張江超，劉 強，黃家興，高 飛，陳 敏，馬衛(wèi)華，姜玉鎖*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030801；2.延安市橋北國有林管理局，陜西延安 716000；3.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部傳粉昆蟲生物學重點實驗室，北京 100093；4.山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，太原 030031)

蜜蜂是廣泛高效的傳粉者。研究表明蜜蜂授粉可提高番茄Lycopersiconesculentum的坐果率，降低畸形果率(尤春等,2020)；可顯著提高子蓮NelumbonuciferaGaertn.的產(chǎn)量和品質(zhì)(趙東緒等,2018)；可極顯著提高藍莓Vacciniumspp.坐果率，提升果實的風味品質(zhì)(趙東緒等,2019)；在對蜜蜂為梨樹授粉效果的研究時也發(fā)現(xiàn)蜜蜂可以提高產(chǎn)量(吳美根等,1984)。

當傳粉昆蟲訪花時，出現(xiàn)連續(xù)采集某一種特定類型的花朵的反應，昆蟲對此類型的花朵的選擇行為，稱為“訪花偏愛性”(Gegearetal.,2004)。研究表明，傳粉昆蟲對花朵的偏愛性與花朵特征：大小、顏色、形態(tài)、氣味，花粉、花蜜質(zhì)量及環(huán)境等因素有關(官昭瑛等,2005;施海燕等,2008;羅文華等,2015;羅文華等,2019)。蜜蜂喜歡采集飼料報酬更高的花，獲得營養(yǎng)物質(zhì)(Anna-Karin,1990)。影響訪花偏愛性的因素可以作為花朵飼料報酬高低的信號影響蜜蜂的拜訪(龍登隆,2019)。

梨樹是異花蟲媒植物，配子體型自交不親和。

自花授粉時，不能結實，且存在異花授粉不親和現(xiàn)象(Hiratsukaetal.,2002)。到現(xiàn)在為止，梨產(chǎn)區(qū)仍主要依靠人工授粉、噴霧器噴花等方式(武文卿等,2017;曹慧蓮等,2020)。這種方式雖然授粉效果較好，但耗時耗力，浪費人力，并且可能會錯過最佳授粉時間。新疆出現(xiàn)無人機霧化噴灑的授粉方式，適用于大面積的果園(倪菁菁等,2020)。

蜜蜂對梨花Pyrusspp.訪花偏愛性較差，這可能與梨花花朵的顏色、大小、氣味以及梨花花粉粒的重量、濕度、粘性和花蜜的營養(yǎng)價值、質(zhì)量有關(Abroletal.,1988;Orosz-Kovacsetal.,2003;武文卿等,2011)。除此之外，當梨樹周圍有同花期植物如油菜時，蜜蜂的訪花積極性也會下降(付寶春等,2018)。

本研究通過開展蜜蜂訪花偏愛性試驗,對同花期植物花朵特征：花蜜的糖含量、花粉中18種氨基酸含量以及揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測和分析，探討蜜蜂不偏愛采集梨花的原因，為下一步誘導蜜蜂為梨樹授粉提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：試驗在運城鹽湖區(qū)生態(tài)梨園進行。試驗用花蜜和花粉分別采自碭山酥梨PyrusbretshneideriDangshan、巴梨PyruscommunisBartlett、黃梨PyrusbretschneideriHuang和油菜BrassicacampestrisL.。

供試蜂群：意大利蜜蜂Apismelliferaligustica。

1.2 試驗方法

1.2.1訪花偏愛性試驗

以訪花蜜蜂數(shù)量和蜜蜂訪花頻率作為研究蜜蜂訪花偏愛性的指標。選取長勢相當?shù)拇X山酥梨、巴梨、黃梨梨樹各1棵，并在油菜田中隨機選取一塊1 m×1 m的試驗區(qū)域進行標記；盛花期分別在選定的梨樹和油菜試驗區(qū)域各選取 40個梨花花序、30個油菜花花序作為樣方(樣方內(nèi)折合花朵數(shù)均約200朵)(何承剛等,2005;邵長凱等,2015)。

