朱清亮，李增平，張 宇

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

木麻黃（Casuarina equisetifolia）是屬于雙子葉植物綱（Dicotyledoneae）、木麻黃科（Casuarinaceae）、木麻黃屬（Casuarina）的一類綠化常綠喬木，在中國廣東、廣西、海南等省區(qū)均有栽培。由于木麻黃具有速生、抗風(fēng)、固沙、耐鹽、耐干旱、耐瘠薄等特點(diǎn)，故成為我國南方濱海防風(fēng)固沙不可缺少的一類優(yōu)良樹種[1]。海南省于1955年開始建設(shè)包括木麻黃林在內(nèi)的沿海防護(hù)林。目前，海南全境木麻黃純林與混交林總面積超過5萬hm2，分布在?？?、儋州、文昌、萬寧等沿海12個(gè)市縣的73個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)[2]。木麻黃海防林的建設(shè)在抵御臺(tái)風(fēng)，保持水土，改善自然生態(tài)，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)建設(shè)上均發(fā)揮了舉足輕重的作用[3]。據(jù)報(bào)道，木麻黃病害目前總計(jì)有14種，分為非侵染性病害、細(xì)菌性病害、真菌性病害與其他病害。其中非侵染性病害中的衰退病與細(xì)菌性病害中的青枯病為主要病害，其余均為真菌性病害[4]。海南沿海種植多年的木麻黃海防林，由于其莖干易受到臺(tái)風(fēng)、害蟲的危害，造成大量傷口，故易被病原木腐真菌侵染定殖而發(fā)生真菌性根腐和莖腐，甚至部分重病株整株死亡[5]。在木麻黃靈芝病害方面，陳禮浪與吳如慧[6-8]分別鑒定木麻黃紅根病和莖腐病病原菌為熱帶靈芝(Ganoderma tropicum)與二孢假芝（Amauroderma subresinosum）并進(jìn)行了生物學(xué)特性測(cè)定；單金雪[9]發(fā)現(xiàn)南方靈芝（Ganoderma australe）能引起木麻黃莖腐病并完成了其生物學(xué)特性研究。筆者在海南省昌江縣棋子灣海濱木麻黃林中發(fā)現(xiàn)獨(dú)體木麻黃活樹上有一種靈芝菌引起的莖腐病，田間發(fā)病率2%，重病株整株枯死，此靈芝菌的擔(dān)子果有明顯的同心環(huán)紋與漆樣光澤，與報(bào)道的熱帶靈芝和南方靈芝均不相同，而且經(jīng)初步鏡檢發(fā)現(xiàn)其擔(dān)孢子形態(tài)也不同于熱帶靈芝等已知種，推測(cè)可能為狹長孢靈芝（Ganoderma boninensePat.）。狹長孢靈芝是一類在油棕上引起嚴(yán)重破壞性莖基腐病的重要靈芝病原菌[10]，近年來在海南與臺(tái)灣的檳榔上也有發(fā)現(xiàn)[11]。程樂樂等[7]和陳禮浪等[12]在調(diào)查海南棕櫚科植物木腐菌時(shí)曾在檳榔活樹、椰子和木麻黃死樹上發(fā)現(xiàn)狹長孢靈芝。目前，還未見狹長孢靈芝引起的木麻黃活立木莖腐病的詳細(xì)報(bào)道。本研究從木麻黃活樹莖基部進(jìn)行取樣，對(duì)病害靈芝菌樣本進(jìn)行病原菌分離、鑒定和致病性測(cè)定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究此類病菌及生產(chǎn)上莖腐病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣本樣本于 2018 年 1 月采自海南省昌江縣昌化鎮(zhèn)棋子灣發(fā)病木麻黃活立木，擔(dān)子果編號(hào)為HNCJ201801001。用保鮮袋包裝樣本并帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、Richard、燕麥 (OMA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）、玉米(CMA)培養(yǎng)基的配置參考文獻(xiàn)[13]的方法，木麻黃莖干煎汁培養(yǎng)基的配置參考文獻(xiàn)[14]的方法，木屑培養(yǎng)基的配置參考文獻(xiàn)[15]的方法。

1.3 試 劑 與 實(shí) 驗(yàn) 器 材OMEGA FungalDNA Kit購自美國 OMEGA 公司， DL2000 DNAMarker購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。2xSanTaq-Mix購自生工生物股份有限公司。攝影生物顯微鏡為日本Olympus BX-51。PCR 產(chǎn)物測(cè)序與相關(guān)引物的合成由鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。引物序列見表1。

