蔣彧, 涂勛良, 何俊蓉

四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，四川 成都 610000

春蘭（Cymbidium goeringii）是蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）中的一個種，具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值?！蚊贰侵袊禾m傳統(tǒng)銘品，為梅瓣花的代表品種，被譽為春蘭“四大天王”之首，“春蘭之王”等，幽香馥郁，濃而不濁，深受廣大蘭友的喜愛。

鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶（Magnesium protoporphyrin Ⅸ methyltransferase，ChlM）是葉綠素合成過程中的關(guān)鍵酶，也是重要的調(diào)控酶，其活性受到光照、葉綠體氧化還原狀態(tài)和葉片中葉酸含量調(diào)控。此外，鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶不僅影響PSⅠ、PSⅡ和Cytb6f 蛋白復(fù)合體內(nèi)重要蛋白的積累，參與葉綠體到細胞核的反向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還通過調(diào)控ChlH 表達影響鎂螯合酶活性[1]。原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶是單基因產(chǎn)物，定位在葉綠體被膜和類囊體膜上，其發(fā)揮作用時依賴于腺苷甲硫氨酸（ Ado-Met） ，屬于S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶大家族[2-3]。擬南芥At4g25080是編碼該甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，在煙草[4]、水稻[5]、豌豆[6]、衣藻[7]中均發(fā)現(xiàn)ChlM 序列同源物。本研究從‘宋梅’組培苗葉片中克隆了春蘭ClChlM1基因，構(gòu)建pART-ClChlM1植物表達載體，進而在煙草中瞬時表達鑒定了該基因的葉綠素生物合成功能，旨在為春蘭葉綠素合成途徑的揭示及春蘭葉色變異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為春蘭‘宋梅’組培苗，保存在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所組培室（見圖1）。

圖1 春蘭‘宋梅’組培苗Fig.1 Tissue culture seedling of Cymbidium goeringii. ‘Songmei’

1.2 方法

根據(jù)天根生化科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒說明書，從葉片樣品中提取總RNA，利用Nanodrop2000（Thermo Scientific，美國）對RNA的濃度和純度進行檢測，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。

使用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）進行cDNA的合成，反應(yīng)體系為40 μL：500 ng總RNA，8 μL 5×RT Reaction Mix，2 μL Oligo（dT）引物，2 μL TUREscript HRTase/RI Mix，采用RNase Free dH2O補足至40 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序條件為：42 ℃ 60 min，65 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的cDNA放置-20℃保存，用前稀釋10倍使用。

1.2.2 ‘宋梅’ClChlM1基因克隆

根據(jù)表1的引物，從‘宋梅’cDNA中克隆了ClChlM1基因。PCR擴增程序：96 ℃ 10 min；96℃30 s；60 ℃ 30 secs，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃10 min。將擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠分離后對目的片段進行切膠回收，連入pMT18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B過夜培養(yǎng)。次日挑選克隆經(jīng)菌落PCR驗證后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.3 ‘宋梅’ClChlM1進化樹分析

選取鐵皮石斛的DcChlM1、馬蹄蝴蝶蘭的PeChlM1、油棕的EgChlM1、深圳擬蘭的AsChlM1、風(fēng)鈴木的HiChlM1、香蕉的MaChlM1、玉米的ZmChlM1、柑橘的CsChlM1、黃麻的CoChlM1，以及春蘭的ClChlM1，采用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 ‘宋梅’ClChlM1亞細胞定位

設(shè)計酶切引物對ClChlM1基因進行擴增，將擴增后的片段經(jīng)XhoI和SalI雙酶切后連入pBI121-GFP載體，并對擬南芥原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化。通過熒光顯微鏡（Olympus BX51）觀察融合蛋白的定位。

根據(jù)銀隆相關(guān)人員的描述，魏銀倉在未經(jīng)債權(quán)人華融國際同意的情況下，通過魏旗下另一家公司受讓銀隆對華融國際3.75億元債務(wù)，但并未實際還款，導(dǎo)致銀隆的欠款依然存在。同時，在魏銀倉任董事長期間，他與銀隆簽訂《債權(quán)債務(wù)抵銷協(xié)議》，導(dǎo)致其原本欠銀隆的3.75億元債務(wù)滅失。在這起事件中，其他股東并不知曉魏銀倉所為。盧春泉坦承：“華融國際已申請對銀隆的部分資金進行凍結(jié)。”

表1 引物序列Tab.1 Primers used in the present study

1.2.5 煙草轉(zhuǎn)化

為了獲得ClChlM1過量表達載體，將ClChlM1編碼區(qū)序列插入pART-CAM，獲得pART-ClChlM1載體[8]。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將載體導(dǎo)入到本氏煙草中[9]。表1引物檢測煙草的陽性轉(zhuǎn)化率。

1.2.6 ALA和葉綠素的檢測

按照Alawady and Grimm的方法檢測ALA[4]。取煙草葉片，在含有40 mM乙酰丙酸（pH 6.9）的20 mM磷酸鹽緩沖液（pH值7.5）中，置于光下培養(yǎng)4小時。取上清液，加入乙酰乙酸煮沸10分鐘。加入等量的Ehrlich’s試劑，在553 nm下檢測ALA。

檢測煙草的葉綠素含量，用95%的乙醇和稀釋的丙酮碾磨葉片。用紫外分光光度計檢測665 nm,649 nm 和 470 nm波長[10]。

1.2.7 實時定量熒光PCR

引物序列詳見表1。ACTIN基因作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法對目的基因表達量進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClChlM基因克隆

