韓新寧，張 慧，張俊華，王 芳，李 明

（1.寧夏師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，寧夏 固原 756000；2.寧夏師范學(xué)院數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)學(xué)院，寧夏 固原 756000；3.寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，銀川 750021；4.寧夏大學(xué)地理科學(xué)與規(guī)劃學(xué)院，銀川 750021；5.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，銀川 750021）

0 引 言

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是寧夏的支柱產(chǎn)業(yè)之一。隨著種植年限的延長，枸杞園土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量先增加后減少，約9年時肥力質(zhì)量最高，然后開始退化[1]，微生物多樣性逐漸降低、數(shù)量減少[2,3]，對根系生物活性的毒害作用增大[4]；約12年后枸杞品質(zhì)和產(chǎn)量顯著下降，一般植株砍伐后改種其他作物，但棄耕現(xiàn)象也時有發(fā)生。農(nóng)田棄耕撂荒是一種生態(tài)系統(tǒng)的自然恢復(fù)措施，對不同恢復(fù)階段土壤肥力和微生物群落進(jìn)行研究，能夠及時了解土壤質(zhì)量變化趨勢，改進(jìn)土壤管理措施，有助于土壤資源的可持續(xù)利用[5]。

土壤類型、撂荒年限及土壤深度對土壤理化性狀和微生物群落影響都較大[6,7]。如川中丘陵區(qū)耕地撂荒后土壤砂粒增加，粉粒減少；撂荒后土壤有機(jī)碳、全鉀、堿解氮略有增加，全氮顯著增加，C/P 和N/P 極顯著升高，而全磷、有效磷、速效鉀和C/N 顯著降低[8]。昆明東北部的耕地撂荒后土壤全氮增加61.5%，而堿解氮增幅并不顯著；隨著撂荒年限的增加，20～40 cm 有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷波動中呈現(xiàn)上升趨勢；土壤酶活性則表現(xiàn)為表層高于下層[9]。Nyamadzawo等[10]和Datta等[11]都發(fā)現(xiàn)撂荒后土壤碳含量和有機(jī)碳儲量在表層顯著提高，但隨著深度的增加逐漸降低[12]。Hepp 等[13]和Meyer 等[14]指出撂荒4年及更長時間后土壤總有機(jī)碳和易氧化有機(jī)碳含量呈下降趨勢。黃土高原撂荒地有機(jī)碳、全氮、MBC、MBN、全FAME、真菌、細(xì)菌和G-含量均高于農(nóng)用地，有助于改善該地區(qū)土壤微生物特性[15]。微生物群落物種豐富度在撂荒前15年呈上升趨勢，之后迅速下降[6]。目前，關(guān)于耕地撂荒的環(huán)境效應(yīng)是積極還是消極，一直存在爭論[16]。

雖然目前寧夏老齡枸杞園撂荒現(xiàn)象并不普遍，但已有增加趨勢，而關(guān)于撂荒對土壤質(zhì)量的影響卻鮮見報(bào)道。為此，本研究系統(tǒng)探究了寧夏老齡枸杞園不同撂荒年限土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落組成及多樣性變化趨勢，然后分析了二者的相互關(guān)系，旨在為撂荒枸杞園土壤質(zhì)量演變、復(fù)耕和綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

寧夏中衛(wèi)市中寧縣（105°26ˊ～106°7ˊE，37°09ˊ～37°50ˊN）是寧夏枸杞品質(zhì)最好、種植面積最大的地區(qū)。選擇該縣種植12年以上的老齡枸杞園5 處，2017年還在采摘中，但由于枸杞品質(zhì)和產(chǎn)量嚴(yán)重下降，從2018年開始同時被農(nóng)戶棄耕撂荒（撂荒后枸杞植株均沒挖走，但大多已逐漸枯死，園內(nèi)也沒有任何水、肥、藥管理，雜草叢生）。本研究于2017-2021年7月底連續(xù)5年（分別表示撂荒前對照、撂荒第1年、第2年、第3年和第4年，編號分別為CK、A1、A2、A3和A4）在距離枸杞植株冠層正下方采集0～20 和20～40 cm 土壤樣品（D1 和D2）。每個土樣均選擇在5 棵枸杞植株下采集，相同土層混勻后保留1.0 kg立即封口并放入保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室。土樣剔除雜質(zhì)后，測定含水量，并將剩余樣品分為兩份，一份-20 ℃保藏，用于土壤微生物群落的測定，另一份風(fēng)干后測定土壤基本理化性質(zhì)指標(biāo)。

