張亞楠，王 婷，歐斯艷，李方劍，黃麗雅，麥翠珊，王金祥*

（1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)中心，廣東廣州 510642；2 廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村污染治理與環(huán)境安全重點實驗室，廣東廣州 510642）

細胞壁修飾酶在調(diào)節(jié)細胞壁的可塑性方面發(fā)揮重要作用。木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶 (xyloglucan endotransglycosylases/hydrolases, XTHs)是一類參與纖維素/木葡聚糖交聯(lián)和重塑的酶，XTH在細胞伸長過程中作用于微絲-基質(zhì)界面[1–2]，保持細胞壁的厚度、完整性和強度[3–5]。擬南芥 (Arabidopsisthaliana)和水稻 (Oryzasativa) 基因組分別有33和29個XTH基因[6]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超表達AtXTH19和AtXTH2促進側(cè)根的發(fā)育，提高植物的耐鹽性[7]，超表達AtXTH30增強對鹽脅迫的敏感性[8]，超表達辣椒 (C.annuumcv.Pukang)CaXTH3提高擬南芥的耐旱性和耐鹽性[9]。AtXTH21功能喪失限制主根的生長，其通過改變木聚糖的質(zhì)量和纖維素的沉積調(diào)節(jié)根的生長[10]。超表達胡楊 (Populuseuphratica)PeXTH的煙草更耐鹽[11]。這些研究說明，XTH基因在植物生長發(fā)育和響應(yīng)非生物逆境方面起重要作用，但對于大豆XTH在生長發(fā)育和耐受逆境方面的功能還不清楚。

本研究通過生物信息學(xué)分析，明確大豆 (Glycine max) 基因組含有61個XTH基因家族成員；根據(jù)氨基酸序列進行進化分析，將大豆XTH家族分為3個亞組；通過定量PCR鑒定出受低磷(LP)誘導(dǎo)的XTH基因，尤其是GmXTH38在根葉均受LP誘導(dǎo)。在正常養(yǎng)分條件下，超表達GmXTH38導(dǎo)致擬南芥主根變短、側(cè)根數(shù)增多和側(cè)根密度增加。與Col-0相比，在LP、低鐵(LFe)和高鐵(HFe，鐵毒) 脅迫條件下，超表達GmXTH38的擬南芥主根變短、側(cè)根數(shù)減少、側(cè)根密度減少。與Col-0相比，超表達GmXTH38導(dǎo)致擬南芥?zhèn)雀纬蓪P的敏感性增加；超表達GmXTH38導(dǎo)致擬南芥?zhèn)雀芏仍诘丸F或高鐵條件下下降程度更多，增加擬南芥主根生長對低鐵或高鐵的敏感性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆品種為粵春03-3 (YC03-3)，擬南芥野生型為哥倫比亞 (Columbia-0，Col-0) 生態(tài)型。

1.2 大豆GmXTH的生物信息學(xué)分析

以擬南芥XTH氨基酸序列為參考，通過BLASTP比對，在植物基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome (http://www.phytozome.org/index.php) 中獲得大豆XTH基因編碼的氨基酸序列；基于大豆基因組序列，確定GmXTH基因的全長序列，外顯子和內(nèi)含子數(shù)目，GmXTH基因上游2000 bp的核苷酸編碼序列，以及大豆、擬南芥和水稻等XTH的氨基酸序列。

在 ExPaSy (https://wed.expasy.org/protparam) 網(wǎng)站獲得GmXTHs的等電點、分子量；使用MEGA7.0.26(http://http//www.megasoftware.net) 構(gòu)建 GmXTHs進化樹；通過MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)分析GmXTH蛋白和啟動子的基序信息，利用TBtools軟件繪圖。利用大豆基因組數(shù)據(jù)庫SoyBase (https://www.soybase.org) 分析大豆GmXTH家族基因在大豆不同組織和不同發(fā)育時期的表達模式，繪制熱圖。