表 1 用于擴(kuò)增 ITS與 LSU基因的引物序列

1.4 菌株的分離采用組織分離法，在新鮮擔(dān)子果表面用含70%酒精的醫(yī)用無菌棉擦拭、消毒，再用無菌的手術(shù)刀切去表層，切取5 mm×5 mm的內(nèi)層菌肉放到PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后，對(duì)生長出來的形態(tài)符合的菌株進(jìn)行純化，將獲得的編號(hào)為HNCJ201801001菌株轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基于28 ℃黑暗條件下擴(kuò)繁，保存和備用。

1.5 接種體的制備從長有 HNCJ201801001 菌株的PDA培養(yǎng)基上切取1 cm×1 cm的菌絲塊，放置在高壓蒸汽滅菌后的木屑培養(yǎng)基中，透明膠帶封口后在黑暗常溫狀態(tài)下培養(yǎng)21 d，當(dāng)整個(gè)培養(yǎng)基表面布滿菌絲，可用于致病性測(cè)定。對(duì)照組采用接入空白PDA培養(yǎng)基塊的木屑培養(yǎng)基，其他條件與處理方式均與處理組接種體相同。

1.6 致病性測(cè)定對(duì)待接種木麻黃幼樹的莖基部用70%酒精進(jìn)行消毒，再用手術(shù)刀削開表皮將制備好的接種體貼在切口上，在下方用無菌水潤濕過的棉花保濕，最后用保鮮袋與膠帶進(jìn)行固定。處理組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，對(duì)照組使用空白木屑培養(yǎng)基。完成后定期澆水，定期觀察苗木長勢(shì)并拍照。

1.7 擔(dān)子果誘導(dǎo)將木屑培養(yǎng)基裝滿 300 mL 組培瓶并滅菌，挑取分離到的菌株放入組培瓶中28 ℃黑暗培養(yǎng)，待組培瓶表面長滿菌絲時(shí)開蓋，放入盛有無菌水的玻璃瓶中進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔10 d觀察靈芝長勢(shì)并拍照。

1.8 病原菌鑒定(1)形態(tài)鑒定：參考《中國真菌志》[18]與《中國大型真菌》[19]等文獻(xiàn)，對(duì)擔(dān)子果進(jìn)行宏觀形態(tài)鑒定。切取擔(dān)子果內(nèi)部組織，制片，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，測(cè)量并拍照。(2)分子鑒定：參考邢佳慧[20]、袁濱[21]、OGHENEKARO[22]文獻(xiàn)，選用并合成用于擴(kuò)增ITS基因與LSU基因的引物。對(duì)純化后的HNCJ201801001菌株在PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，5 d后收集菌絲體，使用 OMEGA Fungal DNA Kit 提取其總 DNA。用合成的2對(duì)引物擴(kuò)增ITS與LSU基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)和純化回收后送往公司測(cè)序。將獲得的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)并提交NCBI。

在GenBank上搜尋靈芝與其他屬中同時(shí)含有ITS與LSU基因的菌株，下載其ITS與LSU序列并用 Sequence Matrix軟件進(jìn)行拼接，用MEGA7.0對(duì)包含HNCJ201801001在內(nèi)的所有序列通過NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.9 生物學(xué)特性測(cè)定將 HNCJ201801001 菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，然后在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，接種到各組的培養(yǎng)基上，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。每組除所研究變量外，其他培養(yǎng)條件組均統(tǒng)一設(shè)為 28 ℃，24 h黑暗，PDA培養(yǎng)基。5 d后使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。試驗(yàn)組條件設(shè)置：