1.2 土壤基本理化性質(zhì)測定方法

土壤含水量—烘干法；pH值—酸度計(jì)法；全鹽—質(zhì)量法；有機(jī)質(zhì)—外加熱法；全氮—凱氏定氮法；堿解氮—堿解擴(kuò)散法；速效磷—Oslen 法；速效鉀—乙酸銨提取-火焰光度計(jì)法；銨態(tài)氮—蒸餾法；硝態(tài)氮—紫外分光光度法。

1.3 微生物測定方法

土壤DNA提取。采用Power soil DNA Isolation Kit 土壤微生物總DNA 提取試劑盒提取土壤細(xì)菌總DNA。提取后的DNA 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行檢測，合格DNA 稀釋至1 ng/L 保存于-80 ℃用于PCR擴(kuò)增。

PCR 擴(kuò)增及測序。細(xì)菌核糖體編碼基因相應(yīng)區(qū)段的擴(kuò)增及測序服務(wù)由北京諾禾致源生物信息公司完成。土壤DNA 提取完成后，進(jìn)行16S rDNA 的V4 區(qū)擴(kuò)增，所用引物為515F/806R （5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。高通量測序由諾禾致源Illumina HiSeq 2500 平臺運(yùn)行，最后所測得數(shù)據(jù)在250～300 bp 之間產(chǎn)生。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel、SPSS 20.0 和CANOCO 4.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 撂荒枸杞園土壤基本理化性狀

與撂荒前相比，枸杞園撂荒后0～40 cm 土層含水量普遍顯著增加（表1）；含鹽量、全氮、NH4+-N和NO3--N含量均顯著下降。撂荒第4年表層土壤含水量、有機(jī)質(zhì)和堿解氮比對照土壤分別增加18.55%、23.70%和60.15%，而含鹽量、全氮、速效磷、NH4+-N 和NO3--N 分別降低68.70%、47.78%、30.94%、34.34%和91.50%。隨著撂荒年限的增加，0～20 cm 土層有機(jī)質(zhì)、堿解氮和速效磷含量整體顯著增加，全氮則逐漸減少；pH、全鹽、速效鉀、NH4+-N 和NO3--N 含量變化無規(guī)律；20～40 cm土層各理化指標(biāo)變化也無明顯規(guī)律。

表1 不同撂荒年限枸杞園土壤基本理化指標(biāo)變化情況Tab.1 Soil physicochemical properties at different abandoned ages in Lycium barbarum L.old orchard

2.2 撂荒枸杞園土壤微生物群落多樣性

撂荒第1年枸杞園0～20 cm 土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 都小于撂荒前（表2），但20～40 cm 各指標(biāo)均顯著高于撂荒前（除Shannon未達(dá)顯著水平）。從撂荒第1年到第3年，表層土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 均逐漸增大，且除Shannon外增幅都達(dá)顯著水平，第4年時又有所降低，各指數(shù)水平與撂荒第2年相當(dāng)。在20～40 cm 土層，撂荒第2年到第4年，土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 均逐漸增大，其中Richness、Chao1 和ACE 增幅均達(dá)顯著水平。所以，在老齡枸杞園撂荒過程中，細(xì)菌多樣性指數(shù)有增大趨勢，但表層與表下層變化規(guī)律不盡相同。

表2 不同撂荒年限枸杞園土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Tab.2 Characteristics of diversity of soil bacterial communities at different abandoned ages