1.2.1.1 訪花蜜蜂數(shù)量

訪花蜜蜂數(shù)量是指在單位時間內(nèi)探訪樣方內(nèi)花朵的蜜蜂總數(shù)(馬衛(wèi)華,2014)。試驗采用直接計數(shù)法，記錄1 h內(nèi)探訪樣方內(nèi)花朵的蜜蜂數(shù)量。

1.2.1.2 訪花頻率

訪花頻率是指每分鐘蜜蜂訪問的花朵數(shù)。訪花頻率的觀測于盛花期(花蕾完全開放、花藥已散粉)進行。采用樣方法和追蹤法，從7 ∶00-17 ∶00，記錄每小時前5 min蜜蜂在樣方內(nèi)的訪花狀況。以一頭采集蜂為一個樣本，用計時器記下其訪花過程所用時間。樣本量至少60頭。以計數(shù)器記下訪花數(shù)量(龔燕兵等,2007)。

訪花頻率=訪花數(shù)量/訪花時間

1.2.2花蜜糖含量的測定

毛細管法采集花蜜(Corbet,2003;李左棟等,2006)，液相色譜示差折光檢測法檢測花蜜中的葡萄糖、麥芽糖、果糖和蔗糖含量(張書芬等,2008)。

1.2.3花粉氨基酸含量的測定

采集氣球期的花朵，待陰干散粉，收集花粉(何子順,2006)；參照國家標準GB/T5009.124-2003檢測花粉中18種氨基酸含量(中國國家標準化管理委員會,2003;張金振等,2014;牛德芳等,2019)。

1.2.4花朵揮發(fā)性物質(zhì)的測定

按照馬衛(wèi)華等進行揮發(fā)性物質(zhì)檢測(馬衛(wèi)華等,2018)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過SPSS(Statistical Product and Service Solutions)軟件中的Duncan氏多重比較進行方差分析，結果以平均值±標準差表示，采用GraphPad Prism 5、Microsoft Excel 2019進行圖形分析；通過氣相色譜-質(zhì)譜-計算機聯(lián)用儀、NIST標準譜圖庫，定性分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)(張輝秀等,2013)；采用峰面積歸一化法，求得各成分相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 訪花偏愛性

2.1.1訪花蜜蜂數(shù)量

碭山酥梨、黃梨、巴梨和同花期競爭植物油菜的訪花蜜蜂數(shù)量如圖1。7 ∶00-8 ∶00時間段內(nèi)，碭山酥梨的蜜蜂訪問數(shù)量多于油菜；9 ∶00-17 ∶00，油菜的蜜蜂訪問數(shù)量多于碭山酥梨；7 ∶00-17 ∶00，巴梨的訪花蜜蜂數(shù)量多于黃梨和碭山酥梨。

圖1 梨樹和油菜的訪花蜜蜂數(shù)量Fig.1 Number of flower-visiting honeybees in pears and rape

2.1.2訪花頻率

油菜的訪花頻率為(28.35 朵/min)顯著高于碭山酥梨(11.72 朵/min)(P<0.05)；不同種梨花中，訪花頻率由高到低依次為：巴梨(19.91 朵/min)、黃梨(18.02 朵/min)、碭山酥梨(11.72 朵/min)，巴梨、黃梨顯著高于碭山酥梨(P<0.05)(圖2)。

圖2 梨樹和油菜的蜜蜂訪花頻率Fig.2 Flower-visiting frequency of honeybees in pears and rape注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different letters indicated significant differences (P<0.05).

