蘇天生 盧靜 肖章武 王志民

心肌缺血是由于冠狀動脈狹窄而心肌供血不足、供氧不足引起。目前臨床上針對心肌缺血主要采用溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）來盡快恢復(fù)其血運，縮短缺血的時間，進(jìn)而挽救患者的生命[1]。但是在再灌注過程中，可導(dǎo)致組織損傷呈進(jìn)行性加重，即在缺血期間所引起的損傷性變化在再灌注后更為突出[2]。自由基生成在心肌缺血再灌注損傷中具有重要作用，依達(dá)拉奉作為一種有效的自由基清除劑和抗氧化劑，用于心肌缺血再灌注中具有良好的保護(hù)作用，減少再灌注損傷的發(fā)生[3-4]。而在進(jìn)一步的研究中有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-聯(lián)蛋白（β-catenin）信號通路與心肌細(xì)胞的凋亡、壞死及氧化應(yīng)激具有重要的關(guān)聯(lián)[5]。中成藥參附注射液以“益氣回陽，溫通心脈”的治則用于心肌缺血再灌注治療可有效改善心電圖，降低心律失常發(fā)生率，抑制心肌細(xì)胞凋亡[6]。為此，參附注射液結(jié)合依達(dá)拉奉是否能進(jìn)一步增強療效受到了臨床的高度關(guān)注。本文將對兩種藥物單獨應(yīng)用與聯(lián)合應(yīng)用于大鼠的效果進(jìn)行對比分析，以證實兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時的有效性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動物材料 本次的研究對象為動物材料，50只SPF級的SD大鼠，均為雄性SD大鼠。納入標(biāo)準(zhǔn)：日齡 ＞56 d；體重在 300～400 g；雄性大鼠。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有血管疾??；實驗過程中死亡。所有SD大鼠的喂養(yǎng)環(huán)境溫度為25 ℃，相對濕度為50%。所有SD大鼠在納入本實驗后喂養(yǎng)1周開始進(jìn)行實驗，本研究的實驗過程嚴(yán)格遵守相關(guān)條例操作。

1.1.2 主要儀器 日本Olympus公司的BX51型光學(xué)顯微鏡，美國Perkin Elmer公司的XElx800型酶標(biāo)儀，荷蘭Philips公司的1E33型超聲心動圖檢查儀，美國Harvard Apparatus公司的ALC-V8S型小動物呼吸機，德國Eppendorf公司的Centrifuge 5424R型低溫高速離心機等。

1.1.3 主要試劑 SOD酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（上海西格生物有限公司，批號XG-E0829），MDA酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（深圳子科生物科技有限公司，批號ZK-R3358），胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號25200056），7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號CA1410）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組、模型建立與給藥 （1）分組：將50只大鼠編號后采取隨機數(shù)字表法分為五組，每組10只，分別為空白組、對照組、治療1組、治療2組、治療3組。（2）模型建立：通過手術(shù)給予對照組與3組治療組大鼠進(jìn)行心肌缺血模型的建立。采用濃度為1%的戊巴比妥鈉（生產(chǎn)廠家：上海新亞藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31021725，規(guī)格：0.1 g）對大鼠進(jìn)行麻醉，使用劑量為50 mg/kg，采取腹腔注射給藥方式。將大鼠以仰臥體位固定在手術(shù)臺上。對其胸部進(jìn)行常規(guī)消毒后，將該處皮膚與部分肋骨剖開，使得大鼠的心臟顯露，將左冠狀動脈前降支分離并結(jié)扎，直至其左心室前壁的部分心肌組織呈現(xiàn)白色，即成功建立心肌缺血模型大鼠，最后進(jìn)行切口的縫合。在手術(shù)期間，使用小動物呼吸機維持大鼠的呼吸頻率在100次/min，維持呼吸比為1∶2，維持潮氣量為8 ml。（3）給藥：將對照組與3組治療組的大鼠通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支引起心肌缺血，再灌注前1 min給予治療1組參附注射液[生產(chǎn)廠家：華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z51020664，規(guī)格：10 ml/瓶 ]9 ml/kg，給予治療 2 組依達(dá)拉奉（生產(chǎn)廠家：山東羅欣藥業(yè)集團股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字 H20183189，規(guī)格：5 ml∶10 mg）10 mg/kg，給予治療3組參附注射液9 ml/kg聯(lián)合依達(dá)拉奉10 mg/kg，給予對照組生理鹽水 10 mg/kg，空白組大鼠不做任何處理（健康大鼠）。