2.3 撂荒枸杞園土壤細(xì)菌群落組成

在門水平上，枸杞園0～40 cm 土層撂荒前后土壤相對豐度最高的3 個優(yōu)勢菌門依次均為Proteobacteria、unidentified_Bacteria 和Acidobacteriota（圖1）。在相對豐度較高的前10 個菌門中，與對照相比，撂荒園Proteobacteria、Acidobacteriota和Nanoarchaeota 相對豐度分別增加15.19%、28.38% 和53.11%，但Bacteroidota、Actinobacteriota 和Cyanobacteria 相對豐度分別減少26.72%、40.09%和46.13%。撂荒園土壤中，不同土層優(yōu)勢菌門相對豐度差異也較大：0～20 cm 土層Proteobacteria、Bacteroidota 和Actinobacteriota 分別比20～40 cm高25.26%、160.37%和32.02%，而Chloroflexi、Crenarchaeota和Nanoarchaeota 比20～40 cm 低31.88%、74.03% 和74.00%。隨撂荒年限的增加，表層Proteobacteria、Actinobacteriota 相對豐度逐漸增大，unidentified_Bacteria、Acidobacteriota則有逐漸減小的趨勢。

圖1 撂荒枸杞園土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門相對豐度Fig.1 Relative abundances of dominant bacteria at phylum level in soil at different abandoned ages

2.4 撂荒枸杞園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

通過高通量測序，對數(shù)量在前30 位的屬做熱圖進(jìn)行分析（圖2）。撂荒后土壤優(yōu)勢菌屬為MND1、Sphingomonas、RB41、Pseudomonas 和Nitrosarchaeum 等，撂荒前土壤優(yōu)勢菌屬為Pseudomonas、MND1、RB41、Nitrosarchaeum 和Sphingomonas等。與撂荒前相比，撂荒后土壤Hymenobacter、Limnobacter、Cavicella、Polaromonas、Luteolibacter、Planococcus、Nafulsella、Brevundimonas、Devosia、Massilia 和Sphingomonas 數(shù)量分別增加了13.18、8.97、6.24、4.02、3.42、2.69、2.25、2.11、2.02、1.28 和0.99 倍，增幅均達(dá)極顯著水平，而Candidatus_Methylomirabilis、Flavisolibacter、unidentified_Chloroplast、Pseudomonas、Sphingobacterium、Salinimicrobium、Pontibacter和Lysobacter 分別降低了91.37%、72.98%、64.79%、59.24%、53.94%、44.23%、42.64%和37.17%。雖然撂荒后0～20 cm 土層和20～40 cm 土層數(shù)量最多的3 個屬都是Sphingomonas、RB41 和MND1，但0～20 cm 土層Sphingomonas 比20～40 cm 高84.16%，而RB41和MND1則低了25.04%和25.82%。

圖2 不同撂荒年限土壤屬水平優(yōu)勢細(xì)菌相對豐度Fig.2 The relative percentages of the bacterial genus in soil at different abandoned ages

2.5 撂荒枸杞園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析

主坐標(biāo)分析（PCoA）是一種常用的數(shù)據(jù)降維方法，可反映各個樣本群落組成的相似性或差異性。樣本間距離越小，細(xì)菌群落組成的相似度越高；反之，細(xì)菌群落組成的差異性越大[17]。由圖3可以看出，撂荒前和撂荒第1年的土壤與撂荒2～4年的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，表層微生物群落結(jié)構(gòu)間差異大于表下層。

圖3 不同撂荒年限土壤細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinates analysis of bacteria communities structures of soil at different abandoned ages

2.6 撂荒枸杞園土壤基本理化性質(zhì)與微生物群落的關(guān)系

Pearson 相關(guān)分析表明（表3），土壤含鹽量、全氮和NO3--N 含量與撂荒枸杞園土壤細(xì)菌群落多樣性指標(biāo)關(guān)系較密切，且多樣性指數(shù)普遍與這3個指標(biāo)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。在10 個優(yōu)勢菌門中，除unidentified_Bacteria 和Firmicutes和各理化指標(biāo)關(guān)系較差外，其他8種優(yōu)勢菌門與其普遍有較強(qiáng)的相關(guān)性，其中，Cyanobacteria、Bacteroidota、Proteobacteria、Actinobacteriota 與土壤養(yǎng)分呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而Crenarchaeota、Acidobacteriota、Chloroflexi、Nanoarchaeota 與養(yǎng)分普遍呈顯著或及顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；Cyanobacteria、Bacteroidota 與土壤含水率、pH 均呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；Acidobacteriota 與pH 和全鹽呈極顯著負(fù)相關(guān)，而Actinobacteriota則與這兩個指標(biāo)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