（1）溫度：設(shè)置 15、20、25、28、30、32、35、37，40 ℃ 共 9 個(gè)處理組。

（2）光照：設(shè)置 24 h 黑暗、24 h 光照、12 h 光暗交替3個(gè)處理組。

（3）pH值：用NaOH與HCl將培養(yǎng)基pH依次調(diào)節(jié)到2～10，共9個(gè)處理組。

（4）培養(yǎng)基：設(shè)置 PDA、PSA、Ricards、燕麥(OMA)、玉米(CMA)和木麻黃莖干煎汁培養(yǎng)基6個(gè)處理組。

研究取得的數(shù)據(jù)用Excel軟件統(tǒng)計(jì)記錄，分析并生成圖表。使用SAS8.1軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，木麻黃活樹受侵染后，葉片失綠無光澤，繼而發(fā)黃脫落，部分小枝條枯死，樹冠稀疏，生長不良，重病植株在3～5 a內(nèi)整株枯死?？梢杂^察到紅褐色或漆黑色、有柄和無柄的擔(dān)子果在病樹的下部莖干上和地面附近的莖基部長出，產(chǎn)生擔(dān)孢子的擔(dān)子果表覆蓋1層土褐色的擔(dān)孢子粉，擔(dān)子果上表面有明顯的細(xì)密同心環(huán)紋與漆樣光澤（圖1-A，B，C，D，E）。病樹莖基部木質(zhì)部組織白腐，病株在田間發(fā)病率為2%左右。田間發(fā)病植株的地上部分癥狀與熱帶靈芝(G.tropicum)引起的紅根病、南方靈芝(G.australe)和二孢假芝（Amauroderma subresinosum）引起的莖腐病癥狀相似，均會(huì)呈現(xiàn)樹冠稀疏、生長不良等的相同癥狀，主要區(qū)別在于病樹莖干基部生長出的病菌擔(dān)子果形態(tài)不同[7-9]。

圖1 木麻黃莖腐病田間發(fā)病癥狀

2.2 致病性測(cè)定接種 60 d 后，檢查 HNCJ2018-01001菌株對(duì)木麻黃樹接種部位的侵染的情況，發(fā)現(xiàn)木麻黃接種處長出白色菌絲，病原菌已經(jīng)成功侵染植株。120 d后，組織白色腐朽，木麻黃頂部枝葉開始發(fā)黃。5個(gè)月后，接種的木麻黃幼樹樹冠稀疏，生長發(fā)育不良，8個(gè)月后整株枯死，與田間癥狀基本一致，對(duì)照組無明顯變化。在病株接種部位再分離得到相同的菌株，顯示所分離的HNCJ201801001菌株為木麻黃莖腐病的致病菌。將HNCJ201801001菌株接入裝滿木屑培養(yǎng)基的350 mL組培瓶中，30 d后菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)基，120 d后長出與病原樣本的形態(tài)相一致的擔(dān)子果（圖2-A，B，C，D）。

圖2 木麻黃莖腐病病原菌的致病性測(cè)定

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察（1）菌落特征：菌株生長呈圓形，5 d內(nèi)可以生長至直徑8 cm。菌絲純白色，菌絲濃密，平伏生長，無氣味，老化后轉(zhuǎn)為淡黃色，邊緣整齊（圖3-A）。（2）擔(dān)子果：擔(dān)子果一年生，有柄或無柄，新鮮擔(dān)子果菌肉呈軟木栓質(zhì)，干燥后轉(zhuǎn)為木質(zhì)。菌蓋扇形，表面基部中央凸起或疊生一至多個(gè)小扇形擔(dān)子果，具有漆狀光澤，自基部向外有明顯的放射狀皺紋和致密的環(huán)紋，幼小子實(shí)體淺黃色，成熟后表面從橙色到淡紅褐色，老化后為非常暗褐色，大多數(shù)漆黑色；菌蓋邊緣薄或厚鈍，邊緣厚0.2～0.7 cm，幼時(shí)奶油色，隨著擔(dān)子果成熟與老化逐漸變?yōu)辄S褐色與紫褐色；下表面的近基部呈灰褐色，靠菌蓋邊緣處漸呈灰白色。擔(dān)子果大小為（14～18）cm×（9～12）cm，基部厚 2～5 cm，柄粗1.8～2.7 cm，柄長 5.5～6.8 cm；菌肉不分層，呈褐色，接近菌管處為深褐色，擔(dān)子果中存在有黑色殼質(zhì)層結(jié)構(gòu)[18]（圖3-B，C，D）。

圖3 木麻黃靈芝莖腐病病原菌形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)

（3）顯微特征：從自然寄主上生長的擔(dān)子果上切取菌組織和挑取擔(dān)孢子粉進(jìn)行鏡檢。菌絲三體型，骨架菌絲厚壁實(shí)心，呈樹枝狀，直徑3～5 μm。纏繞菌絲無色，厚壁，直徑1～2 μm。生殖菌絲透明薄壁，直徑4～7 μm。擔(dān)孢子為狹長的卵圓形，部分頂端平截，雙層壁，外壁平滑，無色透明，內(nèi)壁有小刺，淺黃褐色，部分有油滴。大小為（8.9 ～11.7）μm×（4.2 ～ 5.5）μm，平均長為 10.15 μm，平均寬為 5.01 μm，長寬比Q=1.679 ～ 2.373（圖3-E，F(xiàn)）。