2.2 花蜜糖含量

毛細管法采集花蜜，液相色譜示差折光檢測法檢測花蜜中的葡萄糖、麥芽糖、果糖和蔗糖含量，結果可知：梨花花蜜中3種糖含量為：葡萄糖含量均為最高，其次是果糖、蔗糖，麥芽糖未被檢測到；不同梨花花蜜中的3種糖含量及總糖含量由高到低依次為：碭山酥梨、黃梨、巴梨。其中巴梨的蔗糖含量最少，僅為0.001 mg/mL，顯著低于碭山酥梨(0.194 mg/mL)和黃梨(0.1115 mg/mL)(P<0.05)(表1)。

表1 3種梨花花蜜糖含量Table 1 Sugar composition and content of three kinds pear flower nectar

續(xù)表1 Continued table 1

2.3 花粉氨基酸含量及組分

碭山酥梨、黃梨、巴梨和油菜花粉總氨基酸含量、氨基酸各組分所占的比例分別見表2、圖3。

圖3 梨樹和油菜花粉中氨基酸各組分所占的比例Fig.3 Percentage of amino acids in pollens of pears and rape

表2 梨樹和油菜花粉中總氨基酸含量Table 2 Total amino acid content in pollens of pears and rape

碭山酥梨花粉中的總氨基酸含量最高(33.420 g/100g)，其次為黃梨(32.640 g/100g)，巴梨最少(8.550 g/100g)；油菜花粉總氨基酸含量為26.820 g/100g。3種梨花花粉的各氨基酸比例基本相同，巴梨Cys和Lys高于其他花粉的組分含量；碭山酥梨的Arg含量高于油菜。

2.4 花朵揮發(fā)性物質(zhì)

固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術對黃梨、碭山酥梨、巴梨和油菜花朵中揮發(fā)性物質(zhì)分析，采用峰面積歸一化法對各組分進行定性和半定量分析，結果見表3；揮發(fā)性物質(zhì)及占比分析見圖4、圖5。

2.4.1黃梨花朵揮發(fā)性物質(zhì)

黃梨花朵共檢測出7類21種揮發(fā)性物質(zhì)：3種萜烯類化合物(14.76%)、2種芳香類化合物(2.67%)、5種酯類化合物(9.49%)、7種烷烴類化合物(17.88%)、2種腈類化合物(25.99%)、1種酮類化合物(20.84%)、1種醇類化合物(14.76%)。其中，腈類化合物總相對含量最多為25.99%。黃梨花朵中揮發(fā)性物質(zhì)的主體成分有6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(28.36%)、4,8,12-三甲基-3-十三碳烯腈(20.24%)、3,7,11,15-四甲基-1,6,10,14-十六碳四烯-3-醇(8.37%)、二十一烷(8.27%)、羅勒烯(6.57%)、5-十八烯(5.77%)等；次要成分有D-檸檬烯(2.42%)、萘(2.03%)等；修飾成分有2-甲基-3-羥基-2.4.4-三甲基丙酸甲酯(0.72%)等(表3、圖4)。

2.4.2碭山酥梨花朵揮發(fā)性物質(zhì)

碭山酥梨花朵共檢測出7類21種揮發(fā)性物質(zhì)：3種萜烯類化合物(19.02%)、2種芳香類化合物(6.19%)、5種酯類化合物(8.93%)、7種烷烴類化合物(34.45%)、2種腈類化合物(16.90%)、1種酮類化合物(6.40%)、1種醇類化合物(8.11%)。其中，烷烴化合物總相對含量最多為34.45%。碭山酥梨花朵中揮發(fā)性物質(zhì)的主體成分有二十一烷(19.30%)，其次為5-十八烯(12.14%)、4,8,12-3甲基-3-十三碳烯腈(8.76%)、3,7,11,15-四甲基-1,6,10,14-十六碳四烯-3-醇(8.11%)等；次要成分有十五烷(2.96%)、羅勒烯(2.28%)等；修飾成分有2-甲基萘(0.97%)、4-羥基丁基丙烯酸酯(0.57%)等(表3、圖4)。

2.4.3巴梨花朵揮發(fā)性物質(zhì)