1.3 大豆的低磷脅迫處理

參考文獻方法[12]，進行大豆水培和養(yǎng)分脅迫處理。YC03-3的種子用10% NaClO滅菌，在沙子中萌發(fā)。為了探索GmXTH38對磷鐵養(yǎng)分脅迫的響應(yīng)，首先將大豆幼苗在完全的 Hoagland 溶液 (pH 5.9) 中培養(yǎng)14天。然后將具有第一片三出復(fù)葉的大豆幼苗分別轉(zhuǎn)入高磷 (HP，500 μmol/L KH2PO4)、低磷 (LP，25 μmol/L KH2PO4) 營養(yǎng)液中培養(yǎng) 14 天。大豆在遮陰網(wǎng)室進行培養(yǎng)，營養(yǎng)液每3 h通氣15 min，每2天更換一次營養(yǎng)液[12]。

1.4 實時熒光定量PCR

用perlprimer設(shè)計實時熒光定量PCR特異引物(附表1)。反應(yīng)在定量 PCR 儀 (Applied Biosystems 7500，F(xiàn)oster City，USA) 進行，用 SYBR Green I dye(Takara Bio Inc.，Otsu，Japan) 進行分析。反應(yīng)條件為：初始變性 95℃，5 min，40 個循環(huán) (95℃ 10 s、60℃20 s、72℃ 20 s)。以看家基因GmEF1α(Glyma.17G 186600) 或AtEF1α(At1G07940) 作為內(nèi)參。

附表1 載體構(gòu)建及定量PCR相關(guān)引物列表Supplyment table 1 Vector construction and quantitative PCR related primers list

續(xù)附表1 Supplyment table 1 continued

1.5 GmXTH38超表達基因株系的獲得及檢測

基于重組克隆方法[13]，通過PCR將GmXTH38的開放閱讀框 (ORF) 進行擴增，將克隆片段轉(zhuǎn)入雙元載體pMDC32，然后用農(nóng)桿菌GV3101對擬南芥進行花序浸泡法轉(zhuǎn)化，通過潮霉素篩選獲得單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因材料。通過PCR進一步確定超表達GmXTH38的轉(zhuǎn)基因擬南芥。

1.6 GmXTH38啟動子活性分析

首先通過TSSP程序 (http://www.softberry.com)預(yù)測GmXTH38啟動子，然后通過PCR擴增啟動子片段 (長度為 2000 bp)?；谥亟M克隆方法[13]，將GmXTH38啟動子克隆轉(zhuǎn)入GUS報告基因載體pMDC162，轉(zhuǎn)化擬南芥[14]，通過潮霉素篩選獲得單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因材料。純化的T3代植株進行GUS染色，在體視顯微鏡下觀察拍照，分析啟動子活性。

1.7 低磷、低鐵和高鐵脅迫條件下GmXTH38超表達株系根系生長分析

將酒精消毒的超表達GmXTH38株系 (#1和#2)和Col-0種子播種于1/2 MS培養(yǎng)基，置于4°C處理2天。然后于人工氣候培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，光溫周期分別為 16 h/8 h (光照/黑暗)和 22℃/20℃ (白天/黑夜)，光照強度為 100 μmol/(m2·s)，相對濕度為 70%。2天后挑選長勢一致的幼苗分別移入高磷 (HP：1.25 mmol/L KH2PO4)、低磷 (LP：0 mmol/L KH2PO4)、高鐵 (HFe: Fe-EDTA 500 μmol/L)、中鐵 (MFe: Fe-EDTA 50 μmol/L)、低鐵 (LFe: Fe-EDTA 0 μmol/L)固體培養(yǎng)基上，7天后測定相關(guān)指標，每個處理4個重復(fù)，HP和MFe培養(yǎng)基的P和Fe含量是植物正常生長需求量。根據(jù)參考文獻，本研究中擬南芥HFe培養(yǎng)條件視為鐵毒 (鐵過量) 處理。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用SPSS20.0進行數(shù)據(jù)分析，計算平均值和標準誤，用Student’st-test進行差異顯著性分析；用OriginPro8繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmXTHs家族成員理化性質(zhì)分析

