翟穎妍，袁冬貞，趙世磊，白應(yīng)文，陳志杰，錢 豐，朱陵俠，洪 波*

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，西安 710043；2.陜西省植物保護工作總站，西安 710003；3.商洛市植保植檢站，陜西商洛 726000；4.寶雞市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，陜西寶雞 721001；5.咸陽市植物檢疫站，陜西咸陽 712000；6.安康市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西安康 725000)

草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaJ.E.Smith又稱秋黏蟲，為鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾屬Spodoptera害蟲(冼繼東等,2019)。該蟲廣泛分布在美洲熱帶及亞熱帶地區(qū)，具有很強的繁殖力及遷飛能力(Sparksetal.,1979)。草地貪夜蛾是世界范圍的重大農(nóng)業(yè)害蟲，幼蟲喜食玉米ZeamaysL.，據(jù)統(tǒng)計在美國佛羅里達州造成玉米減產(chǎn)20%(Earlyetal.,2018)，嚴(yán)重威脅糧食安全。草地貪夜蛾于2016年1月入侵非洲，2年內(nèi)擴散至非洲44個國家，年潛在經(jīng)濟損失超過24億美元，2018年7月首次在亞洲也門出現(xiàn)，2019年1月遷飛至我國云南省境內(nèi)(Sunetal.,2019;王磊等,2019a)，截止2020年10月，草地貪夜蛾最北已發(fā)現(xiàn)擴散至遼寧省(張丹等,2021)。陜西省內(nèi)最早在2019年5月于漢中市洋縣發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾幼蟲(余正軍等,2020)。草地貪夜蛾入侵速度之快及取食范圍之廣，給我國糧食及生態(tài)安全帶來了嚴(yán)重威脅，給草地貪夜蛾的綜合防治帶來了更大的挑戰(zhàn)。

準(zhǔn)確識別并快速鑒定入侵生物是研究防控策略首要的一步。根據(jù)寄主不同，草地貪夜蛾有玉米型(corn-strain)和水稻型(rice-strain)兩種生物型(Nagoshietal.,2004)，在取食、交配及抗藥性等方面存在較大差異，這兩種生物型樣本靠形態(tài)學(xué)方法無法區(qū)分，目前多使用分子生物學(xué)的手段進行鑒定。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因(Cytochrome coxidase subunit I，COI)和位于Z染色體的磷酸甘油醛異構(gòu)酶基因(Triose-phosphate isomerase,Tpi)是當(dāng)前使用最廣泛的分子標(biāo)記基因(趙金鳳等,2020)。COI基因位于線粒體，受母系遺傳的影響，而Tpi基因位于細(xì)胞核，更具穩(wěn)定性(Nagoshietal.,2016)，因此多將COI和Tpi兩種分子標(biāo)記結(jié)合起來進行鑒定并相互驗證，有利于提高鑒定的準(zhǔn)確性。

本研究采集了陜西省8個地市共計180個草地貪夜蛾樣本，通過擴增COI及Tpi兩個基因片段，在分子水平對入侵陜西的草地貪夜蛾進行鑒定并分析其種群生物型分子特征，以期為研究陜西省草地貪夜蛾的發(fā)生和擴散規(guī)律,以及草地貪夜蛾的監(jiān)測及綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx的采集

本研究的草地貪夜蛾樣本由陜西省8個地市的農(nóng)技中心或植保站提供，采集時間為2020年和2021年7-9月(表1)。幼蟲在田間采集后浸泡于無水乙醇，成蟲使用性誘劑捕獲后干燥處理，樣本帶回實驗室后儲存在-80℃低溫冰箱備用。

表1 供試樣本采集信息Table 1 Information of samples collection

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

切取草地貪夜蛾單頭幼蟲或成蟲的頭部置于1.5 mL離心管內(nèi)，用TGrinder電動組織研磨器(OSE-Y30，天根)在液氮中研磨充分，使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304-02，天根)，按照說明書進行DNA提取，得到的DNA作為PCR擴增模板。

分別使用COI及Tpi引物(Nagoshietal.,2017b;陳冬平等,2020)對草地貪夜蛾DNA進行PCR擴增(表2)。20 μL PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，Mix 10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃(COI)/52℃(Tpi)退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)，72℃終延伸10 min，4℃保存。擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表2 PCR擴增的引物信息Table 2 Primers used for PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用DNAstar軟件查看每個樣本測序序列的峰圖并進行正反向序列的拼接和校正，獲得準(zhǔn)確的基因片段序列。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)草地貪夜蛾COI及Tpi基因序列，與本研究得到的序列在MEGA 6.0中進行ClustalW多重序列比對及差異位點分析(Tamuraetal.,2013)，確定本研究中草地貪夜蛾樣本的生物型。選取代表性樣本序列，使用MEGA 6.0采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(張麗娜等,2013)，設(shè)bootstrap值為1 000進行計算，構(gòu)建完成的系統(tǒng)發(fā)育樹在FigTree 1.4中進行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾 COI及 Tpi基因的擴增

對采集的草地貪夜蛾樣本經(jīng)過DNA提取和PCR擴增及測序，獲得了180個COI基因片段及179個Tpi基因片段(商洛SL-28的PCR產(chǎn)物沒有被擴增出來)，COI基因片段長度約為450 bp，Tpi基因片段長度約為400 bp(圖1)。

圖1 部分PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of partial PCR products注：A，COI基因；B，Tpi基因；M，DL2000 DNA Marker。Note:A,COI gene;B,Tpi gene;M,DL2000 DNA Marker.