巴梨花朵共檢測出9類28種揮發(fā)性物質(zhì)：2種萜烯類化合物(40.86%)、2種醚類化合物(2.74%)、4種酯類化合物(9.02%)、1種酮類化合物(0.66%)、15種醇類化合物(40.04%)、1種酸類化合物(0.49%)、1種酰胺類化合物(0.71%)和其他類(5.48%)。其中，萜烯類化合物總相對含量最多為40.86%。巴梨花朵中揮發(fā)性物質(zhì)的主體成分有(E,E,E)-3,7,11,15-四甲基己二酸-1,3,6,10,14-五烯(34.35%)、2-丁基辛醇(13.71%)、羅勒烯(6.51%)、3 -甲基-1-丁醇(6.22%)等；次要成分有苯乙醇(2.98%)、2-羥基戊酸甲酯(2.96%)等；修飾成分有2-乙基-1-己醇(0.94%)、二乙二醇乙醚(0.90%)等(表3、圖4)。

2.4.4油菜花朵揮發(fā)性物質(zhì)

油菜花朵共檢測出6類22種揮發(fā)性物質(zhì)：8種萜烯類化合物(40.23%)、2種芳香類化合物(5.54%)、4種酯類化合物(15.98%)、6種烷烴類化合物(30.10%)、1種腈類化合物(7.41%)、1種酮類化合物(0.74%)。其中，萜烯類化合物總相對含量最多為40.23%。油菜花朵中揮發(fā)性物質(zhì)的主體成分有8氫化-4-甲基-1H-環(huán)丙烯(16.08%)、石竹烯(8.67%)、十四烷(7.49%)等；次要成分有三十一碳烷(2.59%)、α-法尼烯(2.42%)等；修飾成分有5,9,13-三甲基-肉豆蔻酸甲酯(0.92%)、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(0.74%)等(表3、圖4)。

2.4.5不同植物花朵揮發(fā)性物質(zhì)比較

揮發(fā)性物質(zhì)檢測結果顯示，4種植物花朵中揮發(fā)性物質(zhì)的種類、含量存在相似性和差異性。

黃梨和碭山酥梨花朵所含的揮發(fā)性物質(zhì)種類完全相同(21種)，但含量不同，如6,10,14-三甲基-2-十五烷酮，在黃梨中相對含量為20.84%，在碭山酥梨中為6.4%(表3、圖4、圖5)。

黃梨、碭山酥梨、巴梨和油菜花朵中均被檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)有一種：2-羥基-戊酸甲酯(0.61%、1.89%、2.96%、6.03%)。除2-羥基-戊酸甲酯外，黃梨、碭山酥梨和巴梨花朵共有的揮發(fā)性物質(zhì)有2種：羅勒烯(6.57%、2.28%、6.51%)、4-羥基丁基丙烯酸酯(1.31%、0.57%、1.71%)；黃梨、碭山酥梨和油菜花朵共有的揮發(fā)性物質(zhì)有13種：D-檸檬烯酸、萘、2-甲基萘、2,4-二異氰酸基-1-甲基苯、2-甲基-3-羥基-2,4,4-三甲基丙酸甲酯、十四烷、2,6,10,14-四甲基-十六烷、十五烷、十六烷、三十一碳烷、2,6,10,14-四甲基-十五烷、6,10,1-三甲基-2-十五烷酮、5,9,13-三甲基-肉豆蔻酸甲酯；油菜和巴梨花朵的揮發(fā)性物質(zhì)檢測中未發(fā)現(xiàn)相同成分(表3、圖4、圖5)。

圖4 梨樹和油菜花朵揮發(fā)性物質(zhì)占比分析Fig.4 Proportion analysis of volatile compounds in flowers of pears and rape

圖5 梨樹和油菜花朵的揮發(fā)性物質(zhì)Fig.5 Volatile compounds in flowers of pears and rape

僅在黃梨和碭山酥梨花朵中檢出的揮發(fā)性物質(zhì)為5-十八烯、3,7,11,15-四甲基-1,6,10,14-十六碳四烯-3-醇、二十一烷、5-甲酰-2,4-二甲基-吡咯-3-腈、4,8,12-三甲基-3-十三碳烯腈；僅在油菜花朵中檢出的揮發(fā)性物質(zhì)為8氫化-4甲基-1H-環(huán)丙烯、石竹烯、1-甲基-5-甲酰-8(1-甲基乙基)-1,6-環(huán)丁二烯、α-法尼烯、γ-阿珠莫林、α-阿珠莫林、Δ-杜松烯；僅在巴梨花朵中檢出的揮發(fā)性物質(zhì)有(E,E,E)-3,7,11,15-四甲基己二酸-1,3,6,10,14-五烯(34.35%)、2-丁基辛醇(13.71%)、3 -甲基-1-丁醇(6.22%)等(表3)。