3.1 撂荒枸杞園土壤基本理化性質(zhì)變化

連作常造成土壤養(yǎng)分失衡、微生物多樣性下降[18]。老齡枸杞園由于枸杞產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，故被棄耕撂荒。隨著撂荒年限的增加，枸杞根系逐漸死亡，自然植被大量生長，每年都有較多枯落物進(jìn)入土壤，經(jīng)微生物分解后逐漸轉(zhuǎn)化為有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分[19]，所以表層土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷逐漸增加。Yang 等[20]研究指出，短期撂荒能顯著提高表層土壤總有機(jī)碳含量，而較深土層的碳固持能力會變?nèi)?，與本研究結(jié)論一致。隨著撂荒年限的增加，土壤全氮含量逐漸降低，可能是因?yàn)殍坭綀@撂荒前每年都施用較多氮肥，在撂荒前期還有部分未被枸杞植株和其他植物吸收利用，所以全氮含量較高，撂荒后不再施肥，枯落物和死亡根系增加的氮不足以支持植物的吸收利用，故全氮含量逐漸降低。同時，研究區(qū)土壤為砂質(zhì)壤土，氮在土壤中的轉(zhuǎn)化和移動性較強(qiáng)，土壤中的氮可能隨著雨水流失或通過反硝化作用轉(zhuǎn)化損失到空氣中[21]。土壤NH4+-N 和NO3--N 是植物吸收利用的主要氮形態(tài)，隨著撂荒年限的增加，NH4+-N 和NO3--N 呈非線性變化，與以往研究一致[22]。

3.2 撂荒枸杞園土壤細(xì)菌多樣性與組成變化

由于退耕第1年枸杞園耕作施肥等管理措施才停止，當(dāng)時土壤退化較嚴(yán)重，短期內(nèi)還未得到明顯恢復(fù)，所以撂荒第1年土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)仍較低。此后，伴隨大量草本植物入侵，根系分泌物增多，增加了土壤中有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的含量，為利用這些物質(zhì)的細(xì)菌群落代謝和合成提供了養(yǎng)分來源，直接或間接促進(jìn)微生物群落多樣性發(fā)展[19,23]，所以土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)逐漸增大。到撂荒第4年時，適應(yīng)性強(qiáng)的草本植物逐漸變?yōu)閮?yōu)勢種群，其他植物逐漸消失，植物群落多樣性減少，間接引起表層土壤中細(xì)菌群落多樣性減小，但表下層受根系分布、土壤溫度、濕度、呼吸等因素的影響，對植物群落的變化反饋較慢[24]，故表下層土壤多樣性指數(shù)仍高于撂荒第3年。本研究土壤Proteobacteria 和Acidobacteriota 的相對豐度表現(xiàn)為撂荒初期高于撂荒后期，這可能與Proteobacteria 和Acidobacteriota屬于寡營養(yǎng)型反硝化微生物有關(guān)，它們在養(yǎng)分有效性較低的環(huán)境中反而具有較高的相對豐度[25]；而Chloroflexi 和Actinomycetes 屬于富營養(yǎng)型反硝化細(xì)菌門[26]，處于撂荒后期群落具有充足的有效養(yǎng)分，因此撂荒后期相對豐度較高。撂荒第2年Sphingomonas 和Lysobacter 數(shù)量較第1年急劇增加，但Bacillus 急劇減少。以往研究表明，Sphingomonas 能促進(jìn)芳香族化合物的降解，對于保護(hù)環(huán)境具有潛在的應(yīng)用價值[27]，Hymenobacter 嚴(yán)格耗氧，具有多種植物促生特性[28]，撂荒后這兩種屬的數(shù)量顯著增加，說明撂荒后土壤呼吸顯著增強(qiáng)[25,29]；撂荒土壤Limnobacter 和Cavicella 數(shù)量比對照高8.97 倍和6.24倍，這兩種屬都是有機(jī)污染物降解菌/多環(huán)芳烴（PAHs）降解菌[28,30]；Bacillusa 具有較高的抗逆性，能夠在環(huán)境惡劣的條件下存活[23]，撂荒第2年后土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分都逐漸增加，土壤環(huán)境逐步改善，所以Bacillus 減少，這都是撂荒能夠逐漸提升地力的證據(jù)。