相對于擬南芥基因組，大豆基因組更大更復(fù)雜。為全面分析大豆XTH基因家族，我們結(jié)合兩個方法鑒定大豆XTH基因家族。方法一是通過關(guān)鍵詞PF06955 在 Phytozome 網(wǎng)站 (www.phytozome.org) 進行檢索，發(fā)現(xiàn)大豆基因組 (GlycinemaxWm82.a2.v1版本) 共有61個基因編碼XTH；方法二是以33個擬南芥XTH的氨基酸序列為種子序列，通過BLASTP程序?qū)Υ蠖沟鞍踪|(zhì)組進行迭代比對。基于兩種方法分析的結(jié)果，確定大豆基因組有61個XTH基因。大豆GmXTH家族成員分布在1～5號、7～20號染色體上，其中定位13號和17號染色體上的GmXTH基因數(shù)目最多，分別為9和7個。根據(jù)GmXTH在染色體上的位置，命名為GmXTH1至GmXTH61(附表2)。

通過ExPaSy網(wǎng)站對GmXTH蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)GmXTH分子量范圍為13.0～40.5 KDa，氨基酸數(shù)目在115～347 (附表2)；22個GmXTH的等電點小于7，其他39個XTH蛋白的等電點均大于7 (附表2)。

附表2 GmXTH家族成員基因的基本信息Supplyment table 2 Basic information of GmXTHs

續(xù)附表2 Supplyment table 2 continued

2.2 XTHs的系統(tǒng)進化分析

根據(jù)文獻和比對分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥和水稻XTH基因家族分別有33和29個成員(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。我們利用MEAG7.0.26重建大豆、水稻和擬南芥的XTHs系統(tǒng)進化樹。如圖1所示，大豆、擬南芥、水稻的XTH家族可分為3個亞組；其中GmXTH38與擬南芥XTH9、XTH23位于同一亞組，GmXTH38與后兩者的氨基酸同源性分別為83.1%和63.4%。

圖1 GmXTH系統(tǒng)進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of GmXTH

2.3 大豆GmXTH保守基序、啟動子和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

通過對GmXTH進行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)除GmXTH33外，其他GmXTH均含有3個基序。與GmXTH38的基序排列極為相似的有GmXTH2、12～19、30～31、36、46～48，表明這些蛋白可能具有相似的功能(圖2)。如圖2B所示，基序1～3中分別包含XTH蛋白特有的保守序列。

圖2 GmXTH蛋白基序 (A) 和保守結(jié)構(gòu)域分析 (B)Fig.2 Analysis of motif (A) and conserved domain of GmXTH protein (B)

為進一步了解GmXTH的啟動子順式調(diào)控元件，我們利用MEME程序?qū)mXTH啟動子序列進行了保守核苷酸基序 (motif) 的分析。GmXTH的啟動子包含的基序類型相似，有3種基序類型 (Motif 1～3)，其中GmXTH9、GmXTH12、GmXTH14、GmXTH26、GmXTH29、GmXTH52均含有3種類型的基序，其余GmXTH啟動子中僅包含其中1～2種基序 (圖3)。與GmXTH38的基序排列極為相似的有GmXTH18、GmXTH34、GmXTH51，且它們僅含有1個基序。這表明可能有共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在這些XTH啟動子元件上調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。

圖3 GmXTH啟動子基序 (A) 和保守結(jié)構(gòu)域分析 (B)Fig.3 Analysis of motif (A) and conserved domain of GmXTH promoter (B)

2.4 GmXTHs家族成員在大豆不同器官的表達水平

為了確定GmXTH基因的表達模式，我們使用公開的大豆全基因組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(www.soybase.org) 進行分析。如圖4所示，GmXTH基因在各器官廣泛表達，GmXTHs具有不同的組織特異性表達模式。15 個GmXTHs (XTH2、6、10、13～15、19、22、25、27、32、33、39、45、61)在根表達量較高；6 個GmXTHs (XTH13、29、32～34、55)在根瘤表達量較高。