表3 梨樹和油菜花朵揮發(fā)性物質(zhì)及相對含量(%)Table 3 Volatile compounds and relative content in flowers of pears and rape

3 結論與討論

3.1 影響訪花偏愛性的因素

蜜蜂訪花時，出現(xiàn)偏愛某種花朵的現(xiàn)象，稱為“訪花偏愛性”。蜜蜂較偏愛勝利油菜的氣味，花朵氣味可顯著影響蜜蜂訪花行為(官昭瑛等,2005)；施海燕等發(fā)現(xiàn)小蜂熊蜂Bombusspp.偏愛訪問大花瓣的、草莓味的紫色花朵(施海燕等,2008)。

蜜蜂對不同品種的梨樹及同花期植物油菜的訪花偏愛性試驗，結果顯示油菜的訪花蜜蜂數(shù)量和訪花頻率顯著高于碭山酥梨；3種不同的梨花中，巴梨的訪花蜜蜂數(shù)量和訪花頻率高于黃梨和碭山酥梨。這個結果驗證了前人的看法：蜜蜂有訪花偏愛性；當梨樹周圍存在同花期植物如油菜時，蜜蜂對梨花的訪花積極性會下降，更偏愛采集競爭植物油菜(付寶春等,2018)。試驗中，7 ∶00-8 ∶00時間段內(nèi)出現(xiàn)碭山酥梨的蜜蜂探訪數(shù)量多于油菜的現(xiàn)象，導致這一現(xiàn)象的原因可能與蜜蜂喜歡先采集蜂箱周圍植物，后再采集報酬較高的植物(Gegearetal.,2001)，而油菜地距蜂箱較遠。

3.2 花蜜糖含量

花蜜中主要是含葡萄糖、果糖和蔗糖?；厶呛考敖M分是蜜蜂訪花偏愛性的一個影響因素。液相色譜示差折光檢測法檢測花蜜糖含量時，3種梨中，碭山酥梨花蜜的總糖含量及葡萄糖、果糖、蔗糖的含量均為最高，3種糖中，蔗糖含量最少；巴梨花蜜的蔗糖含量最少僅為0.001 g/mL。巴梨花蜜的總糖含量、蔗糖含量顯著少于碭山酥梨，蜜蜂訪花偏愛性試驗中，蜜蜂更偏愛采集巴梨，可能蜜蜂偏愛采集蔗糖含量少的花朵有關。

遲韻陽等(2020)研究表明，油菜花蜜的葡萄糖、果糖、蔗糖含量分別為11.16 g/100 g、11.68 g/100 g、1.20 g/100 g，總糖含量為24.04 g/100 g；而范新濤等(2014)的研究中，油菜花蜜的葡萄糖、果糖、蔗糖含量分別為180.9 mg/mL、160.9 mg/mL、0 mg/mL，總糖含量341.8 mg/mL；韓月鑫等(2019)檢測表明，油菜花蜜的葡萄糖、果糖、蔗糖含量分別為51.2±0.4 mg/mL、61.6±0.4 mg/mL、0.03±0.02 mg/mL，海藻糖含量0.48±0.03mg/mL，總糖含量115.4±0.6 mg/mL。上述研究均表明了油菜總糖含量高于3種梨花的總糖含量(8.274±0.038mg/mL、7.229±0.015 mg/mL、5.344±0.042 mg/mL)。訪花偏愛性試驗中，蜜蜂更喜歡訪問油菜，表明蜜蜂更愛采集花蜜含糖量高的花朵(董霞,2009)。