1.2.2 大鼠組織取材 在完成心功能檢測后將大鼠處死，取其心臟后進(jìn)行心室前壁組織與心肌組織的分離。將心室前壁組織浸泡于濃度為4%的多聚甲醛固定液中，共24 h，備用。心室前壁組織用于檢測Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，心肌組織用于檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 心功能指標(biāo) 使用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，并將大鼠固定于手術(shù)臺上，采用超聲心動圖檢測其心功能指標(biāo)，包括左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）?？瞻捉M大鼠檢測1次心功能指標(biāo)即可，對照組與3組治療組的大鼠分別在灌注10、30、60 min各進(jìn)行1次心功能指標(biāo)檢測。

1.3.2 心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，分別將酶標(biāo)儀設(shè)定為490、695 nm波長的條件下進(jìn)行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的檢測。采用DCFH-DA熒光探針法檢測活性氧（ROS），使用流式細(xì)胞儀測得ROS的水平。

1.3.3 心室前壁組織中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法進(jìn)行檢測心室前壁組織中的Wnt1、β-catenin表達(dá)水平，通過全自動凝膠成像系統(tǒng)成像后，采取Image J v1.8.0軟件分析，取蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為該蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般資料對比

各組大鼠一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），有可比性，見表1。

表1 各組大鼠一般資料對比（±s）

表1 各組大鼠一般資料對比（±s）

組別 日齡（d） 體重（g）空白組（n=10） 63.00±4.00 331.42±12.63對照組（n=10） 62.00±3.00 330.23±15.81治療1組（n=10） 63.00±3.00 333.81±15.25治療2組（n=10） 62.00±4.00 331.75±15.31治療3組（n=10） 63.00±4.00 330.89±12.46 F值 0.230 0.090 P值 0.922 0.986

2.2 各組心功能指標(biāo)對比

空白組LVEF與LVFS分別為（61.75±3.36）%與（44.79±2.68）%。對照組及治療1、2、3組LVEF、LVFS均低于空白組（P＜0.05）；治療1、2、3組LVEF、LVFS均高于對照組（P＜0.05）；治療1、2組LVEF、LVFS比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但治療1、2組LVEF、LVFS均低于治療3組（P＜0.05），見表2。

表2 各組心功能指標(biāo)對比[%，（±s）]

表2 各組心功能指標(biāo)對比[%，（±s）]

注：空白組LVEF與LVFS分別為（61.75±3.36）%與（44.79±2.68）%。*與同時點空白組對比，P＜0.05；#與同時點對照組對比，P＜0.05；△與同時點治療3組對比，P＜0.05。

組別 灌注 10 min 灌注 30 min 灌注 60 min LVEF LVFS LVEF LVFS LVEF LVFS對照組（n=10） 43.37±2.06* 25.58±1.69* 41.75±2.18* 24.07±1.65* 39.69±2.27* 23.95±1.71*治療 1 組（n=10） 46.65±1.88*#△ 28.69±1.75*#△ 49.21±1.75*# △ 31.58±1.88*# △ 53.31±2.12*#△ 33.65±1.81*#△治療 2 組（n=10） 46.79±1.85*#△ 28.75±1.79*#△ 49.63±1.81*# △ 31.69±1.82*# △ 53.88±2.15*#△ 33.83±1.79*#△治療3組（n=10） 49.26±1.69*# 31.46±2.07*# 53.36±2.07*# 35.46±2.12*# 57.89±2.46*# 40.76±2.07*#

2.3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)對比

對照組及治療1、2、3組SOD均低于空白組，MDA、ROS均高于空白組（P＜0.05）。治療 1、2、3組SOD均高于對照組（P＜0.05），MDA、ROS均低于對照組（P＜0.05）。治療1、2組 SOD、MDA、ROS比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但治療1、2組SOD均低于治療3組，MDA、ROS均高于治療3組（P＜0.05），見表3。

表3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)對比（±s）

表3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)對比（±s）

*與同時點空白組對比，P＜0.05；#與同時點對照組對比，P＜0.05；△與同時點治療3組對比，P＜0.05。

組別 SOD（U/mg） MDA（nmol/mg） ROS空白組（n=10） 88.63±3.75 3.92±0.58 44.38±3.07對照組（n=10） 36.85±1.69* 9.79±0.97* 75.66±4.25*治療 1 組（n=10） 65.57±3.62*#△ 5.42±1.01*#△ 58.63±5.42*#△治療 2 組（n=10） 65.88±3.56*#△ 5.33±0.97*#△ 57.99±5.38*#△治療 3組（n=10） 80.42±3.84*# 4.89±0.72*# 50.69±4.86*#

2.4 各組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平對比

對照組及治療1、2、3組 Wnt1、β-catenin表達(dá)水平均高于空白組（P＜0.05）；治療1、2、3組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平均低于對照組（P＜0.05）；治療1、2組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療1、2組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平均高于治療3組（P＜0.05），見表 4。