2.3.2 分 子 鑒 定測(cè) 序 結(jié) 果 顯 示 菌 株 HNCJ-201801001 的 rDNA-ITS 序列為 609 bp（序列號(hào)：OK643485.1），LSU 序列為 590 bp（序列號(hào)：OK64-3883.1）。將2種基因拼接后與1.8中獲得的序列進(jìn)行聯(lián)合建樹（表2）。結(jié)果表明，HNCJ201801001菌株與狹長孢靈芝遺傳距離最小聚為一類（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析結(jié)果，將引起海南昌江木麻黃莖腐病的病原靈芝菌鑒定為狹長孢靈芝（Ganoderma boninensePat.）。

圖4 HNCJ201801001菌株與靈芝屬相關(guān)種基于ITS與LSU基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 生物學(xué)特性測(cè)定

2.4.1 不同溫度對(duì)木麻黃狹長孢靈芝莖腐病病原菌生長的影響在不同溫度下，HNCJ201801001菌株生長情況差異顯著。HNCJ201801001菌株在15～35 ℃的溫度條件下均可生長，適宜生長溫度為 25～32 ℃，其中28 ℃時(shí)生長最好。37 ℃時(shí)病原菌完全停止生長，由此可得該病菌最適生長溫度為 28 ℃（圖5）。

圖5 不同溫度對(duì)木麻黃莖腐病病原菌 HNCJ201801001菌絲生長的影響

2.4.2 不同光照條件對(duì)木麻黃狹長孢靈芝莖腐病病原菌生長的影響HNCJ201801001菌株在3種光照情況下的菌落直徑有一定差異。在24 h光照條件下，HNCJ201801001菌株菌絲生長最慢，邊緣透明稀薄，長勢(shì)最弱。在12 h光暗交替條件下，HNCJ201801001菌株菌絲生長較慢，邊緣厚度不均勻。在24 h黑暗狀態(tài)下菌落生長最快，菌落生長均勻，邊緣整齊，厚度最厚（圖6）。

圖6 不同光照對(duì)木麻黃莖腐病病原菌 HNCJ201801001菌絲生長的影響

2.4.3 不同pH值對(duì)木麻黃狹長孢靈芝莖腐病病原菌生長的影響HNCJ201801001菌株在pH 3～8之間均可以正常生長，pH 4～7時(shí)生長得比較快。pH從2到5時(shí)，菌株生長速度隨pH升高而加快。pH從5到9時(shí)，菌株生長速度隨pH升高而減慢，最適生長pH為5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弱酸性環(huán)境相比中性與堿性環(huán)境更適合該致病菌株的生長（圖7）。

圖7 不同 pH 對(duì)木麻黃莖腐病病原菌 HNCJ201801001 菌絲生長的影響

表 2 用于分子鑒定的菌株及其ITS與LSU基因登錄號(hào)

2.4.4 不同培養(yǎng)基對(duì)木麻黃狹長孢靈芝莖腐病病原菌生長的影響HNCJ201801001菌株在6種培養(yǎng)基上均可以生長。不同處理組菌落的生長速率與狀況有明顯差異，其中，PDA與PSA培養(yǎng)基上的菌落菌絲層厚，生長最快；木麻黃莖干煎汁與燕麥培養(yǎng)基(CMA)上的菌落生長直徑較大，但菌絲層薄于PDA與PSA培養(yǎng)基；在玉米(OMA)培養(yǎng)基上的菌落生長較慢, 菌絲層較稀??；在Richards培養(yǎng)基上的菌落菌絲層接近透明，呈不規(guī)則多邊形，生長最慢，長勢(shì)極差（表3）。

