李松，李瑞杰，趙小磊

（1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院泌尿外科，河南 開封 475000；2.鄭州市第二人民醫(yī)院綜合科，河南 鄭州 450000）

腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma）是泌尿系統(tǒng)腎細(xì)胞癌的一個(gè)獨(dú)特亞型，根治性切除是腎細(xì)胞癌的主要治療方法，其次是化療和靶向治療。然而，即使手術(shù)治療成功，仍有30%的患者可能出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-3]。不同基因突變的患者可能對(duì)不同的藥物治療產(chǎn)生耐藥性，因此對(duì)不同基因突變的患者進(jìn)行個(gè)體化治療更為重要[4]。因此，確定腎細(xì)胞癌進(jìn)展和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物和潛在相關(guān)分子機(jī)制是必要的，尋找潛在相關(guān)的靶向藥物對(duì)于個(gè)體化治療至關(guān)重要。Xu J等[5]研究證實(shí)，CDKN2A 啟動(dòng)子甲基化發(fā)生在支氣管細(xì)胞癌變的早期。Hayashi T等[6]研究了胃癌患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)CDKN2A的失活通常是由5'CpG 島的純合缺失和高甲基化引起的，這在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Wang L等[7]發(fā)現(xiàn)，在77 例平滑肌肉瘤患者中，22%的患者存在CDKN2A 基因啟動(dòng)子高甲基化，表明CDKN2A 啟動(dòng)子高甲基化及其蛋白表達(dá)缺失與預(yù)后不良密切相關(guān)。然而，CDKN2A 在腎細(xì)胞癌中的作用尚不確定[8]。CDKN2A 突變狀態(tài)可能影響某些腎細(xì)胞癌患者的病情進(jìn)展和治療。因此，探索CDKN2A 突變患者的一些相關(guān)信號(hào)通路將有助于進(jìn)一步了解腎細(xì)胞癌進(jìn)展的分子水平機(jī)制，并為患者的個(gè)體化治療策略提供指導(dǎo)。為了探索腎細(xì)胞癌預(yù)后和個(gè)體化治療反應(yīng)的機(jī)制，本研究對(duì)腎細(xì)胞癌的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集以分析基因突變，研究泛癌和腎細(xì)胞癌中CDKN2A 突變的藥物敏感性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 從在線探索工具TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載（http://xena.ucsc.edu/）腎細(xì)胞癌基因表達(dá)譜（使用AgilentG4502A_07_3的腎細(xì)胞癌RNA 表達(dá)和突變基因）和臨床信息。采用開源網(wǎng)絡(luò)工具cBioPortal 分析Kaplan-Meier 圖和CDKN2A 突變（http://www.cbioportal.org/index.do）。BioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.cbioportal.org）整合了各種基因數(shù)據(jù)類型，包括TCGA、UCSC、GDAC 等，從cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得600份腎細(xì)胞癌樣本，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選選項(xiàng)，提取患者相關(guān)資料，篩選條件：①“Cancer Type：KIRC”；②“Gene：CDKN2A”；③“Data Type：mRNA”。應(yīng)用survival 選項(xiàng)分析600 份樣本中CDKN2A 突變情況與生存時(shí)間（總體生存和無(wú)疾病生存）關(guān)系圖，對(duì)3 種不同腎細(xì)胞癌研究中突變類型的mRNA 表達(dá)進(jìn)行比較。

1.2 GDSC 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 癌癥藥物敏感性基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（GDSC）（https://www.cancerrxgene.org/）是癌癥臨床研究中最常用的數(shù)據(jù)庫(kù)之一，收集了大量關(guān)于腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的信息，進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(kù)所有藥物的界面，將“CDKN2A”數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)與化合物敏感性相關(guān)聯(lián)，查看泛癌和腎細(xì)胞癌中CDKN2A 突變?cè)谒幬锏募?xì)胞系IC50圖，并繪制和生成與相應(yīng)藥物敏感性的火山圖和散點(diǎn)圖。

1.3 基因集富集分析 基因集富集分析（GSEA）用于評(píng)估按表型相關(guān)性排序的基因列表中預(yù)定義基因集中的基因分布，以確定它們對(duì)表型的作用（http://software.org/gsea/下載.jsp）。應(yīng)用分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)（MSigDB），基于標(biāo)稱P值和標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（NES）分析路徑富集。根據(jù)CDKN2A 基因表達(dá)量分為兩組，通過(guò)GSEA4.1.0 分析CENPF 基因表達(dá)水平對(duì)各種生物通路基因集的影響，按照默認(rèn)富集加權(quán)統(tǒng)計(jì)方法，選擇MSigDB 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因集（c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt）作為參照基因集，置換次數(shù)為1000 次，計(jì)算基因富集得分（enrichment score，ES）。