表4 各組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平對比（±s）

表4 各組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平對比（±s）

*與同時點空白組對比，P＜0.05；#與同時點對照組對比，P＜0.05；△與同時點治療3組對比，P＜0.05。

組別 Wnt1 β-catenin空白組（n=10） 0.91±0.15 1.12±0.16對照組（n=10） 1.88±0.21* 1.68±0.19*治療 1 組（n=10） 1.29±0.18*#△ 1.47±0.21*#△治療 2 組（n=10） 1.33±0.19*#△ 1.47±0.19*#△治療3組（n=10） 1.17±0.16*# 1.29±0.18*#

3 討論

當(dāng)發(fā)生心肌缺血再灌注損傷時，由于血運已經(jīng)處于異常狀態(tài)，心肌細(xì)胞線粒體、血管內(nèi)皮細(xì)胞中黃嘌呤氧化酶與中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)及兒茶酚胺氧化等途徑造成的大量自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致生物膜的結(jié)構(gòu)受到損傷，引起脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，大量的細(xì)胞內(nèi)酶被釋放出，導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損[7]。參附注射液與依達(dá)拉奉均對心肌缺血再灌注具有保護(hù)作用[8-9]，兩者聯(lián)合將可成為心肌缺血再灌注治療中的心肌保護(hù)治療新方案，以下將對兩者的作用效果及作用機制進(jìn)行分析。

從此次的研究結(jié)果可知，隨著再灌注時間的延長，對照組LVEF、LVFS逐漸降低，而治療1、2、3組LVEF、LVFS逐漸升高。表明在再灌注前使用參附注射液和/或依達(dá)拉奉均能發(fā)揮保護(hù)心肌的作用，減少再灌注損傷的發(fā)生。但治療1、2組LVEF、LVFS無顯著差異，且兩組LVEF、LVFS均低于治療3組。表明參附注射液與依達(dá)拉奉聯(lián)合應(yīng)用時比單獨用藥的效果更為顯著，可發(fā)揮更強的心肌保護(hù)作用，進(jìn)而心功能得到更顯著的改善。氧化應(yīng)激在心肌缺血引起的損傷過程中具有重要作用[10]。SOD、MDA、ROS是3項評估氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要指標(biāo)。SOD屬于一種抗氧化金屬酶，能夠?qū)Τ蹶庪x子自由基產(chǎn)生催化作用，進(jìn)而歧化生成氧及過氧化氫，是平衡機體氧化與抗氧化過程的重要物質(zhì)，當(dāng)SOD水平降低時則反映出機體發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷[11]。ROS是化學(xué)反應(yīng)活性自由基，由于其具有高度反應(yīng)性，當(dāng)其生成量過高時，將引發(fā)氧化應(yīng)激，造成DNA損傷、蛋白質(zhì)功能障礙等，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與壞死[12]。MDA是脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物，其變化水平與ROS的變化水平呈正相關(guān)[13]。本次研究中，對照組與治療1、2、3組SOD均低于空白組，MDA、ROS均高于空白組。由此可看出相比于健康大鼠，心肌缺血大鼠存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。治療1、2、3組SOD高于對照組，MDA、ROS均低于對照組。治療1、2組SOD、MDA、ROS無顯著差異，且該兩組的SOD均低于治療3組，MDA、ROS高于治療3組。表明參附注射液與依達(dá)拉奉均能夠減輕心肌缺血大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時的減輕效果更為顯著。除了氧化應(yīng)激反應(yīng)以外，Wnt/β-catenin信號通路與也與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)。據(jù)相關(guān)研究報道，在健康的心肌組織中，Wnt/β-catenin信號通路為失活狀態(tài)，在出現(xiàn)缺血現(xiàn)象的心肌組織或者發(fā)生梗死的心肌組織中，Wnt/β-catenin信號通路則表現(xiàn)為過度活化的狀態(tài)，該信號通路的活化可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，以及促進(jìn)心室的重塑[14]。在本次研究中，對照組及治療1、2、3組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平均高于空白組。證實了心肌缺血大鼠相比健康大鼠的心肌組織發(fā)生了明顯的Wnt/β-catenin信號通路活化。治療1、2、3組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平低于對照組，治療1、2組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平無顯著差異，且該兩組Wnt1、β-catenin表達(dá)水平均高于治療3組。表明在再灌注前使用參附注射液與依達(dá)拉奉能夠降低Wnt/β-catenin信號通路的活化狀態(tài)，進(jìn)而減少其誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象發(fā)生，當(dāng)兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時可增大降低Wnt/β-catenin信號通路活化狀態(tài)的程度，進(jìn)而發(fā)揮更顯著的保護(hù)效果。

綜上所述，參附注射液與依達(dá)拉奉均對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用的效果得以顯著增強，主要通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)控Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白發(fā)揮作用，進(jìn)而改善心功能。