表 3 不同培養(yǎng)基培對(duì)木麻黃莖腐病病原菌HNCJ201801001菌絲生長的影響

3 討 論

靈芝是靈芝屬（Ganoderma）真菌的總稱，目前世界范圍內(nèi)靈芝屬有131個(gè)種，其中中國有23個(gè)種[23]。靈芝是一類重要的藥用真菌，在中國作為滋補(bǔ)強(qiáng)壯的名貴藥材，已有超過2 000 a的藥用歷史。靈芝屬真菌均為木腐菌，其中的部分種類會(huì)引起樹木的根腐病或莖基腐病，導(dǎo)致樹木枯死，如靈芝 (Ganoderma lucidum)、橡膠樹靈芝 (G.pseudoferreum) 、有柄樹舌 (G.applanatum)和熱帶靈芝(G.tropicum)等。NAIDU 等[24]于 1966 年報(bào)道靈芝菌寄主植物有19科36屬48種，是一類重要的林木病原木腐菌。狹長孢靈芝(G.boninense)在馬來西亞與印度尼西亞等國家是油棕(Elaeis guineensis)莖基腐病的主要病原菌，油棕被感染后引起莖基腐病并導(dǎo)致整株死亡，造成經(jīng)濟(jì)的損失超過5億美元[25]。狹長孢靈芝在我國的分布以海南省為主[23]。目前，國內(nèi)外對(duì)狹長孢靈芝的相關(guān)報(bào)道主要集中在化學(xué)成分、病害防治和基因組等幾個(gè)方面[26-28]，尚未出現(xiàn)關(guān)于狹長孢靈芝引起木麻黃活立木莖腐病的研究報(bào)道。

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，確定了引起海南昌江木麻黃活立木莖腐病的病原菌為狹長孢靈芝。生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果顯示，25～32 ℃均較適合該病原菌生長，其最適生長溫度為28 ℃，最適pH為5；光照影響菌絲生長，病原菌在完全黑暗狀態(tài)下生長速率最快；狹長孢靈芝適宜在PDA與PSA培養(yǎng)基上生長。程樂樂等[12]研究了引起海南陵水檳榔莖腐病的狹長孢靈芝，其適宜生長溫度為 26～30 ℃，最適生長溫度為 28 ℃，最適pH為5～6，光照抑制菌絲生長，最優(yōu)碳源為蔗糖，與本研究結(jié)果基本一致，但陵水檳榔狹長孢靈芝在34 ℃以上不生長，而木麻黃狹長孢靈芝菌株在35 ℃依然可以生長，這可能是由于地區(qū)環(huán)境條件與寄主物種不同導(dǎo)致。筆者在田間調(diào)查時(shí)于?？诠鹆盅?、澄邁橋頭、昌江濕地公園、萬寧烏場(chǎng)等地海濱多年生長的木麻黃活樹和死樹莖基部均發(fā)現(xiàn)生長有狹長孢靈芝的擔(dān)子果，田間發(fā)病率約2%。

目前，國內(nèi)有不少由靈芝屬病原菌引起木麻黃莖腐或根腐病的報(bào)道。陳禮浪等[6]發(fā)現(xiàn)熱帶靈芝能導(dǎo)致木麻黃紅根??；吳如慧等[8]與單金雪等[9]分別報(bào)道二孢假芝與南方靈芝是引起木麻黃莖腐病病原菌。

與本研究中的狹長孢靈芝相比，熱帶靈芝新鮮擔(dān)子果同樣具有漆狀光澤，菌肉褐色，但其表面由中央到邊緣為紅褐色、紫紅色逐漸變淺至黃白至白色。熱帶靈芝主要導(dǎo)致紅根病，在田間癥狀上會(huì)表現(xiàn)出病根表面粘泥沙的特點(diǎn)，且水洗后可見棗紅色革質(zhì)菌膜。二孢假芝與南方靈芝均會(huì)導(dǎo)致木麻黃基部莖干組織白腐，但南方靈芝無光澤，擔(dān)子果多為土褐色，菌肉肉桂色，有黑色殼質(zhì)層，而二孢假芝表面有一定光澤，表面紅褐色或紫褐色，多數(shù)有同心環(huán)帶，但其菌肉一般為白色或淺黃色。本研究中的狹長孢靈芝，擔(dān)子果上表面紅褐色，有漆狀光澤，與南方靈芝特征不同。菌蓋邊緣為橘黃色，靠近中部變?yōu)榧t或暗紫色，有明顯的同心環(huán)紋和放射狀突起縱脊，可與熱帶靈芝相區(qū)分。菌肉為褐色，長有黑色殼質(zhì)層，區(qū)別于二孢假芝。狹長孢靈芝同樣也能導(dǎo)致木麻黃活樹莖干組織白腐。靈芝屬中多種木腐真菌均可以導(dǎo)致木麻黃莖腐或根腐病的發(fā)生。