1.4 差異基因（DEGs）的鑒定與富集分析 使用R軟件包在微陣列數(shù)據(jù)中選擇-Log10（Pvalue）＞2 且∣Log2（fold change）∣＜1的DEGs。由DAVID（http://david.ncifcrf.gov）對(duì)DEGs 進(jìn)行KEGG 途徑和GO 富集分析，其中FDR＜0.05，-LogFDR＞1.302的前幾個(gè)通路被認(rèn)為是顯著的。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Wilcoxon 試驗(yàn)比較突變型和野生型之間的CDKN2A mRNA 表達(dá)水平；采用Kaplan-Meier 法和Log rank 檢驗(yàn)，通過(guò)Graphpad 計(jì)算不同CDKN2A 組之間的臨床結(jié)果；edgeR 和GSEA中的FDR 分別采用Benjamini-Hochberg 程序進(jìn)行多次試驗(yàn)調(diào)整，以控制FDR。P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎細(xì)胞癌中的CDKN2A 表達(dá)及突變 600 例腎細(xì)胞癌樣本中有5.00%的CDKN2A 突變病例，其余為野生型（圖1A）。CDKN2A 在腎細(xì)胞癌中的突變類型包括亞基突變、錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔兒涂缭秸麄€(gè)基因的深度缺失（圖1B）。其中，3.00%為深度缺失，2.00%為錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔兒蚷nframe 突變（圖2A）。CDKN2A 突變類型為深度缺失的mRNA 表達(dá)低于野生型（圖2B）；與突變型相比，野生型的CDKN2A 表達(dá)較高（圖2C）；CDKN2A 在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)高于正常腎組織。

圖1 腎細(xì)胞癌中CDKN2A的突變

圖2 腎細(xì)胞癌中CDKN2A的突變表達(dá)

2.2 CDKN2A 基因突變對(duì)腎細(xì)胞癌患者預(yù)后和藥物敏感性的影響 腎細(xì)胞癌患者的臨床特征見表1，生存分析顯示，具有CDKN2A 突變的腎細(xì)胞癌患者總體生存率和無(wú)病生存率較差（圖3），在泛癌和腎細(xì)胞癌中，CDKN2A 突變型可能比野生型增加對(duì)Tenovin-6 等藥物的耐藥性，并且Tenovin-6 對(duì)各種癌癥和腎細(xì)胞癌中的野生型具有選擇性（圖4）。

圖3 CDKN2A 基因突變對(duì)腎細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響

圖4 CDKN2A 基因突變對(duì)腎細(xì)胞癌患者藥物敏感性的影響

表1 腎細(xì)胞癌患者的臨床特征

2.3 基于GSEA的CDKN2A 突變信號(hào)通路分析GSEA 分析顯示，CDKN2A 突變信號(hào)通路主要富集在Wnt-catenin 信號(hào)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、緊密連接、TGF-β 信號(hào)、磷脂酰肌醇信號(hào)、erbb 信號(hào)和粘附連接（圖5）。2.4 DEGs的鑒定和富集分析 共有350 個(gè)基因被鑒定為DEGs，包括170 個(gè)下調(diào)基因和180 個(gè)上調(diào)基因。DEGs的火山圖見圖6A。使用DAVID 對(duì)DEGs進(jìn)行富集分析，GO 分析結(jié)果表明，DEGs 主要富集于RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物和序列特異性DNA 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，見圖6B。KEGG 通路分析顯示，DEGs 主要富集于細(xì)胞周期、癌癥、慢性髓系白血病、癌癥中的microRNA 和p53 信號(hào)通路，見圖6C。

圖5 腎細(xì)胞癌CDKN2A 突變的GSEA 富集分析

圖6 DEGs的鑒定和富集分析

3 討論

CDKN2A 基因位于染色體9p21 上，受調(diào)控的CDKN2A 蛋白包含156 個(gè)氨基酸，在細(xì)胞周期中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖并抑制腫瘤的產(chǎn)生，該基因的失活可導(dǎo)致細(xì)胞分離控制和惡性進(jìn)展為腫瘤[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，該基因在許多腫瘤中丟失或發(fā)生突變。CDKN2A基因失活的機(jī)制包括啟動(dòng)子甲基化、純合缺失和點(diǎn)突變，平均頻率分別為33%、22%和15%；另外，研究還發(fā)現(xiàn)9p21 區(qū)域雜合性缺失與腫瘤發(fā)生有關(guān)[10]。