2.2 COI單倍型分析

在草地貪夜蛾COI基因的第225和348位點處，水稻型對應(yīng)的堿基為TA，玉米型有4種單倍型h1，h2，h3和h4，對應(yīng)的堿基分別為：AA，AG，GA和GG(Nagoshietal.,2017a)(圖2)?；贑OI分子標(biāo)記的分析結(jié)果表明，180個樣本中COI基因在這兩處位點的堿基序列有2種：TA和GG，即分別為水稻型和h4玉米型，其中水稻型(如樣本SL-1)有152個，占比為84.44%，水稻型遠(yuǎn)多于玉米型，樣本分布涵蓋所有8個地市；h4玉米型(如樣本XY-1)有28個樣本，占比為15.56%，樣本分布僅6個地市。其中每個地市玉米型占當(dāng)?shù)貥颖玖康谋壤煌?表3)，渭南及商洛未發(fā)現(xiàn)玉米型。

表3 基于 COI基因的玉米型占當(dāng)?shù)乜倶颖玖康陌俜直菷ig.3 Corn strain as percentage of the total sample based on COI gene markers

圖2 COI基因玉米型和水稻型的單倍型比較Fig.2 Comparison of haplotypes of COI gene fragments between corn-strain and rice-strain

由于本研究樣本中歸為同種單倍型的序列高度一致，因此僅使用SL-1和XY-1樣本為代表，與NCBI數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果高度相似的序列一同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。SL-1和水稻型聚為一類，與印度MZ377096、我國云南MN068212及澳大利亞MW454868種群接近，XY-1和玉米單倍型聚為一類，與美國佛羅里達州CS-h4玉米型JN573290及印度MN615267種群一致(圖3)。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于COI基因分子標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig.3 NJ Phylogenetic tree based on COI gene fragments (1 000 replicates)注：JN573287、JN573288、JN573289、JN573290均采集自美國佛羅里達州(Nagoshi et al.,2007)，分別表示玉米型的4種單倍型，即CS-h1、CS-h2、CS-h3和CS-h4。Note:JN573287,JN573288,JN573289,and JN573290 were all identified from Florida,US (Nagoshi et al.,2007),and represented 4 haplotypes of corn-strain:CS-h1,CS-h2,CS-h3,and CS-h4,respectively.

2.3 Tpi 單倍型分析

草地貪夜蛾Tpi基因的位點136/137處，水稻型對應(yīng)的堿基為TC，玉米型對應(yīng)的堿基為CT；在位點125/126處，水稻型和玉米型對應(yīng)的堿基分別為GA和AT(Nagoshi,2010)(圖4)。另還有一種特殊的單倍型，有多個多態(tài)性位點(圖4)，是一種非洲特異型ASH(Africa-specific haplotype)(Zhangetal.,2020)。

圖4 基于Tpi基因的不同單倍型差異位點比較Fig.4 Comparison of different haplotypes of Tpi gene fragments注：黑色粗箭頭表示區(qū)分水稻型和玉米型的位點(136/137位點是區(qū)分水稻型和玉米型的主要位點)，黑色細(xì)箭頭表示區(qū)分樣本中其他單倍型的位點；紅色箭頭表示非洲特異型的差異位點。Note:The bold black arrows indicated the loci used to identify R-strain and C-strain of fall armyworm (P136/137 were considered to be an effective diagnostic marker).The thin black arrows indicated the loci to distinguish other haplotypes.The red arrows indicated the loci specific to Africa-specific haplotype.

本研究共擴增出179個Tpi基因序列，在位點136/137處，179個樣本的堿基均為CT排列；在位點125/126處，排列為AT的有164個樣本(如樣本XY-1)，排列為GA的有13個樣本(如樣本BJ-2)，排列為AT/GA雜合型的有2個樣本，為YL-2和BJ-8。而商洛樣本SL-3的多態(tài)性位點堿基排列與ASH一致，因此SL-3為非洲特異單倍型。

根據(jù)序列比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)179個樣本中有6種單倍型(圖4)，分別使用XY-1、BJ-2、SL-1、WN-3、BJ-8和SL-3這6個樣本作為代表，與NCBI數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果高度相似的序列一同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。XY-1、SL-1、BJ-2、BJ-8和WN-3均與美國佛羅里達州玉米型KT336237聚為同一大類，這5個樣本均為玉米型。而SL-3與非洲特異單倍型MT767445聚為一類，同源性達100%，該樣本序列來自廣東湛江，且被鑒定為與非洲贊比亞盧薩卡樣本序列一致，因此確定基于Tpi的SL-3樣本為非洲特異單倍型，該非洲特異單倍型僅國內(nèi)第2次出現(xiàn)。其他178個樣本基于Tpi分子標(biāo)記均鑒定為玉米型，沒有樣本與美國佛羅里達州水稻型KT336235聚為同一大類(圖5)。