蜜蜂的訪花偏愛性不僅受到花蜜糖類和濃度影響，還受到花粉花香等其它因素的影響。

3.3 花粉氨基酸組分及含量

3種梨花花粉及油菜花粉的氨基酸組分和含量顯示，巴梨花粉中的Cys高于碭山酥梨和黃梨、Lys低于碭山酥梨和黃梨；碭c山酥梨Arg高于油菜。結合蜜蜂訪花偏愛性試驗，蜜蜂的采集偏愛性可能與花粉中的高含量的Cys和低含量的Lys、Arg有關。

3.4 花朵揮發(fā)性物質(zhì)

植物開花時，花朵的揮發(fā)性物質(zhì)可以對傳粉昆蟲的行為產(chǎn)生影響，可以吸引或者趨避傳粉昆蟲。

萜烯類揮發(fā)性化合物具有很強的香味，是最大的一類天然植物產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)生物間的有益作用和拮抗作用方面具有不同的功能，萜烯類化合物是吸引傳粉者(動物、昆蟲、哺乳動物、鳥類和蝙蝠)的主要因素(龍登隆,2019)。黃梨、碭山酥梨、巴梨和油菜的花朵揮發(fā)物中萜烯類物質(zhì)的含量分別為14.76%、19.02%、40.86%和44.23%；其中油菜花朵的揮發(fā)性物質(zhì)總相對含量、相對含量最多均為萜烯類化合物。這可能是蜜蜂偏愛采集油菜的的原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)蜜蜂對α-法呢烯、檸檬烯等化合物敏感(Granero MAetal.,2005;Theis,2006;Doetterletal.,2010)。4種植物花朵中，只有油菜花朵揮發(fā)物中含有α-法呢烯(2.42%)；同時檸檬烯可在黃梨、酥梨和油菜的花朵揮發(fā)物中被檢測到(2.42%、4.60%、6.58%)，其中在油菜相對含量最高。α-法呢烯、檸檬烯可能導致了蜜蜂的訪花偏愛性。在對牧草盲蝽Lyguspratensis觸角電位測試中發(fā)現(xiàn)，對芳樟醇等成分反應明顯(Williamsetal.,2010)。茶樹花Camelliasinensis、茶樹鮮葉的α-法呢烯、芳樟醇、石竹烯對中華蜜蜂有顯著引誘作用(蔣世雄等,2019)。3種梨花中，巴梨揮發(fā)性物質(zhì)中含有芳樟醇(4.43%)，猜測芳樟醇的存在可能是巴梨的訪花蜜蜂數(shù)量、訪花頻率高于碭山酥梨的原因之一。石竹烯單獨和加入性誘劑中均表現(xiàn)對黏蟲的引誘作用(吳國火等，2020)。4種植物的花朵揮發(fā)性物質(zhì)檢測，只在油菜中檢測到石竹烯相對含量為8.67%，可能對蜜蜂產(chǎn)生引誘作用。

本研究通過開展蜜蜂訪花偏愛性試驗，表明蜜蜂對不同品種梨樹和同花期競爭植物油菜的訪花偏愛性有差異，油菜的存在會導致蜜蜂對梨花的訪花積極性下降；通過檢測不同品種梨樹和同花期競爭植物的花蜜含糖量、花粉中氨基酸含量和組分、揮發(fā)性物質(zhì)，結合本研究的蜜蜂訪花偏愛性試驗，蜜蜂偏愛采集巴梨，表明蜜蜂可能更愛探訪花蜜中蔗糖含量低或花粉中Cys含量高或Lys含量低的植物；蜜蜂喜歡探訪油菜，可能與油菜花粉中的Arg含量低有關；蜜蜂不偏愛采集碭山酥梨可能與萜烯類、檸檬烯、芳樟醇、石竹烯等物質(zhì)在揮發(fā)性物質(zhì)中的相對含量影響到訪花偏愛性，當周圍存在蜜蜂偏愛采集的植物時，降低了對碭山酥梨的訪花積極性。這將為下一步利用花朵特征誘導蜜蜂為梨樹授粉提供理論參考。