CDKN2A 在各種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中突變類型包括純合缺失（HD）、雜合性缺失（LOH）、p16INK4a/p14ARF 基因啟動(dòng)子的突變和異常甲基化[11]。Ibrahim I等[12]研究了肺癌、卵巢癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的89 個(gè)細(xì)胞系中246 個(gè)位點(diǎn)的純合缺失，發(fā)現(xiàn)CDKN2A 基因的純合缺失最常見（26%），且與疾病預(yù)后的關(guān)系不同。本研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞中約5.00%的患者攜帶CDKN2A 突變，包括亞基突變、錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔兒涂缭秸麄€(gè)基因的深度缺失，其中3.00%為深度缺失，2.00%為錯(cuò)義突變、截?cái)嗤蛔兒徒送蛔?。Thompson ED等[13]發(fā)現(xiàn)，CDKN2A的總突變率為93.3%，啟動(dòng)子異常甲基化占46.7%，純合缺失占36.7%，突變占13.3%。

Ibrahim IS等[14]發(fā)現(xiàn)，CDKN2A 啟動(dòng)子甲基化與直腸癌患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)，表明CDKN2A 啟動(dòng)子甲基化可作為預(yù)測(cè)直腸癌預(yù)后的指標(biāo)。Potjer TP等[15]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者的腫瘤組織中存在一種特殊的CDKN2A 突變，表明CDKN2A 突變可能被用作胰腺癌的標(biāo)志物。本研究顯示，CDKN2A 突變的腎細(xì)胞癌患者總體生存率和無(wú)病生存率較差，這表明CDKN2A 突變可能有助于腎細(xì)胞癌的進(jìn)展。除此之外，降低CDKN2A 表達(dá)水平已被證明可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療或放療的耐受性[16]。因此，CDKN2A 可以作為新的抗癌治療策略的靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，CDKN2A 突變對(duì)Tenovin-6 等藥物的敏感性較低，這表明Tenovin-6 突變?cè)谥委熒系念A(yù)后較差，并且在各種癌癥和腎細(xì)胞癌中，Tenovin-6 對(duì)野生型具有顯著的選擇性。隨著組蛋白去乙?；福℉DAC）的發(fā)展，HDAC 抑制劑（HDACi）已成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)[17]。Tenovin-6 是近年來(lái)開發(fā)的一種HDACi，是脫乙酰酶SIRT1的抑制劑，選擇性地抑制Ⅲ類HDACs 中最常見的SIRT1 和SIRT2，并激活P53，具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。Tenovin-6 可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和周期阻滯[18]。這些研究為腎細(xì)胞癌患者個(gè)體化應(yīng)用特異性抗腫瘤藥物提供了額外證據(jù)，并為進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌患者CDKN2A 突變信號(hào)通路主要富集Wnt-catenin 信號(hào)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、緊密連接、TGF-β 信號(hào)、磷脂酰肌醇信號(hào)、erbb信號(hào)和粘附連接。已有研究證實(shí)[12]，CDKN2A 基因的負(fù)調(diào)控途徑是RB1 途徑。CDKN2A 蛋白包含四個(gè)連續(xù)的錨蛋白重復(fù)序列，它們與CDK4 和CDK6 結(jié)合，而CDK4 和CDK6 是一種雙周期依賴性蛋白激酶，作用于CDK4-6的非催化側(cè)，可抑制CDK 和細(xì)胞周期蛋白D1 復(fù)合物的催化活性[19]。CDKN2A 突變可能通過(guò)影響多種途徑促進(jìn)腎細(xì)胞癌的進(jìn)展，CDKN2A突變患者的腫瘤可能更容易進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[20]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，GO 分析中差異基因主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控中。

綜上所述，多個(gè)基因和通路途徑可能在CDKN2A 突變中起關(guān)鍵作用。本研究確定了與腎細(xì)胞癌中CDKN2A 突變相關(guān)的主要途徑，這可能通過(guò)制定腎細(xì)胞癌特定CDKN2A 突變亞型的治療策略來(lái)改善腎細(xì)胞癌的預(yù)后。另外，腎細(xì)胞癌中CDKN2A突變的機(jī)制和驗(yàn)證仍需在臨床和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。