圖5 鄰接法構(gòu)建的基于Tpi基因分子標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig.5 NJ Phylogenetic tree based on Tpi gene fragments (1 000 replicates)

3 結(jié)論與討論

本研究對入侵陜西省關(guān)中、陜南和陜北8個地市的180個草地貪夜蛾樣本進行了生物型分析?；贑OI分子標(biāo)記的結(jié)果表明，180個樣本中水稻型占比為84.44%，h4玉米型占比為15.56%，8個地市均有水稻型，而安康、漢中、咸陽、西安、寶雞、榆林6市出現(xiàn)了玉米型，雖然玉米型在樣本中占比少但分布很廣泛；而樣本中水稻型多于玉米型的結(jié)果表明在我國水稻型的雌成蟲在生存及交配中占據(jù)優(yōu)勢地位?；赥pi的分子標(biāo)記結(jié)果表明，陜西省內(nèi)的179個樣本除商洛SL-3為非洲特異單倍型外，其余均為玉米型，無水稻型。因此基于COI分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果為約84%的樣本為水稻型，而基于Tpi分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果為幾乎所有的樣本為玉米型，這兩種分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果不一致的情況也出現(xiàn)在其他研究中(唐運林等,2019;徐麗娜等,2019;張磊等,2019;王佳麗等,2020;趙金鳳等,2020)。由于水稻型和玉米型的草地貪夜蛾之間不存在生殖隔離(Dumasetal.,2015)，在自然界中存在兩種生物型的雜交種，另外COI分子標(biāo)記有細(xì)胞質(zhì)遺傳特點，母本基因遺傳給下一代，而Tpi分子標(biāo)記位于細(xì)胞核的性染色體Z中，草地貪夜蛾屬于ZW型性別決定(雌性ZW，雄性ZZ)，當(dāng)水稻型母本和玉米型父本雜交，后代獲得了水稻型線粒體的COI基因，Tpi基因則經(jīng)過長期的繁衍演化更多保留了玉米型基因，即后代攜帶水稻型線粒體基因和玉米型核基因形成了特殊的雜合玉米型草地貪夜蛾。因此，綜合COI和Tpi分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果，表明入侵陜西省的草地貪夜蛾約84%為水稻型母本與玉米型父本雜交形成的雜合玉米型草地貪夜蛾，而純玉米型草地貪夜蛾約占15%?；贑OI和Tpi分子標(biāo)記的鑒定方法可以快速區(qū)分出草地貪夜蛾樣本及其生物型，不過這種區(qū)分是不全面的，通常需要與微衛(wèi)星標(biāo)記法相結(jié)合(Pavinatoetal.,2013)，以便更全面地挖掘草地貪夜蛾的種群多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)規(guī)律。

據(jù)報道草地貪夜蛾能夠寄生的植物超過350種(Déboraetal.,2018)，目前在我國發(fā)現(xiàn)主要危害玉米、高粱Sorghumbicolor(L.) Moench和甘蔗SaccharumofficinarumL.(郭井菲等,2019)。草地貪夜蛾的遷飛性極強，再加上我國廣泛分布的并非單一的生物型，而是雜合型草地貪夜蛾，理論上具有雜交優(yōu)勢，是否對其他作物產(chǎn)生潛在危險應(yīng)當(dāng)引起重視。

值得注意的是，商洛地區(qū)還出現(xiàn)了非洲特異型樣本，除了在2019年8月廣東鎮(zhèn)江發(fā)現(xiàn)過外，在其他省市地區(qū)暫未見報道，該發(fā)現(xiàn)為草地貪夜蛾在我國東西線遷飛與擴散規(guī)律研究提供了新的參考依據(jù)(王磊等,2019b;陳輝等,2020)?；赥pi基因位點296處堿基與水稻型相同的結(jié)果(圖4)，這種非洲特異型最初被識別為水稻型(Nagoshietal.,2012)，而也有分析草地貪夜蛾的基因組SNPs發(fā)現(xiàn)，相較于水稻型SNP，該單倍型包含更多的玉米型SNP(Zhangetal.,2020)，因此該單倍型應(yīng)歸于哪種生物型目前仍有爭議，同時該非洲特異型草地貪夜蛾在取食行為及抗藥性方面是否與水稻型和玉米型存在明顯差異還有待進一步探究。

截至2021年9月，在陜西省關(guān)中地區(qū)和陜北榆林地區(qū)均發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾為害，而位于兩者之間的銅川和延安2個地市目前仍未發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾入侵，其在陜西省的種群擴散趨勢仍不明朗，需要進一步對入侵陜西省的草地貪夜蛾地理種群遺傳結(jié)構(gòu)特征進行分析，為草地貪夜蛾的監(jiān)測及防控提供理論支撐。