樣置于裝有已溶的聚乙二醇（炭蠟）2000（Polyethylene glycol 2000）的容器中，移至真空干燥箱中按30 min/次重復(fù)抽真空16次；取出試樣再置于聚乙二醇4000（Polyethylene glycol 4000）中，按上述方法繼續(xù)抽真空16次后，取出試件至表面液體凝固并把表面多余的聚乙二醇固體刮除。

1.2.3 切 片

用Leica RM2265全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Leica Biosystems Nussloch GmbH）切取厚10 μm且完好的橫切面切片5片左右，室溫下用0.2 mol·L-1NaBH4溶液浸泡5～6 h，然后用蒸餾水洗凈并浸泡在蒸餾水中，備用。

1.2.4 數(shù)據(jù)采集

取出1片切片固定在載玻片上并置于拉曼顯微鏡下，分別在藤皮、藤中（藤皮、藤芯之間）及藤芯處各選擇1個(gè)完整的纖維細(xì)胞，每個(gè)部位至少選擇3個(gè)不同點(diǎn)，利用LabRam XploRA顯微共聚焦拉曼光譜儀（Horiba Jobin Yvon公司），依次對(duì)細(xì)胞角隅（CC）、復(fù)合胞間層（CML）、次生壁外層（S1）、次生壁中層（S2）及次生壁內(nèi)層（S3）采用逐點(diǎn)掃描顯微探針成像方法獲取光譜數(shù)據(jù)集。

光譜采集一般采用矩形掃描和直線(xiàn)掃描，矩形掃描主要用于成像分析，采譜時(shí)采用快速掃描功能，曝光時(shí)間0.66 s，掃描步長(zhǎng)0.33 μm；直線(xiàn)掃描主要用于組分分析，曝光時(shí)間3 s，以提高光譜采集的信噪比。采集時(shí)計(jì)算機(jī)控制平臺(tái)同步移動(dòng)，為使自動(dòng)平臺(tái)移動(dòng)實(shí)現(xiàn)較好的重復(fù)性（±0.2 nm）和較高的控制精度，應(yīng)用光柵尺反饋控制技術(shù)，共對(duì)3個(gè)纖維細(xì)胞至少9個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，再利用LabSpec5軟件進(jìn)行處理[21]。

其中掃描步長(zhǎng)為0.8 μm，激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm，功率為8 mW，單點(diǎn)采集時(shí)間1 s，狹縫寬度100 μm，孔隙大小為300 μm，拉曼光譜測(cè)試范圍為250～3 200 cm-1。為獲得較高的空間分辨率（0.23 μm，0.61 λ/NA），采用了100倍油鏡（MPlan 100×，oil，NA=1.35）采集拉曼信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤纖維主要化學(xué)成分微區(qū)分布的線(xiàn)譜分析

圖1為纖維細(xì)胞S2的平均拉曼光譜。圖1中纖維素的主要特征峰為2 890、1 376、1 115、1 090、378 cm-1，木質(zhì)素的主要特征峰為1 680、1 598 cm-1。拉曼位移2 890 cm-1歸屬于纖維素C-H和C-H2的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，1 090 cm-1是纖維素C-O-C糖苷鍵的非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，378 cm-1歸屬于纖維素β-D葡萄糖苷鍵。拉曼位移1 680 cm-1歸屬于松柏醇（或紫丁香醇）和松柏醛（或紫丁香醛）結(jié)構(gòu)，1 598 cm-1歸屬于苯環(huán)的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，而1 090 cm-1是重原子（C-C和C-O）的伸縮振動(dòng)；對(duì)應(yīng)的主要組分是纖維素、木聚糖、葡甘露聚糖（其中木聚糖與葡甘聚糖是組成半纖維素的重要物質(zhì)）[22-24]。

圖1 纖維細(xì)胞壁S2平均拉曼光譜Fig.1 Average Raman spectrum of S2 of fiber cell wall

圖2a為5個(gè)不同形態(tài)區(qū)，即CC（細(xì)胞角隅）、CML（復(fù)合胞間層）、S1（次生壁外層）、S2（次生壁中層）及S3（次生壁內(nèi)層）的平均光譜圖，線(xiàn)譜范圍為300～3 200 cm-1。在CC和CML線(xiàn)譜上，特征峰2 937 cm-1主要是木質(zhì)素中甲氧基的C-H鍵的伸縮振動(dòng)；而在S1、S2和S3線(xiàn)譜上，特征峰2 937 cm-1主要是纖維素中C-H鍵和C-H2的伸縮振動(dòng)。圖2中可以看出CC上該特征峰（2 937 cm-1）的信號(hào)很強(qiáng)，CML上較弱，而S1、S2、S3層上該信號(hào)更弱，完全被2 890 cm-1特征峰信號(hào)所覆蓋。另外，圖2中可以明顯看出在CC線(xiàn)譜中1 598 cm-1的峰強(qiáng)度比2 890 cm-1高，而在S（次生壁）中1 598 cm-1的峰強(qiáng)度比2 890 cm-1弱很多。