圖4 GmXTH基因家族在不同器官的表達模式Fig.4 The expression patterns of GmXTH gene family in different organs

2.5 GmXTHs對低磷脅迫的響應(yīng)

為明確GmXTHs對LP脅迫的響應(yīng)，我們前期對大豆LP脅迫14天的葉進行轉(zhuǎn)錄組分析，已上傳相關(guān)數(shù)據(jù)至 NCBI (accession number：PRJNA48973)，發(fā)現(xiàn)GmXTHs家族中有5個基因 (GmXTH24、28、38、41和52) 對LP有較明顯的響應(yīng)。本研究進一步通過定量PCR對這5個GmXTH基因響應(yīng)LP脅迫進行了分析(圖5)。GmXTH24在葉的表達量顯著高于根，但GmXTH24在根葉均不受LP誘導(dǎo)，這與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果不一致；GmXTH28也是在葉的表達量高于根，GmXTH28在根顯著受LP誘導(dǎo)，其表達量是HP(對照) 處理的 9.8倍 (P<0.01)。值得注意的是，GmXTH38在大豆根和葉都明顯受LP誘導(dǎo)，LP在根和葉中的相對表達量分別是HP的15.3和4.4倍；GmXTH41明顯受LP誘導(dǎo)，LP在根和中葉的相對表達量分別是HP的 39.1和 2.5倍 (P<0.05)；而GmXTH52僅在大豆根受LP誘導(dǎo)，與HP相比，LP誘導(dǎo)倍數(shù)高達14.2倍 (P<0.05)。后面的試驗針對GmXTH38開展。

2.6 GmXTH38啟動子活性分析

定量PCR分析已證明GmXTH38在大豆根、葉均受LP誘導(dǎo) (圖5)。我們進一步分析了GmXTH38啟動子活性及其對LP的響應(yīng)。GUS染色結(jié)果顯示(圖6)，HP條件下，整個擬南芥幼苗 (如葉、主根、側(cè)根) 均能觀察到GUS染色；LP條件下，地上部和地下部染色更深，范圍更大，說明GmXTH38啟動子活性受低磷促進。暗示GmXTH38可能在大豆根系響應(yīng)LP脅迫方面起作用。

圖5 GmXTHs對低磷脅迫的響應(yīng)Fig.5 Responses of soybean GmXTHs to low phosphorus stress

圖6 GmXTH38啟動子活性Fig.6 Promoter activity of GmXTH38

2.7 低磷條件下GmXTH38超表達對擬南芥根系生長的影響

為揭示GmXTH38的功能，我們將GmXTH38在擬南芥進行異源表達，通過半定量PCR鑒定到2個純合的超表達GmXTH38株系#1和#2 (附圖1)。因LP誘導(dǎo)GmXTH38在根的表達(圖5)，我們將轉(zhuǎn)基因株系進行LP處理，研究超表達GmXTH38對擬南芥根系生長的影響。

附圖1 GmXTH38過表達株系的鑒定Supplement figure 1 Identification of overexpressing GmXTH38 lines

在HP處理下，與Col-0比，超表達GmXTH38材料#1和#2的主根長分別被抑制了34.22%和37.65%(圖7a、c)；LP處理7天，#1和#2的主根長分別被抑制了30.59%和29.58% (圖7b、c)。與HP處理相比，LP處理的Col-0的主根長被抑制了50.03%，而超表達的2個株系主根長分別被抑制了47.27%和43.56% (圖 7a、b、c)。說明超表達GmXTH38降低主根生長對LP的敏感性。

與Col-0相比，超表達材料#1和#2在HP下生長7天的側(cè)根數(shù) (包括側(cè)根原基) 顯著減少，分別被抑制了69.70%和65.15% (圖7a、d)。LP條件下Col-0、#1和#2的側(cè)根數(shù)明顯比HP條件下的多。在LP條件下，與Col-0相比，#1和#2的側(cè)根數(shù)分別被抑制了46.63%和41.01% (圖7b、d)。與HP相比，LP處理下Col-0的側(cè)根數(shù)增加了1.70倍，而#1和#2株系側(cè)根數(shù)分別增加了3.75和3.57倍 (圖7a、b、d)。