通過RT-PCR獲得了ClChlM1的開放閱讀框（ORF）。DNA測序結(jié)果顯示，ClChlM1的ORF長度為945 bp，編碼314個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)（見圖2）。將ClChlM1序列提交至NCBI，序列號為MG574594。

2.2 ClChlM蛋白結(jié)構(gòu)及進化樹分析

選取春蘭的ClChlM1、鐵皮石斛的DcChlM1、深圳擬蘭的AsChlM1、油棕的EgChlM1進行氨基酸序列比對，結(jié)果表明春蘭的ClChlM與其余四種有較高的同源性，且都含有守的Mg-por_mtran_C區(qū)域（見圖3 A）。

為進一步分析ClChlM進化關(guān)系，選取鐵皮石斛的DcChlM1、馬蹄蝴蝶蘭的PeChlM1、油棕的EgChlM1、深圳擬蘭的AsChlM1、風(fēng)鈴木的HiChlM1、香 蕉 的MaChlM1、玉 米 的ZmChlM1、柑 橘 的CsChlM1、黃麻的CoChlM1蛋白序列進行進化樹構(gòu)建，結(jié)果顯示植物ChlM蛋白分為三個亞類，其中ClChlM與DcChlM1、PeChlM1、AsChlM1、EgChlM1、MaChlM1屬于第I亞類，且與DcChlM1親緣關(guān)系最近（見圖3 B）。

2.3 ClChlM1亞細胞定位

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示ClChlM1-GFP融合蛋白綠色熒光與葉綠體探針紅色熒光融合為黃色熒光，表明ClChlM1定位于葉綠體（見圖4）。

2.4 ClChlM1基因功能驗證

為進一步驗證ClChlM1基因的功能，采用葉盤法將其轉(zhuǎn)化到煙草中（見圖5）。經(jīng)PCR檢測，獲得三個轉(zhuǎn)基因株系（見圖5E）。

葉綠素是一種含卟啉化合物，ALA是卟啉生物合成過程中的一個重要前體。測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系中ALA合成效率顯著高于對照株系，約為對照株系中的2.28倍（見圖6）。

圖2 ‘宋梅’ClChlM1核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of ClChlM1 from Cymbidium goeringii. ‘Songmei’

葉綠素含量測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量含量遠高于對照株系，分別是對照株系的1.32倍、1.56倍、1.35倍（見圖7）。

圖3 ClChlM1同源性比較及系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic and alignment of ClChlM1 with homologous proteins from other plants

圖4 ClChlM1亞細胞定位。Fig.4 Subcellular location of ClChlM1 in Arabidopsis protoplast

進一步對光合作用相關(guān)成員谷氨酰tRNA還原酶（HemA）, 谷氨酸酯-1-半醛2,1-氨基變位酶 （Gsa）,葉綠素a/b結(jié)合蛋白（LHCB）, 鎂離子螯合酶CHLI和鎂離子螯合酶CHLH在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達模式進行分析，結(jié)果顯示除了ClHemA外，ClGsa、ClLHCB、ClCHLI、ClCHLH在轉(zhuǎn)基因株系中的表達量均顯著高于對照組（見圖8）。

圖5 ClChlM1煙草轉(zhuǎn)基因Fig.5 Tobacco ClChlM1 transgenic

圖6 轉(zhuǎn)基因株系中ALA合成效率Fig.6 Efficiency of ALA Synthesis in Transgenic Strains

3 討論

從春蘭組培苗中克隆的ClChlM1基因ORF長度為945 bp，氨基酸序列分析顯示ClChlM1擁有植物ChlM蛋白高度保守的Mg-por_mtran_C結(jié)構(gòu)域，進化樹分析顯示ClChlM1與同為蘭科植物的鐵皮石斛的DcChlM1親緣關(guān)系最近。

圖7 轉(zhuǎn)基因株系中葉綠素含量Fig.7 Chlorophyll content in transgenic lines

高等植物葉綠素生物合成屬于典型的卟啉代謝途徑，由谷氨肽-tRNA到葉綠素a和葉綠素b的形成共需經(jīng)歷十余步酶促反應(yīng)，其中催化鎂原卟啉Ⅸ（MgP）形成鎂原卟啉Ⅸ單甲醚（MgPME）的ChlM是該過程關(guān)鍵酶之一[12]。最近還有研究表明ChlM可以在轉(zhuǎn)錄后水平對光合作用編碼蛋白進行調(diào)控。LHCB是捕光天線蛋白，位于葉綠體類囊體膜上，作用是將吸收的光能傳遞到作用中心，啟動光合作用。在大麥中，Gadjieva等發(fā)現(xiàn)ChlM產(chǎn)物MgPME的積累會促進LHCB基因的表達[13-14]。在本研究中，除了ClLHCB外，還發(fā)現(xiàn)ClGsa, ClCHLI和ClCHLH在ClChlM1過表達植株中顯著上調(diào)，而ClHemA基因的表達量則無變化。HemA編碼谷氨肽-tRNA還原酶，是葉綠素生物合成途徑第一個酶；Gsa編碼的谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶是葉綠素生物合成途徑第二個酶，主要負責(zé)ALA的合成；CHLI和CHLH編碼的蛋白是鎂螯合酶的不同亞基，主要負責(zé)鎂原卟啉IX的合成。因此，推測ClChlM1可反饋調(diào)節(jié)葉綠素的生物合成，具體的調(diào)控機制將是下一步研究重點。

圖8 相關(guān)基因RT-PCR分析Fig.8 RT-PCR analysis of related genes