圖2a經(jīng)譜線(xiàn)分析處理得到圖2b—c。圖2b比較了CC、CML和S23個(gè)形態(tài)區(qū)的拉曼光譜，從中可以看出2 890 cm-1特征峰的拉曼強(qiáng)度在S2線(xiàn)譜上最強(qiáng)，CML次之，CC拉曼強(qiáng)度最弱，說(shuō)明S2纖維素濃度最高，而CC纖維素濃度最低，CML纖維素濃度介于S2和CC之間。另一特征峰1 598 cm-1的拉曼強(qiáng)度在CC線(xiàn)譜上最強(qiáng)，CML次之，而S2上的拉曼強(qiáng)度最弱，說(shuō)明S2木質(zhì)素濃度最低，而CC木質(zhì)素濃度最高，CML木質(zhì)素濃度介于S2和CC之間。這與木材細(xì)胞壁層中纖維素和木質(zhì)素分布結(jié)果是相同的[18,25]，與黃藤材纖維細(xì)胞壁中木質(zhì)素分布也是一致的[14-15]。

圖2c比較了S1、S2和S33個(gè)形態(tài)區(qū)的拉曼光譜，從中可以看出2 890 cm-1特征峰的拉曼強(qiáng)度在S1、S2和S33個(gè)形態(tài)區(qū)域相差不大，說(shuō)明這3個(gè)形態(tài)區(qū)纖維素的濃度相近，區(qū)別不明顯。1 598 cm-1特征峰的拉曼強(qiáng)度以S1最大，S3次之，S2最小，說(shuō)明這3個(gè)形態(tài)區(qū)之間木質(zhì)素濃度以S1最大，S3次之，S2最小。

圖2 譜線(xiàn)分析后纖維細(xì)胞平均拉曼光譜Fig.2 Average Raman spectra of fiber cells after line analysis

2.2 藤纖維拉曼成像分析

在顯微鏡下的試材橫切面上選擇具有代表性的纖維細(xì)胞，并對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行逐點(diǎn)掃描獲得拉曼光譜。由于纖維素的拉曼光譜信噪比在2 890 cm-1處最大，能夠得到較清晰的分布圖像，而木質(zhì)素的主要特征峰在1 598 cm-1處具有較好的信噪比，因此本研究選擇在2 780～3 060（用C-H以及C-H2伸縮振動(dòng)的空間分布規(guī)律來(lái)代表纖維細(xì)胞中纖維素的分布）、1 550～1 640（用苯環(huán)的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的空間分布規(guī)律來(lái)代表纖維細(xì)胞中木質(zhì)素的分布）以及1 026～1 195 cm-1（C-C和C-O-C伸縮振動(dòng)的空間分布規(guī)律來(lái)代表纖維細(xì)胞中半纖維素的分布）3個(gè)振動(dòng)區(qū)分別進(jìn)行拉曼成像[22-24]，結(jié)果如圖3所示。

圖3a為選擇的纖維細(xì)胞（如圖中箭頭所指），圖3b—d分別為纖維細(xì)胞中纖維素、木質(zhì)素、半纖維素的空間分布圖。圖3b的成像振動(dòng)區(qū)主要特征峰是2 890 cm-1，是纖維素的C-H以及C-H2伸縮振動(dòng)。在纖維細(xì)胞中可以明顯地看出纖維素在S2的拉曼信號(hào)最強(qiáng)，說(shuō)明此處纖維素的濃度最高，CML纖維素濃度次之，而CC纖維素的拉曼信號(hào)非常弱。圖3中能看到相鄰寬、窄兩壁層之間對(duì)比亮度有差異，寬層比窄層亮，說(shuō)明各壁層上的纖維素濃度不同，其中寬層的纖維素濃度高于窄層。

圖3c的成像振動(dòng)區(qū)主要特征峰是1 598 cm-1，是苯環(huán)的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)。纖維CC和CML的拉曼信號(hào)對(duì)比度很亮，其中CC最亮，而細(xì)胞其他壁層上的拉曼信號(hào)對(duì)比度很暗，說(shuō)明纖維細(xì)胞上的木質(zhì)素濃度在CC最高，CML次之，其他壁層上的木質(zhì)素濃度都很低，與前人對(duì)木材及黃藤的研究結(jié)果一致[14-15，24]。S2、S3中沒(méi)有明顯的對(duì)比度差異，說(shuō)明相鄰次生壁層之間木質(zhì)素濃度沒(méi)有明顯差異。

而圖3d的成像振動(dòng)區(qū)主要特征峰是1 090 cm-1，是重原子（C-C和C-O）的伸縮振動(dòng)，對(duì)應(yīng)的主要組分是纖維素、木聚糖、葡甘露聚糖。細(xì)胞中CC拉曼信號(hào)對(duì)比度很暗，CML次之，而S1的對(duì)比度最亮，S2和S3的對(duì)比度比S1稍暗，說(shuō)明細(xì)胞中S1半纖維素濃度最高，S2和S3較低，CML和CC最低，這與木材細(xì)胞壁層中半纖維素分布結(jié)果相反，原因有待進(jìn)一步分析[25]。此成像圖中細(xì)胞壁的左右方向拉曼信號(hào)對(duì)比度明顯比上下方向亮，這與圖3b中的情況正好相反，即細(xì)胞壁上下方向?qū)Ρ榷让黠@比左右方向亮。