LP處理明顯增加Col-0、#1和#2的側(cè)根密度。與HP比，LP條件下Col-0的側(cè)根密度增加了4.63倍，而#1和#2株系側(cè)根密度分別增加了10.97和8.07倍 (圖7e)。這說明超表達GmXTH38增加側(cè)根形成對LP的敏感性。

圖7 低磷處理對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長的影響Fig.7 Effects of low phosphorus treatment on the growth of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana

2.8 GmXTH38調(diào)節(jié)擬南芥根系在低鐵和高鐵條件下的生長

基于磷營養(yǎng)和鐵營養(yǎng)之間存在密切的關(guān)系，土壤或培養(yǎng)介質(zhì)鐵存在會降低磷的有效性。我們進一步研究了超表達GmXTH38對擬南芥根系在低鐵(LFe) 或高鐵 (HFe，鐵毒) 下生長的影響。與 MF (中鐵，對照)比，HFe條件下Col-0、#1和#2的主根長分別被抑制了31.87%、34.67% 和 42.82% (圖8 a、b、d)，LFe處理下Col-0、#1和#2的主根長分別被抑制了 66.51%、68.33% 和 73.17% (圖8 b、c、d)。這些結(jié)果表明，超量表達GmXTH38增加擬南芥主根生長對LFe或HFe的敏感性。

LFe和HFe脅迫均抑制側(cè)根形成 (圖8)。與MF相比，HFe處理下的Col-0、#1和#2側(cè)根數(shù)分別被抑制了 88.27%、90.48%、69.23% (圖 8a、b、e)，Col-0、#1和#2的側(cè)根數(shù)在LF條件下分別被抑制了74.40%、92.86%、69.23% (圖 8b、c、e)。HFe條件下，與Col-0相比，#1和#2的側(cè)根數(shù)分別被抑制63.64% 和 45.45% (圖 8e)。

與MFe比，LFe條件下Col-0、#1和#2的側(cè)根密度分別下降了62.01%、68.33%和69.58%，HFe條件下Col-0、#1和#2的側(cè)根密度分別下降了22.16%、34.67%和42.82% (圖8f)。這表明GmXTH38超量表達導(dǎo)致擬南芥?zhèn)雀纬蓪Fe或HFe更敏感。

3 討論

XTH是一類參與纖維素/木葡聚糖交聯(lián)的構(gòu)建和重塑的酶，在調(diào)節(jié)細胞壁的伸長方面起重要作用。然而，人們對大豆中的這類酶知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆基因組含有61個XTH基因，進化分析表明GmXTH可分為3個亞組 (圖1)。大豆XTH基因數(shù)目遠高于水稻和擬南芥XTH基因數(shù)目，這可能與大豆基因組在進化過程中出現(xiàn)兩次基因組復(fù)制有關(guān)，也暗示大豆XTH家族的功能更復(fù)雜。