3.3 枸杞園撂荒過程中土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落的關(guān)系

土壤理化性質(zhì)是土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成門變化的主要影響因子[31]。Tajik 等[32]開展了伊朗北部森林生態(tài)系統(tǒng)中土壤理化性質(zhì)與土壤微生物之間的關(guān)系研究，結(jié)果表明土壤有機(jī)質(zhì)、pH值、電導(dǎo)率和全氮均會對土壤微生物適宜習(xí)性有顯著影響。本研究中，土壤水分、pH 與Cyanobacteria、Bacteroidota、Acidobacteriota 和Actinobacteriota 呈顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，說明pH 是影響土壤細(xì)菌組成的關(guān)鍵因子[31]。在已有報(bào)道中，Proteobacteria 被認(rèn)為與碳利用有關(guān)，是世界上最為普遍的菌門[31]，Acidobacteriota 與土壤養(yǎng)分有較強(qiáng)相關(guān)性[33]，本研究也證實(shí)了這些結(jié)論。Lauber 等[34]研究指出酸性土壤Bacteroidota與土壤pH 呈顯著正相關(guān)，而本研究結(jié)果顯示Bacteroidota 與pH 呈顯著負(fù)相關(guān)，這是由于研究區(qū)土壤屬于堿化土壤，與李晶晶和續(xù)勇波[35]等在堿化土壤上的結(jié)論一致。Na 等[36]等研究發(fā)現(xiàn)，土壤有效磷含量是影響連作枸杞非根際土壤細(xì)菌群落的主要因素，本研究中多個優(yōu)勢菌門與有效磷都呈極顯著相關(guān)關(guān)系，說明土壤有效磷對撂荒枸杞園土壤細(xì)菌群落也有顯著影響[37]。整體來講，在本研究土壤理化性狀中，全氮、含水率、速效磷、速效鉀、NO3--N 與細(xì)菌群落相關(guān)性更強(qiáng)。說明枸杞園撂荒過程中對土壤細(xì)菌群落而言，土壤水分和養(yǎng)分是其主控因素。

4 結(jié) 論

（1）枸杞園撂荒能夠顯著增加0～40 cm 土層含水量、有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量，降低含鹽量、全氮、NH4+-N 和NO3--N 含量。撂荒年限越長，0～20 cm 土層有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷含量越高，全氮含量越低。

（2）撂荒前3年，表層土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)逐漸增大。撂荒后土壤優(yōu)勢菌門 Proteobacteria、Acidobacteriota 和Nanoarchaeota 相對豐度分別比撂荒前增加15.19%、28.38%和53.11%，Bacteroidota、Actinobacteriota 和Cyanobacteria 相對豐度分別減少26.72%、40.09%和46.13%。不同撂荒年限、不同土層優(yōu)勢菌門相對豐度差異也較大。

（3）在屬水平上，與對照相比，撂荒園土壤有益菌Hymenobacter、Limnobacter 和Cavicella 數(shù)量顯著增加，而Candidatus_Methylomirabilis 和病原菌Flavisolibacter 等顯著降低，說明撂荒后土壤細(xì)菌群落向著有益菌數(shù)量增多、病原菌數(shù)量減少的良好態(tài)勢變化。

（4）寧夏老齡枸杞園在撂荒過程中土壤全氮、含水量、速效磷、速效鉀和NO3--N 與土壤細(xì)菌群落多樣性及優(yōu)勢菌門相對豐度相關(guān)性較強(qiáng)。