圖3 纖維細(xì)胞（a）與纖維細(xì)胞中纖維素（b）、木質(zhì)素（c）、半纖維素（d）的分布圖像Fig.3 Fiber cell (a), distribution of cellulose (b), lignin (c), and hemicellulose (d) in fiber cells

3 討 論

纖維細(xì)胞次生壁中層木質(zhì)素濃度最低，而細(xì)胞角隅木質(zhì)素濃度最高，復(fù)合胞間層木質(zhì)素濃度介于次生壁中層和細(xì)胞角隅之間，不僅與黃藤材纖維細(xì)胞壁中木質(zhì)素分布是一致的[14-15]，而且與木材細(xì)胞壁層中木質(zhì)素分布也相同[18,25]。此外，與黃藤材薄壁細(xì)胞角隅木質(zhì)素濃度大于次生壁、復(fù)合胞間層木質(zhì)素濃度大于次生壁中層的結(jié)論也具有一定相似性（黃藤材薄壁細(xì)胞木質(zhì)素濃度為胞間層＞初生壁＞次生壁，而胞間層與初生壁合稱(chēng)為復(fù)合胞間層，說(shuō)明復(fù)合胞間層木質(zhì)素濃度大于次生壁）。此外，木質(zhì)素濃度以次生壁外層最大，內(nèi)層次之，中層最小。

盡管共聚焦拉曼光譜成像系統(tǒng)也存在一些不足，如對(duì)木質(zhì)素只能分析其總量分布，而無(wú)法分別測(cè)定藤纖維細(xì)胞壁中不同的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元即S型、G型和H型結(jié)構(gòu)單元；傳統(tǒng)共聚焦拉曼顯微鏡的針孔尺寸限制了共聚焦系統(tǒng)空間分辨率；此外，在進(jìn)行物質(zhì)的半定量化測(cè)試分析時(shí)還是存在一定的難度。但與利用可見(jiàn)分光光度計(jì)僅能對(duì)細(xì)胞壁木質(zhì)素微區(qū)分布進(jìn)行定性研究[12-14]相比，結(jié)合共聚焦拉曼光譜成像技術(shù)，不僅可以半定量化地系統(tǒng)研究細(xì)胞不同形態(tài)區(qū)域的木質(zhì)素微區(qū)分布[15-16]，而且還可以對(duì)纖維素、半纖維素的微區(qū)分布進(jìn)行測(cè)試，這也為通過(guò)研究棕櫚藤不同生長(zhǎng)階段細(xì)胞壁主要成分的微區(qū)分布，探討細(xì)胞壁成分的沉積過(guò)程，進(jìn)而為構(gòu)建棕櫚藤材細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模型提供理論依據(jù)。同時(shí)，應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)，可通過(guò)分析高地鉤葉藤等劣質(zhì)藤改性前后微觀構(gòu)造特征的變化，制定最佳材性改性工藝，實(shí)現(xiàn)劣藤優(yōu)用的最佳效益[26]。此外，針對(duì)分辨率不高的問(wèn)題，可通過(guò)形成光纖耦合共聚焦拉曼掃描顯微鏡來(lái)提高共聚焦分辨率和高光收集效率；或者通過(guò)時(shí)間門(mén)控方法，從時(shí)間維度剔除自發(fā)熒光、反射光和雜散光等信號(hào)的干擾，使得所成圖像具有更好的信噪比和更高的分辨率；或者通過(guò)超分辨率圖像復(fù)原技術(shù)對(duì)單個(gè)拉曼成像進(jìn)行超分辨率圖像恢復(fù)，達(dá)到高空間分辨率成像[27]。

總之，激光共聚焦掃描顯微鏡是集共聚焦原理、激光掃描技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)于一體的新型顯微鏡，由于其具有非接觸、高速測(cè)量及軸向?qū)游龀上竦葍?yōu)點(diǎn)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，對(duì)其不斷進(jìn)行完善和更新（如結(jié)合可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)不同的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行區(qū)分測(cè)量），共聚焦激光掃描顯微技術(shù)必將在更廣泛領(lǐng)域中得到應(yīng)用和推廣[27]。

4 結(jié) 論

高地鉤葉藤纖維細(xì)胞次生壁中層（S2）纖維素濃度最高，而細(xì)胞角隅（CC）纖維素濃度最低，復(fù)合胞間層（CML）纖維素濃度介于次生壁中層和細(xì)胞角隅之間，且纖維細(xì)胞次生壁內(nèi)層（S3）、中層（S2）、外層（S1）3個(gè)形態(tài)區(qū)纖維素的濃度相差不明顯。纖維細(xì)胞次生壁外層半纖維素濃度最高，中層和內(nèi)層較低，復(fù)合胞間層和角隅最低。纖維細(xì)胞壁次生壁（S）木質(zhì)素濃度低于復(fù)合胞間層（CML）。