通過啟動子元件分析，發(fā)現(xiàn)GmXTH24、28、38、41和52都含有 G-box 元件 (CACGTG) (附表3)。G-box元件與基因轉(zhuǎn)錄響應(yīng)光、激素和環(huán)境因子有關(guān)[15–16]。受低磷誘導(dǎo)的OsPTF1和GmPTF1的啟動子均含有G-box元件[17]，兩者都屬于bHLH型轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)水稻和大豆磷營養(yǎng)。此外，GmXTH38、41和52都含有W-box元件(附表3)。W-box元件是WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[18]。WRKY6通過結(jié)合PHO1啟動子內(nèi)的兩個W-box元件負調(diào)控PHO1的表達，在低磷條件下，WRKY6抑制PHO1的轉(zhuǎn)錄[18–20]；WRKY42也可以直接結(jié)合PHO1啟動子的W-box，WRKY42與WRKY6相互作用抑制PHO1的表達[20–21]；WRKY45與PHT1(PHOSPHATETRANSPORTER1)啟動子的兩個W-box元件結(jié)合，直接上調(diào)PHT1轉(zhuǎn)錄[22]。擬南芥和水稻部分低磷響應(yīng)基因啟動子中存在P1BS元件，而MYB類轉(zhuǎn)錄因子PHR1通過結(jié)合P1BS (PHR1 binding sequence)元件調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[23]。我們發(fā)現(xiàn)GmXTH28和GmXTH38的啟動子含有P1BS元件。這些結(jié)果暗示，大豆bHLH、WRKY以及PHR1類轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)節(jié)GmXTHs的轉(zhuǎn)錄。此外，GUS分析均證實GmXTH38啟動子活性受LP誘導(dǎo) (圖6)，與定量PCR結(jié)果一致 (圖5)。

附表3 五個受低磷調(diào)控基因中磷相關(guān)的啟動子元件Supplyment table 3 Five phosphorus-related promoter elements in low phosphorus-regulated genes

對GmXTH38進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，它與AtXTH9相似度為83.1%，與AtXTH23相似度為63.4%。已有研究表明，XTH9超表達增加側(cè)根長度，并增加對低硝酸鹽脅迫的耐受性[24]；AtXTH19和AtXTH23的超表達促進側(cè)根的發(fā)育并增強鹽脅迫耐受性，而AtXTH23單突變和AtXTH19/AtXTH23雙突變對鹽脅迫敏感，側(cè)根較少[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，超表達GmXTH38在植物正常生長養(yǎng)分條件下抑制主根生長和側(cè)根形成(圖7)。GmXTH38在大豆根、葉均受LP誘導(dǎo)(圖5)，而磷與鐵養(yǎng)分存在密切關(guān)系。在HP條件下，超表達GmXTH38抑制主根的生長、側(cè)根的數(shù)目和側(cè)根密度 (圖7)。但是否是抑制主根分生區(qū)活性；影響側(cè)根的起始或突破表皮等需進一步研究。另一方面，超表達GmXTH38改變擬南芥對磷缺乏的敏感性，表現(xiàn)為主根生長對LP的敏感性降低，而側(cè)根形成對LP的敏感性增加，側(cè)根密度增加更多 (圖7)。文獻報道，低磷抑制野生型擬南芥Col-0主根生長，增加側(cè)根密度，且依賴于生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[25]，我們結(jié)果與此文獻一致。這是否與生長素信號途徑耦聯(lián)值得進一步研究。

值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)超表達GmXTH38導(dǎo)致擬南芥對鐵饑餓 (LFe)和鐵毒 (HFe)更敏感，表現(xiàn)為主根長和側(cè)根密度都會受到強烈的抑制(圖8)。這暗示，超表達GmXTH38會強化鐵缺乏或過量對根系生長發(fā)育的調(diào)控?；诒狙芯拷Y(jié)果，推測GmXTH38在調(diào)節(jié)磷鐵養(yǎng)分互作方面起作用。

圖8 不同鐵濃度處理對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長的影響Fig.8 Effects of different iron concentrations on the growth of wild and transgenic Arabidopsis thaliana

4 結(jié)論

GmXTH38可能在根系響應(yīng)低磷和鐵脅迫方面起重要作用，調(diào)節(jié)主根的生長和側(cè)根形成。超表達GmXTH38改變了擬南芥主根和側(cè)根對磷、鐵等養(yǎng)分脅迫的敏感性。本研究為今后揭示GmXTH調(diào)節(jié)磷、鐵養(yǎng)分脅迫的分子機制打下了基礎(chǔ)，今后需要創(chuàng)制大豆GmXTH相關(guān)的基因編輯材料，以便對其調(diào)節(jié)根系應(yīng)答磷鐵養(yǎng)分脅迫的機制進行深入研究。